We thank the Scientific Computing and Imaging Institute of the University of Utah for use of FluoRender software (R01GM09815). This work was supported by grants from the Glaucoma Research Foundation, Melsa M. and Frank Theodore Barr Foundation and the US National Institute of Health, (R01EY020878 and R01EY023621) to M.L.V., and (R01EY017182 and R01EY017950) to B.K.A.

Imagem in vivo é realizado em instalações isentos de agentes patogénicos usando protocolos aprovados pelo Comitê Cuidado e Uso do animal Institucional na Universidade de Utah. NOTA: Este protocolo de imagem é usado para ratinhos repórter em que a microglia da retina e monócitos / macrófagos que se infiltram expressar a proteína fluorescente verde (GFP) sob o controlo do locus do receptor de fractalcina (CX3CR1). 1. In vivo de imagens de Retinal GFP + Microglia por laser confocal Ophthalmoscopy (cSLO) <ol><li> Ligue o sistema de aquecimento controlado por água, ajustado para estabilizar a temperatura rato entre 35-37 ºC durante o procedimento, e conectar duas almofadas de aquecimento. <ol><li> Inicie o sistema confocal oftalmoscópio de varredura a laser (cSLO) (Figura 2A). Abra o programa cSLO, digite as informações que irá identificar o rato individual e definir uma curvatura corneana de 2 mm (menu de Dados do Paciente). </li></ol></li><li> Prepare-se para imaGing. Firmemente caber uma lente objetiva de 55º de campo amplo limpa em seu soquete. Prepare a plataforma de imagem oftalmoscópio, garantindo uma almofada de aquecimento coberta com papel limpo. Use grampos para achatar o bloco de papel e mantê-los de bloquear o movimento da lente objectiva. </li><li> Anestesiar o rato por injecção intraperitoneal de 1,3% de 2,2,2-tribromoetanol e 0,8% de álcool terc-amílico (250 mg / kg de peso corporal; 0,5 ml / 25 g de peso corporal) com uma agulha de 30½ L equipado com um 1 ml descartável seringa. Retorno do mouse para sua gaiola, mantidos sobre uma almofada de aquecimento. NOTA: A entrega do anestésico por injecção contra inalação permite fácil posicionamento do mouse para a imagem latente eo acesso sem obstáculos aos olhos, livre de hastes e tubos. </li><li> Uma vez que o animal pára de se mover e não responde a cauda pitada, induzir a dilatação da pupila com Tropicamida e fenilefrina (0,5% cada), posicionando o animal propenso e cobrindo ambos os olhos com as gotas para 7 min. </li><li> Após 5 min, pate o mouse de bruços no centro da plataforma oftalmoscópio, e as lentes de contato se ajustar ao longo ambos os olhos, aplicando pressão mínima. NOTA: As lentes de contato são pequenos e frágeis, mas podem ser tratadas com cuidado com os dedos, embora fórceps pode ser usado em vez de 40. O uso de lentes de contato é opcional, mas recomendado, pois minimiza a secura dos olhos e preserva a transparência da córnea durante o exame. </li><li> Após 7 min, orientar o rato com o olho direito voltado para a lente objectiva e a órbita paralela à lente objectiva, mantendo o animal desenfreada perto da borda da plataforma (Figura 2B). Para a coleta de imagens de saturação e orientação comparável, manter constantemente a distância do olho para lentes objetivas, bem como o alinhamento do olho para o caminho da luz em toda sessões de imagem. Clipe longos bigodes que interferem com a observação do olho. NOTA: Para a próxima 8-10 min, o mouse não irá mover ou piscar, e vai respirar com movimento suavementos, que são rastreados pelo cSLO Eye Tracking ART modo (automático tempo real), que ajusta a posição da cabeça de digitalização com base em pontos de referência de fundo de olho com alto contraste. Passado esse tempo, os ratos começam a arfando e piscando, tornando impraticável imagem. </li><li> Se formação de imagens é realizada sem a utilização de lentes de contacto, aplicar gotas de PBS para ambos os olhos cada 2-3 min para impedi-los de secagem. </li><li> Coletar uma imagem fundo da vasculatura da retina e disco óptico, com foco na retina interna. <ol><li> Escolha do modo de infravermelhos (IR) e ajustar as configurações a 820 nm de excitação, 100% da potência do laser, 40-60% de sensibilidade (Figura 2C). </li><li> Trabalhando em modo de alta velocidade (12,6 frame / seg), localize o olho usando o joystick para conduzir o oftalmoscópio. Em baixa ampliação, inspecionar a córnea eo cristalino por lesão ou opacidade, e excluir os olhos de estudo com defeitos ou danos que afetarão imagem da retina (Figura 3A). </li><li> Localizar a área do disco óptico (a superfície dea cabeça do nervo óptico, ONH), trazendo o objectivo mais perto do olho, em seguida, centrar a imagem sobre ela e bloquear esta posição, enroscando o joystick. Este alinhamento do olho para o oftalmoscópio é a chave para obter até mesmo se concentrar e emissão através da imagem. </li><li> Visualizar os planos internos da retina, bem como o ONH, utilizando os principais vasos sanguíneos localizados na superfície vítrea da retina como um plano de referência focal (59 e 60 D), ou mais profundo (55 D) nos olhos mostrando escavado óptica discos. O foco ideal deve resolver células circulantes no sangue dentro de grandes vasos sanguíneos, com sua luz e paredes que são claramente distintos. </li><li> Otimizar saturação da imagem, ajustando a marcação do painel de controle da tela de toque, até que um halo branco de iluminação uniforme se estende na maior parte do campo 55º fundo de olho em torno do disco óptico (usando ligeira superexposição). Em seguida, abaixe a saturação para otimizar o contraste até que as células do sangue que se deslocam ao longo dos grandes vasos pode ser claramente resolvido. Se escuro focaláreas persistirem, não devido a danos na retina, realinhar o olho para a câmera até que a imagem é obtida uniformemente brilhante. Este ajustamento é fundamental para capturar reprodutíveis conjuntos de imagens em posição e qualidade. </li><li> Recolha uma imagem IR de alta-resolução da retina central (1,4-1,7 mm de diâmetro, dependendo da idade), uma média de 30 imagens em tempo real (4,7 quadros / seg; normalizado), para melhorar a relação sinal-para-ruído (Figura 2D ). </li></ol></li><li> Imediatamente, adquirir uma imagem de fluorescência de GFP + microglia e / ou infiltração de monócitos localizadas nos planos interiores da retina e a ONH. NOTA: Optimização da imagem IR fundo da retina determina a resolução da imagem de fluorescência de GFP + células, bem como a extensão da retina interna calibrados. A falta de foco nos planos internos da retina, que pode ser detectada por má resolução da vasculatura, resultará em GFP + células vistas esmaecidos (Figura 3B). A falha em ajustar IR saturação correcta e uniforme afeta a imagem de fluorescência (FA), apresentando variações de artefatos em GFP + intensidade célula e tamanho (Figura 3C). <ol><li> Swich a fluorescência modo de imagem (FA) no painel de tela sensível ao toque, usando o azul, 488 nm de excitação laser (460-490 nm conjunto filtro de barreira), e as configurações de aquisição (100% de potência do laser e 100-125% de sensibilidade), que são mantidos constante para todos os ratinhos (Figura 2E). </li><li> Coletar uma imagem bidimensional de fluorescência da retina único ponto-xy, e imediatamente capturar uma imagem de fundo de olho na posição idêntica (100x média de digitalização; 55º ângulo de leitura para ambas as imagens; Figura 2F). </li><li> Capturar uma imagem de multiponto, selecionando &quot;composto&quot; no painel de controle (Figura 2G) e movendo-se o direito oftalmoscópio e à esquerda, deslocar a retina ao longo do eixo nasal-temporal (Figura 2H). Nota: Após uma única imagem de xy ponto-digitalizar (100x spode calcular a média), o software automaticamente médias novos scans da mesma e de novas áreas (circunscritas com um círculo verde durante a digitalização ideal, ou vermelho quando a verificação é inviável), e todos os pontos-posições xy em tempo real. A imagem composta resultante abrange 1,5-1,7 mm no eixo horizontal x 3-4 mm no eixo vertical (55º x 120-124º ângulo de leitura). </li></ol></li><li> Imagem completa de cada rato dentro de 15 minutos após a indução da anestesia, antes de piscar e movimento é reiniciado. </li><li> Retirar as lentes de contato, hidrato olhos com PBS e devolver o animal para sua gaiola aquecida, verificando o comportamento até a recuperação completa da mobilidade. </li><li> Para os estudos longitudinais usando sessões intermitentes cSLO-imagem no mesmo ratinho individual, repetir imagiologia não menos de 3 dias de intervalo, para evitar a toxicidade cumulativa de anestesia, assim como a irritação da córnea. </li></ol> 2. Ao vivo Processamento de Imagem e Análise <ol><li> Sequential alinhamento de imagem: <ol><li> Alinharas imagens de fundo de olho para uma série cronológica do mesmo olho usando a vasculatura e disco óptico como pontos de referência. Abra todas as imagens em um programa de apresentação slide-show comercial, arrastando cada imagem sobre o anterior até que seus discos óticos alinhar no plano XY (a imagem aparece top semi-transparente, sendo arrastados), e depois gire o topo até à sua imagem vasos sanguíneos principais sobrepõem-se com o sistema vascular na imagem abaixo (foco em navios mais distante a partir do disco óptico). Grave o ângulo de rotação para cada imagem e salvar esta série temporal para referência futura, mantendo o controle de mouse e olho identidade. </li><li> Alinhar a correspondente série de imagens de fluorescência de ponto único xy, aplicando o ângulo gravado para corrigir a rotação XY em cada ponto de tempo, usando um programa de edição gráfico de varredura. Além disso, ajustar a resolução para 300 dpi (sem redimensionamento) e fundo (no modo RGB, selecione Níveis e provar o lúmen de um vaso sanguíneo como preto). Guarde estas imagenscomo arquivos TIF, acrescentando que &quot;alinhado&quot; aos seus nomes. </li></ol></li><li> Segmentação de células microgliais: <ol><li> Para identificar GFP + células da retina central, aberto em FluoRender o &quot;alinhado&quot; arquivo TIF correspondente ao mais antigo ponto de tempo / idade. Ampliar a imagem para caber na tela, em seguida, definir a visão Render (composto, ortogonal, interpolados) e suas propriedades (0,58 gama, 255 ponto de saturação, luminância 255, 195 alfa e 1,00 sombreamento), a seleção de ambos os canais RG como visível (esconder B canal por duplo clique sobre ele no quadro Workspace; Figura 4A). </li><li> Para selecionar células individuais, de limiar do canal vermelho (deve ser realçado no quadro Workspace), através do aumento do limiar baixo até que a maioria das células são mascarados (branco) com processos de sobreposição e celulares mínimos (ciano), mantendo o limite de alta constante (255). O valor de limiar baixo varia entre 100 e 170, dependendo da intensidade de fluorescência (Figura 4B &lt;/ Strong&gt;). </li><li> Salve esta visão com o canal vermelho visível apenas (comando Capture) como um novo arquivo TIF, acrescentando que &quot;cellsegm&quot; ao seu nome original (Figura 4C). Usando um software genérico raster editor gráfico, inverter a sua escala de cinzentos e ajustar a resolução para 300 dpi como acima, e salvar novamente como RGB (Figura 4D). NOTA: Elimine as pastas (projetos) automaticamente criada por FluoRender, e salvar o limiar aplicado para referência futura. </li></ol></li><li> Segmentação soma microglial e morfometria: <ol><li> Para identificar GFP + somata celular para quantificação de área, use software de análise de imagem com medições automatizadas de intensidade e capacidades de limiar, bem como à base de limite de contagem de objetos e de medição. Abra o arquivo TIF &quot;cellsegm&quot;, e selecione o método de escala (ranhura) e o canal vermelho (clique na guia vermelho em RGB). Melhorar a visualização, desmarcando &quot;vista canal de cor&quot; (clique com o RG vermelhoGuia B), e selecionando &quot;complementar cores&quot; (Imagem / Ajustar Imagem) para inverter a escala de cinzentos e ver as células em cinza / preto sobre o fundo branco (Figura 4E). </li><li> Calibre a imagem para 1,4-1,7 mm, dependendo da idade, desenhando uma linha horizontal por toda a imagem (Calibração, Calibração Rápida). </li><li> Segmento somata célula individual através da aplicação de intensidade de limiar (Figura 4B). Para isso, o trabalho sobre o canal RGB vermelho e abrir a função de limiar de intensidade (Contagem de objetos; selecionando comando &quot;update contagem&quot;), a fim de controlar os parâmetros bidimensionais para cada região thresholded de interesse (ROI) representando somata individual. </li><li> Definir o limite de intensidade no histograma intensidade, selecionando o menor 50-60% dos níveis de 255, e refinar o valor final limiar por avaliar visualmente a sobreposição entre a máscara de cor limiar (azul) e do perímetro soma célula (cinza) em células individuais (Figura 4E). </li><li> Estimar a precisão das máscaras soma célula para representar as dimensões Somal medindo a área antes e depois de segmentação em 10 células e aceitar o intervalo limite selecionado se as medidas diferem menos de 10% (use a barra de ferramentas binário e Medidas anotadas). </li><li> Identificar manualmente ROIs Somal que incluem várias células e separar esses elementos (eliminar ou ROIs separadas usando os controles da barra de ferramentas binário, ou o Catálogo Object), enquanto alternar on / off do binário para visualizar diretamente as células (Figura 4F). </li><li> Classificar células microgliais como ROIs com áreas Somal maior e menor do que 50-60 mm 2 para discriminar somata célula correspondente a microglia ativada e desativada microglia respectivamente, usando zona de restrição. NOTA: Cada subconjunto Somal célula é identificada com uma camada de binário pseudocolored diferente, e podem ser adicionalmente caracterizados por outros parâmetros morfológicos (perimeter, circularidade, etc.), bem como quantificados no âmbito de sectores da retina discretos (Figura 4G). Salve a imagem analisada como um arquivo ND2. </li><li> Verifique se o processo de ramificação e complexidade nas células microgliais ativadas individuais, através da sobreposição da máscara Somal ea imagem -ponto único xy (contraste aumentou 50%; Figura 4H). Contar manualmente os processos que se estendem diretamente do celular ou soma medir o diâmetro do polígono que abrange o mandril (use a barra de ferramentas binário e Medidas anotadas). NOTA: Activado células possuem processos ou suportar poucos (&lt;4) e curto (&lt;diâmetro Somal 2x) aqueles, em contraste com os processos não-activada de células, que compreendem um mandril ramificada e grande (&gt; 3-10x diâmetro Somal) que circunda a sua relativamente pequena soma. </li><li> Identificar manualmente células com somata menor do que &lt;2 20 um e / ou expressão de GFP abaixo do limite de detecção, os quais são, por conseguinte, sem ser detectado por emthresholding intensidade. Use o comando Taxonomia em Anotações para contar elementos identificados manualmente. </li></ol></li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Monitorização vivo do número de células da microglia e activação morfológica durante uma doença neurodegenerativa requer a utilização de métodos de imagem não invasivos que permitem a visualização detalhada das características celulares. Depois de imagem, as células microgliais deve ser isolado (segmentado) para análises morfométricas pelo uso de múltiplos passos de limite para avaliar o tamanho Somal e / ou a complexidade do processo de leituras para a ativação da micróglia. Neste protocolo, descr...

A microglia são células neuroimunes que reside exclusivamente no sistema nervoso central (SNC) dado que o desenvolvimento embrionário inicial e durante a vida adulta. Equipado com um complexo repertório de receptores, atividade microglial e heterogeneidade regional são regulamentados pela sua interacção bidireccional com os neurônios vizinhos, glia, barreira hemato-encefálica e infiltração de células neuroinflamatórias 1,2. Funções microgliais basais contribuem para a manutenção e reparação fisiológica, uma vez que provar seu território para perturbações na homeostase 3,4. Durante lesão ou doença do SNC, microglia são os primeiros a responder aos sinais neuronais que então desencadeiam a sua transição para um fenótipo reativa, denominado &quot;microglia 2,5-7 ativado. Ativação Microglia envolve um ciclo intrincado da expressão do gene e da proteína, que são acoplados a soma celular e processo de redimensionamento e remodelação 6-9. Activação da microglia, bem como células e redistribuiçãoaglomeração, pode ser acompanhada pelo aumento global local no número de células (denominada microgliose). Isto pode resultar de proliferação celular e de auto-renovação, com ou sem o recrutamento de monócitos sanguíneos derivados de 3,4,7,10-14. Em uma ampla gama de doenças crónicas do SNC, dependentes da idade, sustentada microgliose e ativação da microglia doença paralelo progressão 15-19. Como microglia impacto neurodegeneração permanece obscuro, principalmente porque eles jogam ambos os papéis neuroprotectoras e deletérios que podem ter diversas contribuições para o início da doença e progressão. Estudos de imagem ao vivo que visam a compreensão de doenças crônicas CNS têm monitorado o comportamento microglial no sistema nervoso central danificada de modelos animais e seres humanos, e demonstrou que alterações microgliais são detectáveis ​​início em fases precoces da doença 15-17,19,20. Assim, é crítico para o desenvolvimento de abordagens para detectar e monitorizar a activação da microglia in vivo. Dete não-invasivocção de mudanças regionais na ativação da microglia cérebro foi estabelecido como um importante indicador de vivo de progressão da doença neurodegenerativa, usando a imagem latente molecular ou bioluminescência e tomografia por emissão de pósitrons ou ressonância magnética 18,21,22. Estes métodos de imagem molecular e nuclear altamente quantitativos e não-invasivos detectar gliosis com resolução regional. Alternativamente, dois fótons de imagem confocal em CX3CR1 GFP / + ratinhos permitiu a observação de microglia do cérebro com resolução celular 3,4,9,20,23-28. No entanto, esta abordagem limita a longo prazo e observação repetida de alterações microgliais crônicas, dado o risco potencial de perturbar o seu comportamento por meio de procedimentos de imagem cerebral, ainda que minimamente invasivos 29. Alternativamente, a retina oferece as condições ideais para a visualização direta, em vivo e monitoramento repetida de microglia em seu nicho CNS intacta durante todo o envelhecimento, após a lesão aguda, epotencialmente durante doenças neurodegenerativas crónicas. Assim, estudos recentes têm demonstrado a viabilidade de imagem de alta resolução de microglia da retina que expressam GFP através da adaptação do oftalmoscópio de varredura confocal laser (cSLO) a imagem ao vivo CX3CR1 GFP / + camundongos. Este foi usado para controlar as alterações semanais em números GFP + células em ratinhos individuais por até 10 semanas após a lesão induzida de forma aguda ou hipertensão ocular 30-36. Nós estendemos essa abordagem para realizar imagem de longo prazo ao longo de vários meses, e quantitativamente acompanhar as mudanças na ativação da micróglia com base no tamanho soma usando análises morfométricas. Tamanho Somal foi definida como uma métrica útil da activação da microglia, em estudos de imagem ao vivo utilizando dois fotões microscopia confocal em fatias corticais para executar imagiologia in vivo de CX3CR1-GFP + microglia 9. Estes e outros estudos também demonstraram a correlação entre o tamanho Somal e os níveis de expressão da proteína Iba1, which também aumenta com a activação 9,37. Assim, a microglia activada pode ser identificado em ratinhos vivos, e os seus números e de distribuição monitorizada ao longo do tempo durante a saúde e doença do SNC. Este protocolo descreve métodos para cSLO aquisição e análise de imagens ao vivo para monitorizar o número de células microgliais, distribuição e morfologia durante a activação de células ganglionares (RGC) degeneração da retina (Figura 1). Assim, este estudo utiliza: 1) um modelo de mouse glaucoma herdado (DBA / 2J) que sofre nervo óptico dependente da idade e neurodegeneração da retina e mostra variabilidade notável na progressão da doença entre 5 e 10 meses de idade 38,39, 2) mensal cSLO imagiologia in vivo para a visualização de longo prazo de células GFP + na retina e nervo óptico não mielinizadas de heterozigotos CX3CR1 GFP / + DBA / 2J com idade de 3-5 meses, 3) análise de imagens ao vivo por segmentação e limiar para isolar células e medida somata aIR área. Essas estratégias são aplicados para avaliar a cinética de activação da microglia da retina estados durante os estágios precoces de glaucoma crónico.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="2010">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:617px;">Name</td>
			<td style="width:444px;">Company</td>
			<td style="width:208px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:741px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:617px;">DBA/2J and 
			CX3CR1-GFP/+ mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME</td>
			<td>000671 and 00582</td>
			<td>Mice are breed in-house, introducing new breeders every 3 to 4 generations to prevent genetic drift.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">301/2G needle and 1 ml tuberculin slip-tip syringe</td>
			<td>BD, East Rutherford, NJ</td>
			<td>305106 and 309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:617px;">2,2,2-tribromoethanol, tert-Amyl alcohol 99% and phosphate buffer saline tablets</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>T48402, 152463 and P4417</td>
			<td>Avertin solution (pH 7.3, sterile filtered) must be freshly made solution or stored at 4&#186;C for up to 1 week.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Heat therapy T/Pump</td>
			<td>Gaymar Industries, Orchard Park, NY</td>
			<td>TP-650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cotton-tipped applicators</td>
			<td>Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td>
			<td>23-400-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tropicamide 1%&#160;</td>
			<td>Bausch &#38; Lomb, Rochester, NY</td>
			<td>NDC 24208-585-64</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PMMA contact lenses, 1.70-base curve, 3.2 mm total diameter, 0.40 mm-thick center</td>
			<td>Cantor &#38; Nissel Ltd., Northamptonshire, UK</td>
			<td>G003709</td>
			<td>Lenses are rinsed with sterile PBS and stored in polypropylene boxes.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HRA/Spectralis confocal scanning laser ophthalmoscope and Eye Explorer software</td>
			<td>Heidelberg Engineering GmbH, Carlsbad, CA</td>
			<td>Version 1.7.1.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PowerPoint</td>
			<td>Microsoft, Redmond, WA</td>
			<td>Version 14.4.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Adobe Photoshop</td>
			<td>Adobe, San Jose, CA</td>
			<td>Version CS3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FluoRender</td>
			<td>Scientific Computing and Imaging Institute, University of Utah</td>
			<td>Version 2.13</td>
			<td>Freeware. http://www.sci.utah.edu/software/13-software/127-fluorender.html</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NIS-Elements C</td>
			<td>Nikon, Melville, NY</td>
			<td>Version 4.30.01</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo dynamics of retinal microglial activation during neurodegeneration: confocal ophthalmoscopic imaging and cell morphometry in mouse glaucoma

A microglia, que são células do SNC neuroimunes residentes, transformar a sua morfologia e tamanho em resposta à lesão do SNC, a mudança para um estado activado com funções distintas e perfis de expressão de gene. Os papéis de ativação microglial na saúde, ferimentos e doenças ainda permanece incompreendida, devido à sua regulamentação dinâmico e complexo em resposta a mudanças no seu microambiente. Assim, é essencial monitorizar de forma não invasiva e analisar as alterações na activação da microglia ao longo do tempo no organismo intacto. Estudos in vivo de ativação microglial ter sido adiada por limitações técnicas ao comportamento microglial rastreamento sem alterar o ambiente CNS. Isso tem sido particularmente desafiador durante a neurodegeneração crónica, onde as mudanças de longo prazo devem ser rastreadas. A retina, um órgão do SNC passíveis de imagens ao vivo não-invasiva, oferece um sistema poderoso para visualizar e caracterizar as dinâmicas da activação da microglia durante a desordens crónicas. a imagem in vivo de microglia da retina, utilizando oftalmoscopia confocal (cSLO) e CX3CR1 GFP ratos / + repórter, para visualizar microglia com resolução de celular. Além disso, nós descrevemos métodos para quantificar as mudanças mensais de ativação celular e densidade em grandes subconjuntos de células (200-300 células por retina). Confirmamos o uso da área Somal como uma métrica útil para o rastreio ao vivo da ativação microglial na retina através da aplicação de morfometria baseada no limiar automatizada de imagens in vivo. Nós usamos estes aquisição de imagem ao vivo e analisa estratégias para monitorar as mudanças dinâmicas na ativação microglial e microgliose durante as fases iniciais de neurodegeneração da retina em um mouse modelo de glaucoma crônico. Esta abordagem deve ser útil para investigar as contribuições de microglia para declínio neuronal e axonal em doenças crônicas do sistema nervoso central que afetam a retina eo nervo óptico.

Nossos recente estudos in vivo utilizado aquisição e análise de imagens ao vivo esses métodos para visualizar e controlar a cinética e padrões de ONH e mudanças microgliais da retina durante as fases iniciais do glaucoma crônico e sua relação com a tarde neurodegeneração 59. Aqui, ilustramos um protocolo de aquisição de imagem cSLO para visualizar as células microgliais através de uma grande área da retina central em jovens individuais heterozigotos CX3CR1-GFP DBA / 2J retina <strong...

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In Vivo Dynamics of Retinal Microglial Activation During Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoscopic Imaging and Cell Morphometry in Mouse Glaucoma

Ativação da micróglia e microgliose são respostas fundamentais para a neurodegeneração crónica. Aqui, apresentamos métodos para in vivo, visualização de longo prazo de CX3CR1-GFP + células microgliais da retina por oftalmoscopia confocal, e para limiar e análises morfométricas para identificar e quantificar a sua activação. Monitoramos alterações microgliais durante estágios iniciais de glaucoma relacionada com a idade.

In Vivo Dinâmica da Retinal microglia Ativação Durante Neurodegeneration: confocal oftalmoscópico Imagem e morfometria celular no mouse Glaucoma

Microglia, which are CNS-resident neuroimmune cells, transform their morphology and size in response to CNS damage, switching to an activated state with ...

in-vivo-dynamics-retinal-microglial-activation-during

Research

JoVE Journal

Medicine

In Vivo Dynamics of Retinal Microglial Activation During Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoscopic Imaging and Cell Morphometry in Mouse Glaucoma

10.5K visualizações.  University of Utah.  Ativação da micróglia e microgliose são respostas fundamentais para a neurodegeneração crónica. Aqui, apresentamos métodos para in vivo, visualização de longo prazo de CX3CR1-GFP + células microgliais da retina por oftalmoscopia confocal, e para limiar e análises morfométricas para identificar e quantificar a sua activação. Monitoramos alterações microgliais durante estágios iniciais de glaucoma relacionada com a idade. 

Vídeo: In Vivo Dynamics of Retinal Microglial Activation During Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoscopic Imaging and Cell Morphometry in Mouse Glaucoma

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient management strategies. Orthotopic mouse models of oral cancer have been developed to facilitate the study of factors that impact invasion and serve as model system for evaluating anti-tumor therapeutics. In these systems, visualization of disseminated tumor cells within oral cavity tissues has typically been conducted by either conventional histology or with in vivo bioluminescent methods. A primary drawback of these techniques is the inherent inability to accurately visualize and quantify early tumor cell invasion arising from the primary site in three dimensions. Here we describe a protocol that combines an established model for squamous cell carcinoma of the tongue (SCOT) with two-photon imaging to allow multi-vectorial visualization of lingual tumor spread. The OSC-19 head and neck tumor cell line was stably engineered to express the F-actin binding peptide LifeAct fused to the mCherry fluorescent protein (LifeAct-mCherry). Fox1nu/nu mice injected with these cells reliably form tumors that allow the tongue to be visualized by ex-vivo application of two-photon microscopy. This technique allows for the orthotopic visualization of the tumor mass and locally invading cells in excised tongues without disruption of the regional tumor microenvironment. In addition, this system allows for the quantification of tumor cell invasion by calculating distances that invaded cells move from the primary tumor site. Overall this procedure provides an enhanced model system for analyzing factors that contribute to SCOT invasion and therapeutic treatments tailored to prevent local invasion and distant metastatic spread. This method also has the potential to be ultimately combined with other imaging modalities in an in vivo setting.

A comprehensive overview of the techniques involved in generating a mouse model of oral cancer and quantitative monitoring of tumor invasion within the tongue through multi-photon microscopy of labeled cells is presented. This system can serve as a useful platform for the molecular assessment and drug efficacy of anti-invasive compounds.

Multi-fotão imagem de invasão das células tumorais em um modelo de camundongo ortotópico de carcinoma epidermóide oral

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

Medicina

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There is little knowledge about in situ, in vivo, tumor hypoxia during intracranial development of malignant brain tumors because of lack of efficient means to monitor it in these deep-seated orthotopic tumors. Bioluminescence imaging (BLI), based on the detection of light emitted by living cells expressing a luciferase gene, has been rapidly adopted for cancer research, in particular, to evaluate tumor growth or tumor size changes in response to treatment in preclinical animal studies. Moreover, by expressing a reporter gene under the control of a promoter sequence, the specific gene expression can be monitored non-invasively by BLI. Under hypoxic stress, signaling responses are mediated mainly via the hypoxia inducible factor-1&alpha; (HIF-1&alpha;) to drive transcription of various genes. Therefore, we have used a HIF-1&alpha; reporter construct, 5HRE-ODD-luc, stably transfected into human breast cancer MDA-MB231 cells (MDA-MB231/5HRE-ODD-luc). In vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay is performed by incubating the transfected cells in a hypoxic chamber (0.1% O2) for 24 hr before BLI, while the cells in normoxia (21% O2) serve as a control. Significantly higher photon flux observed for the cells under hypoxia suggests an increased HIF-1&alpha; binding to its promoter (HRE elements), as compared to those in normoxia. Cells are injected directly into the mouse brain to establish a breast cancer brain metastasis model. In vivo bioluminescence imaging of tumor hypoxia dynamics is initiated 2 wks after implantation and repeated once a week. BLI reveals increasing light signals from the brain as the tumor progresses, indicating increased intracranial tumor hypoxia. Histological and immunohistochemical studies are used to confirm the in vivo imaging results. Here, we will introduce approaches of in vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay, surgical establishment of a breast cancer brain metastasis in a nude mouse and application of in vivo bioluminescence imaging to monitor intracranial tumor hypoxia.

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

Bioluminescence imaging of hypoxia inducible factor-1&alpha; activity is applied to monitor intracranial tumor hypoxia development in a breast cancer brain metastasis mouse model.

Na imagem de bioluminescência vivo Tumor de mama Dynamics Hipóxia metástase do cancro cerebral em um modelo de rato

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There ...

In vivo Imaging of Tumor Angiogenesis using Fluorescence Confocal Videomicroscopy

Fibered confocal fluorescence in vivo imaging with a fiber optic bundle uses the same principle as fluorescent confocal microscopy. It can excite fluorescent in situ elements through the optical fibers, and then record some of the emitted photons, via the same optical fibers. The light source is a laser that sends the exciting light through an element within the fiber bundle and as it scans over the sample, recreates an image pixel by pixel. As this scan is very fast, by combining it with dedicated image processing software, images in real time with a frequency of 12 frames/sec can be obtained.
We developed a technique to quantitatively characterize capillary morphology and function, using a confocal fluorescence videomicroscopy device. The first step in our experiment was to record 5 sec movies in the four quadrants of the tumor to visualize the capillary network. All movies were processed using software (ImageCell, Mauna Kea Technology, Paris France) that performs an automated segmentation of vessels around a chosen diameter (10 &mu;m in our case). Thus, we could quantify the 'functional capillary density', which is the ratio between the total vessel area and the total area of the image. This parameter was a surrogate marker for microvascular density, usually measured using pathology tools.
The second step was to record movies of the tumor over 20 min to quantify leakage of the macromolecular contrast agent through the capillary wall into the interstitium. By measuring the ratio of signal intensity in the interstitium over that in the vessels, an 'index leakage' was obtained, acting as a surrogate marker for capillary permeability.

In vivo Imaging of Tumor Angiogenesis using Fluorescence Confocal Videomicroscopy

In this paper, we present a method to analyze tumor microvessels in vivo using dynamic contrast-enhanced fluorescence videomicroscopy. Two quantitative parameters were acquired: functional capillary density reflecting the vascularity of the tumor, and index leakage reflecting the leakiness of the endothelial wall.

Imagem in vivo da angiogênese tumoral utilizando fluorescência confocal Videomicroscopia

Fibered confocal fluorescence in vivo imaging with a fiber optic bundle uses the same principle as fluorescent confocal microscopy. It can excite ...

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. Here, we describe a general protocol for cell labeling, imaging, and image processing. The technique is applicable to various cell types and animal models, although here we focus on a typical mouse model for tracking murine immune cells. The most important issues for cell labeling are described, as these are relevant to all models. Similarly, key imaging parameters are listed, although the details will vary depending on the MRI system and the individual setup. Finally, we include an image processing protocol for quantification. Variations for this, and other parts of the protocol, are assessed in the Discussion section. Based on the detailed procedure described here, the user will need to adapt the protocol for each specific cell type, cell label, animal model, and imaging setup. Note that the protocol can also be adapted for human use, as long as clinical restrictions are met.

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

We describe a general protocol for in vivo cell tracking using MRI in a mouse model with ex vivo labeled cells. A typical protocol for cell labeling, image acquisition processing and quantification is included.

In vivo 19 F MRI para Rastreamento celular

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in vivo demonstration of such cells has only recently been attained. Here, in vivo imaging techniques to investigate the role of endogenous osteogenic stem/progenitor cells (OSPCs) and their progeny in bone repair are provided. Using osteo-lineage cell tracing models and intravital imaging of induced microfractures in calvarial bone, OSPCs can be directly observed during the first few days after injury, in which critical events in the early repair process occur. Injury sites can be sequentially imaged revealing that OSPCs relocate to the injury, increase in number and differentiate into bone forming osteoblasts. These methods offer a means of investigating the role of stem cell-intrinsic and extrinsic molecular regulators for bone regeneration and repair.

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Quantitative measurement of bone progenitor function in fracture healing requires high resolution serial imaging technology. Here, protocols are provided for using intravital microscopy and osteo-lineage tracking to sequentially image and quantify the migration, proliferation and differentiation of endogenous osteogenic stem/progenitor cells in the process of repairing bone fracture.

Seqüente<em&gt; In vivo</em&gt; Imagem de osteogênicas células-tronco / progenitoras durante o reparo de fratura

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in ...

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. Despite the discovery of key regulators of uterine contractility, this process is still not fully understood. Transgenic mice provide an ideal model in which to study parturition. Previously, the only method to study uterine contractility in the mouse was ex vivo isometric tension recordings, which are suboptimal for several reasons. The uterus must be removed from its physiological environment, a limited time course of investigation is possible, and the mice must be sacrificed. The recent development of radiometric telemetry has allowed for longitudinal, real-time measurements of in vivo intrauterine pressure in mice. Here, the implantation of an intrauterine telemeter to measure pressure changes in the mouse uterus from mid-pregnancy until delivery is described. By comparing differences in pressures between wild type and transgenic mice, the physiological impact of a gene of interest can be elucidated. This technique should expedite the development of therapeutics used to treat myometrial disorders during pregnancy, including preterm labor.

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

This manuscript provides a protocol for implanting telemeters in the mouse for the purpose of measuring intrauterine pressures during pregnancy.

Telemetria Intrauterine medir Rato contrátil Pressão<em&gt; In Vivo</em

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. ...

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo: A Model of Single Vessel Stroke

In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to image cellular events in an intact animal. Additionally, the ability to induce physiological disease states such as stroke in vivo increases its utility. The technique described herein allows for physiological assessment of cellular responses within the CNS following a stroke and can be adapted for other pathological conditions being studied. The technique presented uses laser excitation of the photosensitive dye Rose Bengal in vivo to induce a focal ischemic event in a single blood vessel. 
The video protocol demonstrates the preparation of a thin-skulled cranial window over the somatosensory cortex in a mouse for the induction of a Rose Bengal photothrombotic event keeping injury to the underlying dura matter and brain at a minimum. Surgical preparation is initially performed under a dissecting microscope with a custom-made surgical/imaging platform, which is then transferred to a confocal microscope equipped with an inverted objective adaptor. Representative images acquired utilizing this protocol are presented as well as time-lapse sequences of stroke induction. This technique is powerful in that the same area can be imaged repeatedly on subsequent days facilitating longitudinal in vivo studies of pathological processes following stroke.

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo:  A Model of Single Vessel Stroke

Here, we describe a semi-invasive optical microscopy approach for the induction of a Rose Bengal photothrombotic clot in the somatosensory cortex of a mouse in vivo. The technical aspects of the imaging procedure are described from induction of a photothrombotic event to application and data collection.

Rosa Bengala Fototrombose por imageamento óptico confocal<em&gt; In Vivo</em&gt;: Um Modelo de curso Veículo Individual

In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to ...

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaucoma is a disease of the central nervous system affecting retinal ganglion cells (RGCs). RGC axons making up the optic nerve carry visual input to the brain for visual perception. Damage to RGCs and their axons leads to vision loss and/or blindness. Although the specific cause of glaucoma is unknown, the primary risk factor for the disease is an elevated intraocular pressure. Glaucoma-inducing procedures in animal models are a valuable tool to researchers studying the mechanism of RGC death. Such information can lead to the development of effective neuroprotective treatments that could aid in the prevention of vision loss. The protocol in this paper describes a method of inducing glaucoma - like conditions in an in vivo rat model where 50 &#181;l of 2 M hypertonic saline is injected into the episcleral venous plexus. Blanching of the vessels indicates successful injection. This procedure causes loss of RGCs to simulate glaucoma. One month following injection, animals are sacrificed and eyes are removed. Next, the cornea, lens, and vitreous are removed to make an eyecup. The retina is then peeled from the back of the eye and pinned onto sylgard dishes using cactus needles. At this point, neurons in the retina can be stained for analysis. Results from this lab show that approximately 25% of RGCs are lost within one month of the procedure when compared to internal controls. This procedure allows for quantitative analysis of retinal ganglion cell death in an in vivo rat glaucoma model.

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaucoma is characterized by damage to retinal ganglion cells. Inducing glaucoma in animal models can provide insight into the study of this disease. Here, we outline a procedure that induces loss of RGCs in an in vivo rat model and demonstrates the preparation of whole-mount retinas for analysis.

Glaucoma de indução de Procedimento em um<em&gt; In Vivo</em&gt; Modelo de Rato e Whole mount-Retina Preparação

Glaucoma is a disease of the central nervous system affecting retinal ganglion cells (RGCs). RGC axons making up the optic nerve carry visual input to the ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic patient tumors in different assays1. Human tumor xenografts represent the gold standard with respect to tumor biology, drug discovery, and metastasis research 2-4. Tumor xenografts can be derived from different types of material like tumor cell lines, tumor tissue from primary patient tumors4 or serially transplanted tumors. When propagated in vivo, xenografted tissue is infiltrated and vascularized by cells of mouse origin. Multiple factors such as the tumor entity, the origin of xenografted material, growth rate and region of transplantation influence the composition and the amount of mouse cells present in tumor xenografts. However, even when these factors are kept constant, the degree of mouse cell contamination is highly variable.
Contaminating mouse cells significantly impair downstream analyses of human tumor xenografts. As mouse fibroblasts show high plating efficacies and proliferation rates, they tend to overgrow cultures of human tumor cells, especially slowly proliferating subpopulations. Mouse cell derived DNA, mRNA, and protein components can bias downstream gene expression analysis, next-generation sequencing, as well as proteome analysis 5. To overcome these limitations, we have developed a fast and easy method to isolate untouched human tumor cells from xenografted tumor tissue. This procedure is based on the comprehensive depletion of cells of mouse origin by combining automated tissue dissociation with the benchtop tissue dissociator and magnetic cell sorting. Here, we demonstrate that human target cells can be can be obtained with purities higher than 96% within less than 20 min independent of the tumor type.

Human tumor xenografts are vascularized and infiltrated by cells of mouse origin during the growth phase in vivo. To circumvent the bias caused by these contaminating cells during downstream analysis, we developed a method allowing for comprehensive depletion of all mouse cells by magnetic cell sorting.

Depleção de células do rato de xenoenxertos de tumor humano Melhora Significativamente Análise Downstream de células alvo

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Fluorescent Dye Labeling of Erythrocytes and Leukocytes for Studying the Flow Dynamics in Mouse Retinal Circulation

The retinal and choroidal blood flow dynamics may provide insight into the pathophysiology and sequelae of various ocular diseases, such as glaucoma, diabetic retinopathy, age-related macular degeneration (AMD) and other ocular inflammatory conditions. It may also help to monitor the therapeutic responses in the eye. The proper labeling of the blood cells, coupled with live-cell imaging of the labeled cells, allows for the investigation of the flow dynamics in the retinal and choroidal circulation. Here, we describe the standardized protocols of 1.5% indocyanine green (ICG) and 1% sodium fluorescein labeling of mice erythrocytes and leukocytes, respectively. Scanning laser ophthalmoscopy (SLO) was applied to visualize the labeled cells in the retinal circulation of C57BL/6J mice (wild type). Both methods demonstrated distinct fluorescently labeled cells in the mouse retinal circulation. These labeling methods can have wider applications in various ocular disease models.

Live-cell imaging of the labeled blood cells in ocular circulation can provide information about inflammation and ischemia in diabetic retinopathy and age-related macular degeneration. A protocol to label blood cells and image the labeled cells in the retinal circulation is described.

Etiquetagem de corantes fluorescentes de eritrócitos e leucócitos para estudar a dinâmica do fluxo na circulação da retina do mouse

The retinal and choroidal blood flow dynamics may provide insight into the pathophysiology and sequelae of various ocular diseases, such as glaucoma, ...