Este trabalho foi apoiado pelas Ciências Naturais e do Conselho de Investigação do Canadá Engenharia. Microfabricação foi realizada com o apoio da academia de McGill Nanotools Microfab na Universidade McGill e do Departamento de Eletrônica da Universidade de Carleton.

O sangue é coletado de indivíduos saudáveis ​​com a aprovação do comitê de ética da Universidade de Ottawa (H11-13-06). 1. Microchannel Fabrication Os microcanais são fabricados com base nos métodos de fotolitografia padrão 18. <ol><li> Projetar a geometria de microcanais utilizando um design de software assistida por computador (CAD) e imprimir a configuração em uma foto-máscara de transparência. Estas máscaras são cruciais, uma vez que ditam o caminho da luz durante o processo de fabricação. Neste caso, as dimensões são de microcanais 120 um de espessura, 60 mm de profundidade e 7 mm de comprimento. </li><li> Em uma sala de limpeza, revestimento de spin um epóxi negativa baseada foto-resiste em uma pastilha de silício a 2.000 rpm durante 30 segundos para obter a profundidade de microcanais desejado (60 mm). </li><li> Expor a bolacha e o foto-máscara sob uma lâmpada de UV a 650 mJ / cm 2 para 70 segundos. Assegurar a expor apenas as áreas transparentes dofoto-máscara à luz UV. A exposição das áreas transparentes permite a polimerização das cadeias, resultando em um endurecimento de foto-resist. Mergulhe a peça de silício em um desenvolvedor para remover o excesso de foto-resiste. </li><li> Uma vez que o molde é fabricado, misturar um elastómero à base de silício e um agente de cura a uma razão de 10: 1 para criar uma solução de poli-dimetil-siloxano (PDMS). Coloque a solução PDMS em uma câmara de vácuo para desgaseificar. Deite-o no molde e aquecê-la a 60 ° C durante 90 minutos para criar microcanais. Em seguida, ligar os canais individuais para uma lâmina de vidro usando bonding plasma de oxigênio durante 90 segundos. Nota: o processo de PDMS desgaseifica é realizada a fim de eliminar as bolhas de ar geradas pelo processo de mistura. </li><li> Certifique-se de que as dimensões de microcanais para permitir testes bem-sucedidos. Neste protocolo, os microcanais têm uma secção transversal rectangular de 120 x 60 mm. Em comparação, um RBC média tem um diâmetro de 8 um e uma espessura de 2 um. Oguinte, a largura de microcanais é suficiente para observar a agregação adequada e determinar com precisão os perfis de velocidade. </li></ol> 2. Preparação de Sangue <ol><li> Recolha de sangue de doadores voluntários saudáveis, após a aprovação de um comitê de ética. Tratar o sangue com ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) presente nos tubos de colheita (7,2 mg de EDTA em 4 ml de sangue). NOTA: O EDTA é utilizado para evitar a coagulação do sangue. </li><li> Centrifugar as amostras de sangue três vezes durante 10 minutos a 1400 xg (3000 rpm) de modo a separar os constituintes do sangue. Como resultado da centrifugação, observar três camadas distintas. NOTA: As três camadas são a camada de RBC (localizado na parte inferior do tubo), o creme leucocitário (consistindo de glóbulos brancos e de plaquetas localizados no topo da camada de glóbulos vermelhos) e a camada de plasma (localizado na parte superior de todas as outras constituintes). <ol><li> Depois da primeira centrifugação, recolher o plasma sanguíneo, utilizando uma pipeta de sangue. Evite qualquer contato com o creme leucocitário. </li><li> Recolha e descarte o creme leucocitário em um recipiente com água sanitária diluída em 10%. </li><li> Adicionar 3 ml de PBS, pH 7,4 a cada um dos tubos com a camada de glóbulos vermelhos restantes e assegurar um equilíbrio adequado do centrifugador. Misturar suavemente os tubos e centrifugar uma vez a 1400 x g (3000 rpm) durante 10 min. NOTA: Certifique-se de que a solução PBS não contém qualquer magnésio ou de cálcio, uma vez que poderia alterar a adesão celular. </li><li> Descarte o PBS nos tubos após a segunda centrifugação e remover o creme leucocitário restante se presente. Repita os passos 2.2.3 e 2.2.4 para a terceira centrifugação para produzir hemácias limpas. </li></ol></li><li> Misturar a quantidade requerida (0,05, 0,1 e 0,15 mL) dos GVs limpas com plasma (0,95, 0,9 e 0,85 mL) num tubo de 1 ml, a fim de obter suspensões com RBC-a correspondente (5%, 10% e 15% ) hematócrito. Verifique hematócritos com uma microcentrífuga. </li></ol> 3. Fluidos Preparação <ol><li> Adicionar 60 ul da solução de partículas de marcador fluorescente (1% sólido, d partícula = 0. 86 uM, λ abs = 542 nm e λ emissão = 612 nm) para os tubos de 1 ml RBC-suspensão. NOTA: As partículas de marcador fluorescente (internamente tingidos partículas de poliestireno) são usados ​​para medir a velocidade do fluxo no interior do microcanal. Estas partículas fluorescem quando expostos ao comprimento de onda correspondente do feixe de laser (λ = 542 nm). </li><li> Prepara-se uma solução de PBS de pH 7,4 e adicionar 60 uL da mesma solução de partículas de traçador fluorescente em 1 ml de solução de PBS. </li></ol> 4. Agregados Tamanho Medidas <ol><li> Para inserir os fluidos (suspensões e RBC-PBS), no microcanal, utilizar duas seringas de vidro de 25 uL e 100 uL. Isso vaiajudar a reduzir a conformidade do sistema. Ligue os microcanais para as seringas através de tubos e conectores enquadrem nas orifícios de entrada. Encha as seringas de vidro utilizando a diferença de pressão existente entre o recipiente de fluido e a seringa. Assegurar não há bolhas de ar no sistema. Como um método alternativo, utilizar um sistema de pressão controlado para conduzir os dois fluidos no microcanal. </li><li> Coloque o microcanal em um palco microscópio invertido conectado a uma câmera de alta velocidade e um sistema μPIV. Programa da bomba de seringa para as taxas de fluxo desejados (por exemplo, Q = 2 l / h para o sangue gerando um caudal de Q = 8 l / h para PBS). NOTA: Somente uma bomba de seringa é utilizada. Usando duas seringas de vidro diferentes, com dois diâmetros internos diferentes, é possível fazer variar o caudal a que entra em cada ramo do Y-microcanal. </li><li> Insira ambos os fluidos no duplo Y-microcanais cada lado, de uma filial de entrada diferente e em diferentes vazões, como mostrado na <strong&gt; Figura 1. A fim de testar a diferentes taxas de cisalhamento, mudar o caudal da bomba. Isto mantém a mesma proporção apropriada (4, neste caso) entre os dois ramos 19 (Figuras 2 e 3). Aguarde até que o fluxo para atingir o estado estacionário antes de adquirir as medições: inspecionar visualmente as imagens da câmara de alta velocidade para um fluxo suave. Observação: A razão é importante na obtenção de um perfil de velocidade linear no interior da camada de sangue. </li><li> Visualize as hemácias utilizando a câmera de alta velocidade. Ligue a câmara a um computador para controlar, registrar e guardar as imagens do fluxo de fluido. Uma vez que os dois fluxos de fluido atingir o estado estacionário, iniciar a gravação. <ol><li> Adquirir várias imagens para obter melhores resultados de processamento. Determinar um tempo de exposição da câmara óptima para uma imagem clara dos agregados. NOTA: O tempo de exposição da câmara para este caso foi de 0,5 ms. A escolha do intervalo de tempo entre cada trama baseia-se na taxa de quadros da câmara e a velocidade de fluxo em tele microcanais. O tempo entre cada quadro processado neste procedimento foi de 60 mseg. Por conseguinte, uma câmara capaz de gravar 18 quadros por segundo é suficiente. NOTA: Evite a sedimentação de sangue no tubo e seringa, que poderia levar a medições erradas. </li></ol></li><li> Utilizando técnicas de processamento de imagens (um programa em Matlab, neste caso) para melhorar a qualidade da imagem, detectar os agregados em cada uma das imagens com base em intensidades de pixel (ilustrada na Figura 4) como se segue: <ol><li> Melhorar as imagens de contraste utilizando o método do histograma equalizador para se obter uma melhor qualidade de imagem para cada quadro. </li><li> Converta as imagens em tons de cinza em imagens binárias. Para este efeito, estabelecer um valor limite, que varia de 0 a 1, que determina a conversão de cada pixel. Qualquer pixel na imagem abaixo do valor limiar será detectado como um pixel preto, enquanto os pixels com valores maiores do que o limiar será detectado como pixels brancos. </li><li> Encha ofuros (se presente e necessário) correspondentes para as lacunas dentro de um agregado para obter melhores resultados. </li><li> Detectar as células por determinação pixels brancos vizinhos na imagem binária, de modo que as células adjacentes são associados na forma de agregados. </li><li> Rotular os diferentes agregados detectados e converter a imagem binária em uma imagem de vermelho-verde-azul (RGB) para melhor visualização. Combinam-se as imagens de origem com cada uma das imagens processadas correspondentes para verificar a eficiência da técnica de processamento de imagem e assegurar que todas as células são tomadas em consideração, como mostrado na Figura 5. Execute passos 4.5.1, 4.5.2, 4.5.3 , 4.5.4 e 4.5.5 para todos os quadros capturados. </li><li> Calcula-se a área de cada agregado detectado no quadro com base no número de pixels detectados. Com base na lente de ampliação usado, calcula o factor de conversão, usando uma retícula de calibração, e os resultados para converter 2 uM. Calcular a média dos tamanhos agregadas detectadas em cadaquadro e, em seguida, calcular a média dos resultados para todos os quadros para se obter o tamanho médio do agregado para cada gravação de RBC-suspensões. </li><li> Calcula-se a área de uma RBC para determinar um número representativo estimado de RBCs, em cada agregado detectado. Usando estes resultados, o cálculo da distribuição da percentagem de glóbulos vermelhos, em cada agregado como uma função dos tamanhos de agregado (representadas pelo número estimado de células em cada agregado), como mostrado na Figura 6. NOTA: Para medir os agregados RBC, software ImageJ poderia ser utilizado (em vez de MATLAB) para executar as mesmas tarefas em cada quadro. </li></ol></li></ol> 5. velocidade do fluido e cisalhamento Taxa de Medidas Determinar a velocidade do fluido e, portanto, a taxa de corte usando um sistema μPIV. <ol><li> Uma vez que os dados são adquiridos utilizando a câmera de alta velocidade, mudar para a câmera pulsado duplo usado para o sistema μPIV. Use um software de imagem para imagem acaqui- do fluxo do processamento de imagem e para a determinação de campo de velocidade. </li><li> Tomar todas as precauções necessárias, dependendo da classe do laser, antes de ligar o laser. Em seguida, ligar o sistema, a câmara eo laser. </li><li> Calibrar a câmara com base na ampliação da lente utilizada. Para esta finalidade, utilizar uma microescala de 10 um a precisão sob o microscópio e definir o tamanho de um pixel na imagem. </li><li> Iniciar o laser e visualizar as partículas em ambos os fluidos. Encontre o plano médio dos microcanais, concentrando-se sobre as partículas mais rápidas no fluxo (isto é, as partículas mais rápidas deve ser o mais brilhante). </li><li> Definir a DT (intervalo de tempo entre dois quadros consecutivos) para assegurar o deslocamento correcto da partícula. As partículas mais rápidas deve mover-se cerca de 5 a 10 pixels entre ambas as imagens. </li><li> Comece a gravar o fluxo. Defina o software para adquirir 100 pares de imagens, 5 ms de intervalo. Realize os passos 5.4, 5.5 e 5.6 para todo o difrentes RBC-suspensões e para diferentes taxas de cisalhamento. NOTA: Mais detalhes da metodologia são apresentados no estudo de Pitts e Fenech 20. </li><li> Processe as gravações adquiridos utilizando o método de correlação cruzada com o software de imagem. NOTA: Este consiste em discretizar o par de imagens em pequenas janelas de tamanho pré-determinado (com base no fluxo de fluido e o intervalo de tempo escolhido pelo utilizador) chamado janelas de correlação e seguindo o deslocamento das partículas em cada janela. <ol><li> Em primeiro lugar, determinar se as imagens obtidas requerem pré-tratamento (incluindo a subtração de fundo, &quot;base-grampeamento&quot; 21 ou imagem sobreposição 22,23) para um melhor processamento de dados. </li><li> Em seguida, escolha o tamanho da janela de correlação e forma, bem como da percentagem de imagens sobrepostas. Um estudo detalhado foi realizada por Pitts et al. 24, para determinar os parâmetros óptimos e técnicas de pré-processamento de imagem para sanguefluir em diferentes configurações de canal. Exprimir os resultados em um campo de velocidade média calculada a partir dos pares de imagem e 100 o erro Root Mean Square (RMS) na velocidade. </li></ol></li><li> Extrair um perfil de velocidade à saída do canal, a partir dos dados tratados, como mostrado na Figura 7. Para uma melhor perfil, a média do campo de velocidades no espaço. NOTA: As barras que constituem o perfil de velocidade corresponde ao tamanho da janela de correlação escolhidos em relação à largura do canal. O erro RMS da velocidade também é mostrado na Figura 7, que representa o erro na estimativa de velocidade experimental. </li><li> Desligue o laser uma vez que todas as medidas e processamento são executados ,. Desligue todos os componentes do sistema: software, câmeras, fase em movimento, computadores e laser. </li><li> Para calcular a velocidade de corte, primeira detectar e calcular a espessura de sangue nos microcanais com base na câmara de gravação de alta velocidade. Para este efeito, em média todosos quadros no registo específico para obter uma imagem de vídeo de fundo. Delimitar a camada de sangue (como mostrado na Figura 8 para as RBC-suspensões fluidas em 10 ul / h, quando suspenso em 5%, 10% e 15% hematócrito). Obter o valor de velocidade para a espessura da camada de sangue correspondente e calcular a velocidade de corte através da divisão do valor da velocidade por a espessura da camada de sangue. </li></ol>

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Os autores não têm nada a revelar.

Utilizando a presente metodologia, é possível analisar, qualitativamente e quantitativamente, o RBC agrega sob diferentes condições de fluxo e hematócritos. Para os testes de detecção de agregados e bem sucedida, é crucial para determinar a relação da velocidade adequada entre os dois fluidos com a entrada de microcanais. Esta relação é muito importante para se obter uma espessura de camada de sangue ideal onde o perfil de velocidade é quase-linear 19. Outro fator fu...

An erratum was issue for <a href="http://www.jove.com/video/52719">Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation</a>. The introduction section was updated.

An erratum was issued for <a href="http://www.jove.com/video/52719">Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation</a>. The introduction section was updated.

Erratum: Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation

As células vermelhas do sangue (RBC) desempenham um papel crucial na determinação do comportamento reológico de sangue. Eles são quase singularmente responsável pelas propriedades particulares do sangue in vitro e in vivo. Sob condições fisiológicas, os glóbulos vermelhos ocupar 40% a 45% do volume de sangue. Na microcirculação, hemácias só ocupam até 20% do volume de sangue devido ao diâmetro dos vasos menores e o plasma efeito uma desnatação. Este fenómeno de redução de plasma na microcirculação é conhecido como o efeito Fåhraeus. Em baixas velocidades de corte, os glóbulos vermelhos são capazes de transpor em conjunto e formam um dimensional ou estruturas tridimensionais chamados &quot;rouleaux&quot; ou agregados, por conseguinte, contribuir para o comportamento não newtoniano do sangue. No entanto, o mecanismo de agregação de RBC não é completamente compreendido. Existem duas teorias para modelar a agregação de hemácias: a ponte da teoria células devido à ligação cruzada das macromoléculas 2 ea atrac vigorteoria ção provocada pela depleção das moléculas, devido ao gradiente osmótico 3. Tipicamente, para o sangue humano, formar agregados com taxas de corte muito baixos 4 variando de 1 a 10 s -1. Acima dessa faixa, hemácias tendem a desagregar e fluxo separadamente dentro do vaso. Compreender as condições da formação de agregados é de uma grande importância para o campo hemorreologia em termos de definir o comportamento reológico de sangue. Estes agregados são muitas vezes vistos a nível macrocirculação (&gt; 300 mm de diâmetro) 5. Nesta escala, o sangue é considerado como um fluido Newtoniano e de uma mistura homogénea. No entanto, estes agregados são raros no nível capilar (4-10 um de diâmetro) e são geralmente uma indicação de condições patológicas tais como a diabetes e a obesidade 6. Outras condições patológicas que poderiam mudar a agregação RBC incluem condições inflamatórias ou infecciosas,doenças cardiovasculares, como hipertensão ou aterosclerose, doenças genéticas e doenças crônicas 7. Portanto, a compreensão do mecanismo de agregação de glóbulos vermelhos e analisando estas entidades (por definição de uma relação entre o tamanho destes agregados e as condições de fluxo) pode conduzir à compreensão do comportamento microrheological de sangue e, portanto, relacioná-la com aplicações clínicas. Agregados RBC pode ser alterada por vários factores tais como o hematócrito (volume de glóbulos vermelhos no sangue), a taxa de cisalhamento, o diâmetro do vaso, a rigidez da membrana de RBC e a composição do meio de suspensão 8-10. Por conseguinte, são necessárias condições controladas, a fim de analisar de forma eficaz os agregados de RBC. Vários métodos são capazes de analisar a formação de agregados, fornecendo medições de agregação estáticos (índice de agregação) que oferece informações relevantes sobre o comportamento do sangue. Estes métodos incluem, inter alia, a taxa de sedimentação de eritrócitos11 método, o método de transmissão de luz de 12, o método de reflexão de luz 13 e o método de baixa viscosidade de cisalhamento 14. Poucos estudos tentaram estudar a agregação de RBC e determinar o grau de agregação em condições de fluxo controladas 15-17. No entanto, estes estudos indirectamente investigar RBC tamanhos de agregados por meio da determinação da relação entre o espaço ocupado em um sistema de corte medida com base em imagens microscópicas sanguíneos que fornecem informação sobre o grau de agregação, bem como a viscosidade local. Nós, portanto, apresentar um novo procedimento para quantificar directamente RBC agrega na microcirculação, de forma dinâmica, com taxas de corte controlado e constante. Rbc suspensões são arrastadas, num duplo Y-microcanal (tal como ilustrado na Figura 1), com uma solução salina tamponada com fosfato (PBS), criando assim um fluxo de cisalhamento na camada de sangue. Dentro desse sangue camada uma constante de karitétaxa R pode ser obtido. Os RBC-suspensões são testados em hematócrito diferentes (H) níveis (5%, 10% e 15%) e sob taxas de deformação diferentes (2-11 seg -1). A velocidade do sangue e velocidade de cisalhamento são determinados usando um sistema de micro partículas velocimetria de imagens (μPIV), enquanto que o fluxo é visualizada utilizando uma câmara de alta velocidade. Os resultados obtidos são, então, processados ​​com um código MATLAB com base nas intensidades de imagem, a fim de detectar as hemácias e determinar os tamanhos de agregados.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>SU8-50 epoxy based negative Photo-resist</td>
			<td>MicroChem Corp.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU8-50 developer</td>
			<td>MicroChem Corp.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(dimethylsiloxane) (PDMS) Sylgard-184</td>
			<td>Dow-Corning</td>
			<td>3097358-1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-50 series Plasma system&#160;</td>
			<td>Plasma Etch</td>
			<td>PE-50 series</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood collection tubes with K2 EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)</td>
			<td>FisherSci</td>
			<td>B367861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge, i.e. Thermo Scientific CL2</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>004260F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poshpate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5368-10PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tracer fluorescent particles solution (15 mL)</td>
			<td>FisherSci</td>
			<td>R800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aggregometer</td>
			<td>RheoMeditech</td>
			<td>Rheo Scan AnD300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass syringes (50 &#181;L)</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing (Tygon)</td>
			<td>FisherSci</td>
			<td>AAA00001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High speed camera (Basler)</td>
			<td>Graftek Imaging Inc.</td>
			<td>basler acA2000-340km</td>
			<td>A camera capable of recording 18 frames per seconds could be used.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double pulsed camera&#160;</td>
			<td>LaVision</td>
			<td>Imager Intense</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope MITAS</td>
			<td>LaVision</td>
			<td>MITAS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nd:YAG laser</td>
			<td>New Wave Research</td>
			<td>Solo-II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump (Nexus3000 and PicoPlus)</td>
			<td>Chemyx Inc. and Harvard Apparatus</td>
			<td>Nexus3000 and PicoPlus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DaVis software</td>
			<td>LaVision</td>
			<td>Davis</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

controlled microfluidic environment for dynamic investigation of red blood cell aggregation

O sangue, como biofluid não-newtoniano, representa o foco de numerosos estudos no campo hemorreologia. Constituintes do sangue incluem os glóbulos vermelhos, glóbulos brancos e plaquetas, que são suspensos em plasma sanguíneo. Devido à abundância das hemácias (40% a 45% do volume do sangue), o seu comportamento dita o comportamento reológico de sangue especialmente na microcirculação. Com taxas de corte muito baixos, hemácias são vistos de montar e entidades de formulário chamado agregados, o que faz com que o comportamento não-newtoniano de sangue. É importante compreender as condições da formação de agregados de compreender a reologia do sangue na microcirculação. O protocolo aqui descrito detalhes do procedimento experimental para determinar quantitativamente os agregados de RBC na microcirculação sob velocidade de cisalhamento constante, com base no processamento de imagem. Para este efeito, RBC-suspensões são testadas e analisadas em microcanais 120 x 60 mm de poli-dimetil-siloxano (PDMS). As suspensões são RBC-entchover usando um segundo fluido, a fim de obter um perfil de velocidade linear no interior da camada de sangue e, assim, obter uma grande gama de velocidades de cisalhamento constante. A velocidade de corte é determinada usando um sistema de micro partículas velocimetria de imagens (μPIV), enquanto agregados RBC são visualizados utilizando uma câmara de alta velocidade. Os vídeos capturados dos agregados RBC são analisados ​​usando técnicas de processamento de imagem, a fim de determinar os tamanhos de agregados com base nas intensidades de imagens.

Um exemplo do fluxo de dois fluidos no duplo Y-microcanal é mostrado na Figura 2 para os glóbulos vermelhos humanos suspensos em 5%, 10% e 15% de hematócrito e fluindo a 10 ul / h. A Figura 3 mostra a diferença no tamanho dos agregados quando o fluxo no canal é reduzido de 10 l / h a 5 uL / ​​hr de um hematócrito de 10%. Isto dá uma noção qualitativa dos tamanhos dos agregados ao variar o hematócrito e da taxa de cisalhamento. A Figura 5 segue o deslocamen...

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Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation

O protocolo descrito detalhes um procedimento experimental para quantificar glóbulos vermelhos (RBC) agregados sob uma velocidade de corte constante e controlado, com base em técnicas de processamento de imagem. O objetivo deste protocolo é relacionar RBC tamanhos agregados à taxa de corte correspondente em um ambiente controlado microfluídico.

Ambiente Microfluidic controlada de Investigação dinâmico de Agregação Glóbulo Vermelho

Blood, as a non-Newtonian biofluid, represents the focus of numerous studies in the hemorheology field. Blood constituents include red blood cells, white ...

controlled-microfluidic-environment-for-dynamic-investigation-red

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.7K visualizações.  University of Ottawa.  O protocolo descrito detalhes um procedimento experimental para quantificar glóbulos vermelhos (RBC) agregados sob uma velocidade de corte constante e controlado, com base em técnicas de processamento de imagem. O objetivo deste protocolo é relacionar RBC tamanhos agregados à taxa de corte correspondente em um ambiente controlado microfluídico. 

Vídeo: Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation

Microfabricated Platforms for Mechanically Dynamic Cell Culture

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or fundamental cell biology studies is limited by current bioreactor technologies, which cannot simultaneously apply a variety of mechanical stimuli to cultured cells. In order to address this issue, we have developed a series of microfabricated platforms designed to screen for the effects of mechanical stimuli in a high-throughput format. In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and further demonstrate how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

Plataformas microfabricated para cultura de células mecanicamente dinâmico

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or ...

Bioengenharia

Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, direct visualization of individual viral complexes in their host cellular environment with cryoET is challenging2, due to the infrequent and dynamic nature of viral entry, particularly in the case of HIV-1. While time-lapse live-cell imaging has yielded a great deal of information about many aspects of the life cycle of HIV-13-7, the resolution afforded by live-cell microscopy is limited (~ 200 nm). Our work was aimed at developing a correlation method that permits direct visualization of early events of HIV-1 infection by combining live-cell fluorescent light microscopy, cryo-fluorescent microscopy, and cryoET. In this manner, live-cell and cryo-fluorescent signals can be used to accurately guide the sampling in cryoET. Furthermore, structural information obtained from cryoET can be complemented with the dynamic functional data gained through live-cell imaging of fluorescent labeled target.
In this video article, we provide detailed methods and protocols for structural investigation of HIV-1 and host-cell interactions using 3D correlative high-speed live-cell imaging and high-resolution cryoET structural analysis. HeLa cells infected with HIV-1 particles were characterized first by confocal live-cell microscopy, and the region containing the same viral particle was then analyzed by cryo-electron tomography for 3D structural details. The correlation between two sets of imaging data, optical imaging and electron imaging, was achieved using a home-built cryo-fluorescence light microscopy stage. The approach detailed here will be valuable, not only for study of virus-host cell interactions, but also for broader applications in cell biology, such as cell signaling, membrane receptor trafficking, and many other dynamic cellular processes.

We describe a correlative microscopy method that combines high-speed 3D live-cell fluorescent light microscopy and high-resolution cryo-electron tomography. We demonstrate the capability of the correlative method by imaging dynamic, small HIV-1 particles interacting with host HeLa cells.

Microscopia correlativo para Análise Estrutural 3D de interações dinâmicas

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, ...

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has been implied in the etiology of many brain pathologies, creating a need for development of human in vitro BBB models to assist in clinically-relevant research. Among the numerous BBB models thus far described, a static (without flow), contact BBB model, where astrocytes and brain endothelial cells (BECs) are cocultured on the opposite sides of a porous membrane, emerged as a simplified yet authentic system to simulate the BBB with high throughput screening capacity. Nevertheless the generation of such model presents few technical challenges. Here, we describe a protocol for preparation of a contact human BBB model utilizing a novel combination of primary human BECs and immortalized human astrocytes. Specifically, we detail an innovative method for cell-seeding on inverted inserts as well as specify insert staining techniques and exemplify how we use our model for BBB-related research.

Establishment of human models of the blood-brain barrier (BBB) can benefit research into brain conditions associated with BBB failure. We describe here an improved technique for preparation of a contact BBB model, which permits coculturing of human astrocytes and brain endothelial cells on the opposite sides of a porous membrane.

Melhoria da Metodologia para a Elaboração de um baseado em celular, Contact Modelo Humano da barreira hemato-encefálica

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood

Neutrophils play an essential role in protection against infections and their numbers in the blood are frequently measured in the clinic. Higher neutrophil counts in the blood are usually an indicator of ongoing infections, while low neutrophil counts are a warning sign for higher risks for infections. To accomplish their functions, neutrophils also have to be able to move effectively from the blood where they spend most of their life, into tissues, where infections occur. Consequently, any defects in the ability of neutrophils to migrate can increase the risks for infections, even when neutrophils are present in appropriate numbers in the blood. However, measuring neutrophil migration ability in the clinic is a challenging task, which is time consuming, requires large volume of blood, and expert knowledge. To address these limitations, we designed a robust microfluidic assays for neutrophil migration, which requires a single droplet of unprocessed blood, circumvents the need for neutrophil separation, and is easy to quantify on a simple microscope. In this assay, neutrophils migrate directly from the blood droplet, through small channels, towards the source of chemoattractant. To prevent the granular flow of red blood cells through the same channels, we implemented mechanical filters with right angle turns that selectively block the advance of red blood cells. We validated the assay by comparing neutrophil migration from blood droplets collected from finger prick and venous blood. We also compared these whole blood (WB) sources with neutrophil migration from samples of purified neutrophils and found consistent speed and directionality between the three sources. This microfluidic platform will enable the study of human neutrophil migration in the clinic and the research setting to help advance our understanding of neutrophil functions in health and disease.

This protocol details an assay designed to measure human neutrophil chemotaxis from one droplet of whole blood with robust reproducibility. This approach circumvents the need for neutrophil separation and requires only a few minutes of assay preparation time. The microfluidic chip enables the repeated measure of neutrophil chemotaxis over time in infants or small mammals, where sample volume is limited.

Plataforma microfluídica para medição de quimiotaxia de neutrófilos não transformados Sangue Total

Neutrophils play an essential role in protection against infections and their numbers in the blood are frequently measured in the clinic. Higher ...

Bead Aggregation Assays for the Characterization of Putative Cell Adhesion Molecules

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions for many of these proteins are poorly understood. Here we present a simple, rapid method for characterizing the adhesive properties of putative homophilic cell adhesion molecules. Cultured HEK293 cells are transfected with DNA plasmid encoding a secreted, epitope-tagged ectodomain of a cell surface protein. Using functionalized beads specific for the epitope tag, the soluble, secreted fusion protein is captured from the culture medium. The coated beads can then be used directly in bead aggregation assays or in fluorescent bead sorting assays to test for homophilic adhesion. If desired, mutagenesis can then be used to elucidate the specific amino acids or domains required for adhesion. This assay requires only small amounts of expressed protein, does not require the production of stable cell lines, and can be accomplished in 4 days.

Here we present a simple, rapid method for characterizing the intrinsic adhesive properties of putative cell adhesion molecules. The secreted, epitope-tagged ectodomain of a cell adhesion molecule is captured from the culture medium on small, uniform functionalized beads. These beads can then be used immediately in simple bead aggregation assays.

Conta Agregação ensaios para a caracterização dos putativos Moléculas de Adesão Celular

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of (indirect) in vitro experiments, but none of these is as comprehensive as microfluidic flow chambers. In this protocol, the reconstitution of thrombocytopenic fresh blood with stored blood bank platelets is used to simulate platelet transfusion. Next, the reconstituted sample is perfused in microfluidic flow chambers which mimic hemostasis on exposed subendothelial matrix proteins. Effects of blood donation, transport, component separation, storage and pathogen inactivation can be measured in paired experimental designs. This allows reliable comparison of the impact every manipulation in blood component preparation has on hemostasis. Our results demonstrate the impact of temperature cycling, shear rates, platelet concentration and storage duration on platelet function. In conclusion, this protocol analyzes the function of blood bank platelets and this ultimately aids in optimization of the processing chain including phlebotomy, transport, component preparation, storage and transfusion.

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Platelet transfusion and hemostasis was modeled using blood reconstitution and microfluidic flow chambers to investigate the function of blood banking platelets. The data demonstrate the consequences of platelet storage lesion on hemostasis, in vitro.

Microfluídico Fluxo Chambers utilizando sangue reconstituído ao Modelo Hemostasia e transfusão de plaquetas<em&gt; In Vitro</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

Fully Automated Centrifugal Microfluidic Device for Ultrasensitive Protein Detection from Whole Blood

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is a promising method to detect small amount of proteins in biological samples. The devices providing a platform for reduced sample volume and assay time as well as full automation are required for potential use in point-of-care-diagnostics. Recently, we have demonstrated ultrasensitive detection of serum proteins, C-reactive protein (CRP) and cardiac troponin I (cTnI), utilizing a lab-on-a-disc composed of TiO2 nanofibrous (NF) mats. It showed a large dynamic range with femto molar (fM) detection sensitivity, from a small volume of whole blood in 30 min. The device consists of several components for blood separation, metering, mixing, and washing that are automated for improved sensitivity from low sample volumes. Here, in the video demonstration, we show the experimental protocols and know-how for the fabrication of NFs as well as the disc, their integration and the operation in the following order: processes for preparing TiO2 NF mat; transfer-printing of TiO2 NF mat onto the disc; surface modification for immune-reactions, disc assembly and operation; on-disc detection and representative results for immunoassay. Use of this device enables multiplexed analysis with minimal consumption of samples and reagents. Given the advantages, the device should find use in a wide variety of applications, and prove beneficial in facilitating the analysis of low abundant proteins.

This protocol demonstrates how to achieve femto molar detection sensitivity of proteins in 10 &#181;L of whole blood within 30 min. This can be achieved by using electrospun nanofibrous mats integrated in a lab-on-a-disc, which offers high surface area as well as effective mixing and washing for enhanced signal-to-noise ratio.

Totalmente dispositivo automático centrífugo microfluídicos para a detecção de proteínas Ultrasensitive de Sangue Total

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is a promising method to detect small amount of proteins in biological samples. The devices providing a platform ...

3D Magnetic Stem Cell Aggregation and Bioreactor Maturation for Cartilage Regeneration

Cartilage engineering remains a challenge due to the difficulties in creating an in vitro functional implant similar to the native tissue. An approach recently explored for the development of autologous replacements involves the differentiation of stem cells into chondrocytes. To initiate this chondrogenesis, a degree of compaction of the stem cells is required; hence, we demonstrated the feasibility of magnetically condensing cells, both within thick scaffolds and scaffold-free, using miniaturized magnetic field sources as cell attractors. This magnetic approach was also used to guide aggregate fusion and to build scaffold-free, organized, three-dimensional (3D) tissues several millimeters in size. In addition to having an enhanced size, the tissue formed by magnetic-driven fusion presented a significant increase in the expression of collagen II, and a similar trend was observed for aggrecan expression. As the native cartilage was subjected to forces that influenced its 3D structure, dynamic maturation was also performed. A bioreactor that provides mechanical stimuli was used to culture the magnetically seeded scaffolds over a 21-day period. Bioreactor maturation largely improved chondrogenesis into the cellularized scaffolds; the extracellular matrix obtained under these conditions was rich in collagen II and aggrecan. This work outlines the innovative potential of magnetic condensation of labeled stem cells and dynamic maturation in a bioreactor for improved chondrogenic differentiation, both scaffold-free and within polysaccharide scaffolds.

Chondrogenesis from stem cells requires fine tuning the culture conditions. Here, we present a magnetic approach for condensing cells, an essential step to initiate chondrogenesis. In addition, we show that dynamic maturation in a bioreactor applies mechanical stimulation to the cellular constructs and enhances cartilaginous extracellular matrix production.

3D Agregação Stem Magnetic celular e biorreator Maturação para regeneração da cartilagem

Cartilage engineering remains a challenge due to the difficulties in creating an in vitro functional implant similar to the native tissue. An approach ...

Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to entry for non-specialists who would benefit greatly from the ability to develop their own microfluidic devices to address research questions. Particularly lacking has been the open dissemination of protocols related to photolithography, a key step in the development of a replica mold for the manufacture of polydimethylsiloxane (PDMS) devices. While the fabrication of single height silicon masters has been explored extensively in literature, fabrication steps for more complicated photolithography features necessary for many interesting device functionalities (such as feature rounding to make valve structures, multi-height single-mold patterning, or high aspect ratio definition) are often not explicitly outlined. 
Here, we provide a complete protocol for making multilayer microfluidic devices with valves and complex multi-height geometries, tunable for any application. These fabrication procedures are presented in the context of a microfluidic hydrogel bead synthesizer and demonstrate the production of droplets containing polyethylene glycol (PEG diacrylate) and a photoinitiator that can be polymerized into solid beads. This protocol and accompanying discussion provide a foundation of design principles and fabrication methods that enables development of a wide variety of microfluidic devices. The details included here should allow non-specialists to design and fabricate novel devices, thereby bringing a host of recently developed technologies to their most exciting applications in biological laboratories.

Multilayer microfluidic devices often involve the fabrication of master molds with complex geometries for functionality. This article presents a complete protocol for multi-step photolithography with valves and variable height features tunable to any application. As a demonstration, we fabricate a microfluidic droplet generator capable of producing hydrogel beads.

Multi-passo fotolitografia Variável Altura para Valved multicamada microfluídicos Devices

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to ...

A Microfluidic Flow Chamber Model for Platelet Transfusion and Hemostasis Measures Platelet Deposition and Fibrin Formation in Real-time

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is restricted to platelet deposition only. The intricate relationship between Ca2+-dependent coagulation and platelet function requires careful and controlled recalcification of blood prior to analysis. Our setup uses a Y-shaped mixing channel, which supplies concentrated Ca2+/Mg2+ buffer to flowing blood just prior to perfusion, enabling rapid recalcification without sample stasis. A ten-fold difference in flow velocity between both reservoirs minimizes dilution. The recalcified blood is then perfused in a collagen-coated analysis chamber, and differential labeling permits real-time imaging of both platelet and fibrin deposition using fluorescence video microscopy. The system uses only commercially available tools, increasing the chances of standardization. Reconstitution of thrombocytopenic blood with platelets from banked concentrates furthermore models platelet transfusion, proving its use in this research domain. Exemplary data demonstrated that coagulation onset and fibrin deposition were linearly dependent on the platelet concentration, confirming the relationship between primary and secondary hemostasis in our model. In a timeframe of 16 perfusion min, contact activation did not take place, despite recalcification to normal Ca2+ and Mg2+ levels. When coagulation factor XIIa was inhibited by corn trypsin inhibitor, this time frame was even longer, indicating a considerable dynamic range in which the changes in the procoagulant nature of the platelets can be assessed. Co-immobilization of tissue factor with collagen significantly reduced the time to onset of coagulation, but not its rate. The option to study the tissue factor and/or the contact pathway increases the versatility and utility of the assay.

This paper describes an experimental model of hemostasis that simultaneously measures platelet function and coagulation. Platelet and fibrin fluorescence is measured in real-time, and platelet adhesion rate, coagulation rate, and onset of coagulation are determined. The model is used to determine platelet procoagulant properties under flow in concentrates for transfusion.

Um Modelo de Câmara Microfluidic Fluxo de transfusão de plaquetas e Hemostasia Medidas deposição de plaquetas e formação de fibrina em tempo real

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is ...