This research was supported by Cleveland State University Faculty Development Funds.

寄生虫の細胞培養の調製、寄生虫ペレットのコレクション<ol><li> 1リットルのRPMI-1640粉末10g、ゲンタマイシン硫酸塩66 mgを、2gの重炭酸ナトリウム5.9グラムのHEPES緩衝液、50mgのヒポキサンチン3.8グラムのブドウ糖を添加することによりRPMI-1640-HEPES培地を調製し、無菌のdH 2 O.全ての粉末を1Lの蒸留水に溶解するまでテーブルマグネチックスターラーを用いて混合します。 0.22μmフィルターを使用してメディアの精密ろ過を行います。滅菌ボトル内のメディアを保管してください。 </li><li> RPMIを使用して感染していない（新鮮な）タイプA +赤血球を洗浄します。赤血球の5％のヘマトクリット（9.5ミリリットルの10％RPMI +ヒト血清中で洗浄し、新鮮な赤血球の0.5ミリリットル）を準備します。 </li><li>寄生虫の栽培を開始するために、15％ヒト血清+ RPMI（ヒト血清とRPMIの85ミリリットルの15ミリリットル）を作ります。赤血球において寄生虫の培養を継続するために、10％ヒト血清及びRPMI（ヒト血清10ml及びRPMI 90 ml）を作ります。 </li><li>文化P.熱帯熱マラリア原虫 （3D7とFCR-3株）タイプ5％のヘマトクリット及び20％の寄生虫シャーレ内または75 cm 3の培養フラスコでのA +ヒト赤血球。トレーガーとジェンセンキャンドルジャー26の方法に従って、インビトロでの培養を維持します。あるいは、培養物が9.5％のCO 2と3.4％のN 2ガ ​​ス維持し、37℃のインキュベーターである維持します。文化P. 10％ヒト血清を補充したRPMI 1640-HEPES培地で熱帯熱マラリア原虫 。 </li><li> Pを同期させます培養液に65％パーコール（ヒト血清を含まないRPMI-1640のパーコールの65ミリリットル+ 35ミリリットル）を追加することで熱帯熱マラリア原虫の培養は、27を集中します。 </li><li> 3層になる5分間、2500×gでパーコールを含む培養濃縮物を遠心します。慎重に、トランスファーピペットを用いて、無菌状態の下で27の別々のチューブに中間層転写からシゾントを分離します。 </li><li> 5分間7500×gで遠心分離することにより、過剰なパーコールを除去するために二回、10％ヒト血清+ RPMI-1640で分離された文化を洗ってください。ディ無菌状態の下で27上清を毎回SCARD。 </li><li>同期P.を培養し続けます10％ヒト血清+ 27 RPMI-1640で熱帯熱マラリア原虫のシゾント。 </li><li> 10 mMトリスpHを8.8にマラリア原虫に感染した赤血球をを治療し、15分間23 15000×gで遠心分離することによって、シゾントを収集します。ペレットにプロテアーゼ阻害剤（アプロチニン）5μlの添加以下の-70℃で保存寄生虫ペレット。タンパク質抽出、ゲノムDNAの単離およびRNA単離のために寄生虫ペレットを使用してください。 </li></ol>プラスミドベクターの準備2. <ol><li> PからゲノムDNAを単離約20％の寄生虫血の培養物から調製原虫シゾントペレット。 </li><li> 、マイクロチューブにペレットにpHが7.6の10mMのトリス-HCl、50mMのEDTA pH8.0の、0.1％SDSおよび1 mg / mlのプロテ​​イナーゼK、600μlのを追加します26 G針に取り付けられた1mlシリンジを使用してペレットを均質化します。注射器に充填代替ペレットの混合物とし、微量遠心管に20回を空にする。 50℃の水浴中でホモジネートO / Nを含むチューブをインキュベートします。 </li><li>均質化されたペレットに、P + C（フェノール300μlのクロロホルム300μlの）の600μLを添加することにより、クロロホルム（P + C）の抽出 - フェノールを実行します。キャップチューブをしっかりとチューブエンド·ツー·エンドを反転させて混合物を激しく振ります。 2分間、14,000×gで遠心分離管と新しいマイクロチューブにマイクロピペットを用いて、上部水溶液を収集します。二回、この手順を繰り返します。 </li><li>ステップ2.1.2から新しいチューブに水層にクロロホルム600μlのを追加します。 2分間14,000×gで10秒間遠心分離用チューブをボルテックス。マイクロピペットで上層の水層を測定して、新しいマイクロ遠心チューブに移します。 </li><li>水性レイに（水層を300μlの5 M酢酸ナトリウムのpHをイソプロパノール5.5 + 330μlと30μlを添加する場合）5 M酢酸ナトリウムのpHを5.5の0.1容量のイソプロパノール1容量を追加ステップ2.1.3からえー。室温で15分間チューブをインキュベートします。 </li><li> DNAペレットを沈殿させ、10分間14,000×gでチューブを遠心。上清を捨て、DNAから過剰の塩を除去するために、70％エタノール（エタノール70μlのとのdH 2 O30μlの）100μlでペレットを洗浄。 -20℃でのdH 2 O50μlのストアDNA。 </li><li>前方に設計し、Pの増幅のためのソフトウェアを使用して、または手動リバースプライマー表2に示すように、 熱帯熱マラリア原虫の遺伝子PF3D7_1361800、PF3D7_0925900、PF3D7_1436300とPF3D7_0114100は、以前プロテオーム研究発現プラスミドpT7CFE1-チスの多重クローニング部位への遺伝子配列のクローニングを可能にするために、適切な制限部位を有する16,18で識別されました。 </li><li>追加することで、50μlの反応混合物を作ります。分離されたPの5μlの熱帯熱マラリア原虫のゲノムDNA、10×緩衝液5μl、MgCl 2を5μlの、フォワードプライマー1.5μlの、1.5μlのリバースプライマーは、T7 DNAポリメラーゼ0.5μlのとのdH 2 O 31.5μlのおよび変性のために8分間94℃でのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を行い、拡張のために1分30秒間50℃、9を72°C 表1に示す遺伝子を増幅するためのアニーリングおよび再生分間。 </li><li> 1％アガロースゲル（アガロース1g及びトリス酢酸EDTA（TAE）緩衝液100ml）32上に独立したPCR産物。 </li><li> 、アガロースゲルからPCR増幅されたDNAバンドを切断されたDNAゲル抽出スピンカラムにDNAを含むゲルスライスを配置し、5分間、-20℃で凍結します。 5分間14,000×gで凍結したゲルスライスや遠心分離機にイソプロパノール100μlを添加します。 </li><li>マイクロピペットを用いて、水性フロースルーステップ2.5からコレクションチューブに濾過さを測定し、新しいチューブに移します。 5分間、14,000×gで5 M酢酸ナトリウムおよび遠心分離機の0.1容量を追加します。上清を捨て、目にのdH 2 O10μlのを追加EのDNAペレット。 </li><li>各チューブにプラスミドおよび3μlのPCR遺伝子産物の5μLを添加することにより、2つの別々のチューブにpT7CFE1-CHIS発現ベクターと、（2.6）から精製されたDNA断片をダイジェスト。各チューブに特定の制限酵素の1μlを、反応緩衝液2μlのとのdH 2 Oの14μLを追加</li><li>消化されたプラスミドの3μlを、消化されたDNA断片の5μlを、10×リガーゼ緩衝液2μlのリガーゼの1μLとマイクロ遠心チューブ内のdH 2 Oの9μlを添加します。 12°CO / Nでインキュベートします。 </li><li> pHは5.5と2倍量のエタノールで3 M酢酸ナトリウムの0.1容量を追加し、ステップ2.14からチューブに（あなたの連結管容積がある場合は20μlの3 M酢酸ナトリウムのエタノール+ 44μLの2μlを添加します）。よく混ぜ、15分間-20℃でインキュベートします。 </li><li> 15分間14,000×gでチューブを遠心。ペレットを乱さないように注意し、マイクロピペットを用いて上清を除去します。 </li><li> 70％エタノールtの100μlを添加しますステップ2.10からペレットO。 5分間、14,000×gでチューブを遠心。上清を除去し、廃棄します。 DNAペレットにヌクレアーゼフリー水10μlを加えます。 </li></ol> インビトロヒト細胞フリー発現システムで使用3.タンパク質発現<ol><li> 2段階のための組換えpT7CFE1-チスプラスミドDNA、5×転写バッファー4μlの2μlのを測定することにより、転写混合物20μlの、NTPミックスの4μL、T7 RNAポリメラーゼおよびヌクレアーゼフリー水8μlの2μlのを準備しますDNAテンプレートを用いてin vitroタンパク質発現における人間。微量遠心管中の成分を混合し、水浴中で30℃で75分間インキュベートします。 </li><li>転写混合物の2μLを取り、HeLa細胞溶解物の12.5μlを、アクセサリータンパク質の2.5μlを、塩溶液Aの1μlを、アミノ酸-Met0.5μlの、アミノ酸の0.5μLを含む翻訳混合物の23μlにそれを追加-Leu、181; RNaseインヒビター、エネルギーミックスの1.25μlのヌクレアーゼを含まない水の3.75μlのlの。 </li><li> 90分間、30℃でステップ3.2からの翻訳混合物をインキュベートします。ストア-20℃で製品を翻訳しました。 </li><li> 1段階のための組換えpT7CFE1-チスプラスミドDNAの3μL、ヌクレアーゼフリー水を2μl、反応ミックスを5μl、HeLa細胞溶解物12.5μlのとアクセサリータンパク質の2.5μLを添加することにより、転写および翻訳混合物25μlのを準備しますDNAテンプレートの人間の結合IVTタンパク質発現。 </li><li> 30℃で90分〜6時間のためのステップ3.4からの反応混合物をインキュベートします。 -20で翻訳産物を保存 °C。 </li></ol>発現された組換えタンパク質の精製4 <ol><li>精製混合物の100μlのを作るために翻訳産物の25μlに1×精製バッファー75μlのを追加します。 </li><li>精製MIXTの100μlにニッケルキレート樹脂の100μlを添加しますURE。ウォッシュのNi-樹脂回のdH 2 O300μlのと結合バッファーを300μlを追加します。過剰のエタノールを除去するために、1分間14,000×gで樹脂と遠心分離機を再サスペンド。 </li><li>ステップからのニッケルキレート樹脂の4.2から100μLを精製混合物の100μlを添加して、室温で60分間混合物をインキュベートします。 </li><li> 1分間14,000×gで、混合物を遠心し、「フロースルー」と表示新しいチューブに上清を収集します。 </li><li> 1×洗浄バッファー（20 mMイミダゾール、pHが8で250 mMののNaH 2 PO 4、2.5 MのNaClとDH 2 O）を100μlで洗浄樹脂。 1分間14,000×gで遠心分離し、「洗浄」と表示された新たなチューブに上清を収集します。二回ステップ4.5を繰り返します。 </li><li> 1×溶出緩衝液100μl加える（pH8.0の100mMのイミダゾール、250mMののNa 2 PO 4、2.5MのNaClとのdH 2 O）樹脂と15分間インキュベートします。 1分間14,000×gで遠心分離します。二回溶出工程を行います。各時間は、「溶出液」として新たなマイクロ遠心チューブやラベルに上清を収集します。 </li><li>ステップ4.5で説明したように溶出した後、二回樹脂を洗浄。ストアは、を介して-20℃以下での洗浄及び溶出サンプルを流します。樹脂は、4℃で保存する必要があります。 SDS-PAGEおよびイムノブロッティング分析のために、各サンプルの30μlのを使用してください。 </li></ol> 5.クマシー（ブラッドフォード）タンパク質アッセイ34 <ol><li>濃度の標準ウシ血清アルブミン（BSA）溶液を調製20μgの/ mlのは、40μgの/ mlの（BSA20μlのを混ぜて（BSA（2 mg / mlの）とのdH 2 O90μlの10μlのをミックス）（2 mgの/ ml）およびのdH 2 O）の80μL、60μgの/ mlの（（2 mgのBSA（2 mg / mlの）とのdH 2 O）の70μL、80μgの/ mlの（BSA40μlのを混ぜ30μlのを混ぜます/ ml）およびのdH 2 O）、60μlの100μgの/ mlの（BSA（2 mg / mlの）を50μlとのdH 2 O）を50μl、160μgの/ mlの（BSA80μlのをミックスを混ぜる（2 mgの/ ml）をとDH20μlの2 O）と、200μgの/ mlの（BSAを100μl（2 mg / mlで）。 </li><li>メジャーステップ4.7からのフロースルー、洗浄および溶出液のサンプルの5μL。のdH 2 Oの95μLを追加</li><li>ステップ5.1および5.2からの混合物にクマシーブルー試薬の5ミリリットルを追加します。その後、室温で20分間インキュベート10秒間パラフィルムとボルテックスでチューブをカバーしています。 </li><li>分光光度計を使用して、ステップ5.3からのタンパク質のチューブ用の波長650nmでの光学密度（OD）を測定します。 OD読み取り対プロット濃度は、タンパク質濃度34を決定します。 </li></ol> 6.ウェスタンブロッティング<ol><li> Pから分裂抽出物の5μlを添加します熱帯熱マラリア原虫 、 大腸菌の2μlを、組換えRhop-3蛋白質31を発現し、組換えタンパク質の5μlを、インビトロのヒト発現系およびタンパク質産物の10μl の 2段と1段を使用して表現チューブを分離するために、親和性方法を用いて精製しました。 </li&gt; <li>可溶化したタンパク質サンプルを作るために20μlの最終容量のために各チューブにメルカプトエタノールを含有する電気泳動サンプルバッファーを加えます。 2分間チューブを沸騰させます。 </li><li>タンパク質を分離するために、10％SDS-PAGEゲル上に可溶化タンパク質試料をロードします。 </li><li> 2時間半乾燥ウエスタンブロッティングチャンバー内でゲルあたり35ミリアンペアの電流で電気泳動によりニトロセルロース紙（NCP）のSDS-PAGEゲルから分離したタンパク質を転送します。 </li><li> 2％の脱脂乳で転送以下のブロックのNCP。 </li><li>インキュベートは、1希釈し、以下のポリクローナル抗体とのNCPをブロック：ウエスタンブロッティングを行うために2％のミルクで100;ウサギ抗体Pの具体的な＃676 21 熱帯熱マラリア原虫メロゾイトrhoptries、Pの20特異的なマウス抗体ヨエリとP. Pの具体的なベルゲイメロゾイトrhoptries、抗血清＃685マウラーのための特定の熱帯熱マラリア原虫寄生虫液胞タンパク質、SERA（セリンリッチ抗原）22および抗体217; sの裂け目タンパク質PFMC-2TM 28。 </li><li> 1ものNCPをインキュベート100正常マウスおよびウサギ血清を希釈し、陰性対照としてSP2骨髄腫細胞からの培養上清（SCS）を費やしました。 </li><li> 4ºCO / Nでの抗体およびコントロールでのNCPをインキュベートします。 </li><li> 2％ミルクで1：1000ブロットを洗浄するNCP 4Xは、種とのNCPをバッファリングし、インキュベートし、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）に結合特異的二次抗体を1に希釈しました。 </li><li>ブロット緩衝液で洗浄するNCP 4倍。 30：;：インキュベートは、発色液A + B（メタノール10mlおよび3-クロロナフトール30mgを追加し、溶液Bは、1×ブロットバッファとH 2 O 2の30μLの50ミリリットルを追加溶液A）でのNCPを洗浄しました暗所で分。比色ウェスタンブロットの結果を分析します。 </li></ol>

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Y., Shio, H., Perkins, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretion+of+Plasmodium+falciparum.+rhoptry+protein+into+plasma+membrane+of+host+erythrocytes.">Secretion of Plasmodium falciparum. rhoptry protein into plasma membrane of host erythrocytes.</a> J Cell Biol. 106 (5), 1507-1513 (1988).</li><li>Sundaresh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+humoral+immune+responses+in+protein+microarrays+using+DNA+microarray+data+analysis+techniques.">Identification of humoral immune responses in protein microarrays using DNA microarray data analysis techniques.</a> Bioinformatics. 22 (14), 1760-1766 (2006).</li><li>Terpe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+bacterial+expression+systems+for+heterologous+protein+production:+from+molecular+and+biochemical+fundamentals+to+commercial+systems.">Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 72 (2), 211-222 (2006).</li><li>Trager, W., Jensen, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+malaria+parasites+in+continuous+culture.">Human malaria parasites in continuous culture.</a> Science. 193 (4254), 673-675 (1976).</li><li>Tsarukyanova, I., Drazba, J. A., Fujioka, H., Yadav, S., Sam-Yellowe, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteins+of+the+Plasmodium+falciparum.+two+transmembrane+Maurer&#8217;s+cleft+protein+family,+PfMC-2TM+and+the+130+kDa+Maurer&#8217;s+cleft+protein+define+different+domains+of+the+infected+erythrocyte+intramembranous+network.">Proteins of the Plasmodium falciparum. two transmembrane Maurer&#8217;s cleft protein family, PfMC-2TM and the 130 kDa Maurer&#8217;s cleft protein define different domains of the infected erythrocyte intramembranous network.</a> Parasitol Res. 104 (4), 875-891 (2009).</li><li>Tsuboi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wheat+germ+cell-free+system-based+production+of+malaria+proteins+for+discovery+of+novel+vaccine+candidates.">Wheat germ cell-free system-based production of malaria proteins for discovery of novel vaccine candidates.</a> Infect. Immun. 76 (4), 1702-1708 (2008).</li><li>Tsuboi, T., Takeo, S., Sawasaki, T., Torii, M., Endo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+approach+to+the+production+of+vaccines+against+the+malaria+parasite.">An efficient approach to the production of vaccines against the malaria parasite.</a> Methods in Mol. Biol. 607, 73-83 (2010).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+protein+microarray+platform+enabling+antibody+profiling+against+denatured+proteins.">A versatile protein microarray platform enabling antibody profiling against denatured proteins.</a> Proteomics Clin. Appl. 7 (5-6), 378-383 (2013).</li><li>Wang, T., Fujioka, H., Drazba, J. A., Sam-Yellowe, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhop-3+protein+conservation+among+Plasmodium.">Rhop-3 protein conservation among Plasmodium.</a> species and induced protection against lethal. 99 (3), 238-252 (2006).</li><li>Yadavalli, R., Ledger, C., Sam Yellowe, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+human+cell+free+expression+for+synthesis+of+malaria+proteins.">In vitro human cell free expression for synthesis of malaria proteins.</a> Parasitol Res. 111 (6), 2461-2465 (2012).</li><li>Machida, K., Masutan, M., Imataka, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Synthesis+in+vitro.:+Cell-Free+Systems+Derived+from+Human+Cells.">Protein Synthesis in vitro.: Cell-Free Systems Derived from Human Cells.</a> Intech. , (2012).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantification+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li></ol>

We do not have any competing financial interests in this study.

インビトロのヒト細胞の無料発現系および精製を2段階を使用して、タンパク質の発現の成功のための重要なステップは次のとおりです。1）増幅の成功とpT7CFE·チスのプラスミドベクターへの遺伝子のクローニング; 2）30°CのでRNAを転写。 RNA分解酵素阻害剤の存在下で30℃でのタンパク質の3）翻訳; 4）ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を用いたウエスタンブロットで分析?...

マラリア研究では、原核細胞または真核細胞に基づく系を用いて免疫原性タンパク質の発現が課題です。 マラリア原虫ゲノムの豊かさと未知の翻訳後の機構14,7 AT、抗体産生およびワクチン研究のために、適切に折り畳まれ、免疫原性タンパク質を得ることに関連する困難に貢献しています。 大腸菌などの原核生物系は、組換えタンパク質の発現のために使用されています。原核細胞系は、効果的な低コストであり、組換えタンパク質の高収量を産生します 複数のクローニングベクターを持っています。 E.ホストcoli細胞は、変換が容易であり、細胞が急速に成長します。しかしながら、原核生物のシステムは、アミノ酸置換、翻訳後修飾、封入体24内の汚染、異種の製品、および組換えタンパク質の蓄積の危険性の欠如などの限界があります。 でMehlin らの研究（2006）、1000年のオープンリーディングフレーム（ORF）を発現させました。発現されたタンパク質の約7％は、可溶性14でした。観察された不溶性は、遺伝子のバイアスされた自然と豊かなゲノム14 AT マラリア原虫によって理想的に使用されるコドンの高周波によるものです。この問題を克服するための別の戦略は、周波数3と一致する稀なコドンまたはコドンを認識するtRNAを含むプラスミドまたは宿主細胞を使用して開発されてきました。であってもこれらの最適化を行った後、タンパク質の非常に小さい部分が、可溶性の活性および免疫原性14として表されています。無細胞発現系は、リボソーム、開始因子、伸長因子（翻訳因子）、tRNAとアミノアシルtRNAシンテターゼのような転写および翻訳に必要なすべてのコンポーネントを含みます。両方の転写および翻訳反応を、一段階手順11,29に接続されています。 transcrimRNAの適切な量は、異なるチューブ11,29に翻訳機構とインキュベートする前に、ption反応管中で行われます。これらの方法は、 プラスモディウム属タンパク質の発現に成功しているが、主な欠点は、約22時間29であるタンパク質の発現のための時間の長さです。また、プロトコル29に含めるための供給の高コストでは、成分製剤中の細胞溶解物との不整合の労働集約的な調製物は、これらのシステムは実現不可能にします。無細胞発現系の開発のための研究の主な焦点は、このような急速な遺伝子改変、高濃度とまっすぐ溶解液調製1と高速利回りなどの要因に依存します。 酵母、哺乳動物細胞株、バキュロウイルス媒介発現系、 テトラヒメナthermophilia、細胞性粘菌と寄生発現システムのsuのような真核生物のシステムリーシュマニアなどのCHは、組換えタンパク質の発現7のために使用されています。真核生物系は、系統発生的関係を共有し、したがって、グリコシル化、アシル化、ジスルフィド結合形成、シャペロン相互作用、タンパク質分解および細胞下区画などの特性を共有しています。真核生物におけるタンパク質分泌イベントが蓄積するのを防止し、発現システム13のための毒性を減少させます。彼らは大規模タンパク質発現のための、高収量4を得るのに適しているとして、酵母系を使用することが好ましいです。二P.熱帯熱マラリア原虫タンパク質 PfCP-29及びPvs25は、酵母系4を用いて製造しました。しかし、ほとんどのタンパク質の合成における主要な欠点は、それらの天然の形態4からのタンパク質の不規則なN及びO-グリコシル化パターン、不適切な折りたたみと切り捨てました。 組換えタンパク質の合成のための哺乳動物細胞の使用は、労働集約的であり、それはexpenあります安定な組換え細胞株4を維持するためにSIVE。従って、哺乳動物細胞は、タンパク質のシグナル伝達、タンパク質相互作用及び寄生虫宿主相互作用の分析のために制限されており、また、DNAワクチンを試験するための4。本明細書中に記載のインビトロタンパク質発現の無細胞系におけるヒトDNAおよびmRNAは3時間でタンパク質を発現するHeLa細胞由来の哺乳動物ベースのシステムです。タンパク質を同定および精製を容易にするC末端タグを持っpT7CFE1-CHISの発現ベクターを用いて発現させました。 HeLa細胞ベースのシステムは、それによって翻訳システムの効率を向上させる、翻訳開始因子および翻訳調節が補充されます。タンパク質は、急速に、翻訳スクリーニング、確認、および様々な免疫学的および構造15の用途で使用するために処理することができます。 このような小麦胚芽とウサギ網状赤血球などの真核細胞を含まない発現系は、現在、VARの発現のために使用されていますマラリア原虫タンパク質 11,29を含むIOUの真核生物のタンパク質。さらに、E.大腸菌基づく無細胞系もまた、真核生物タンパク質の発現のために使用されている11。 表1は、システムの特徴ならびにタンパク質発現のためのシステムを使用しやすさを比較することによって、別の無細胞発現系をまとめたものです。他と比較してヒト細胞を含まない系は、ポストと共翻訳後修飾を行う能力を有し、かつ安価です。コドン最適化が可能であり、全ての反応は3時間で行うことができます。 HeLa細胞系は、実験室の設定におけるタンパク質合成のための理想的な翻訳系です。 他の無細胞系上のヒト無細胞発現系の主な利点は、異なる器官及び組織に由来するいくつかの異なる細胞株の利用可能性です。無細胞系のいくつかの種類は、細胞株に応じて設計することができます。エキス哺乳動物細胞由来の任意の他の無細胞発現系より大きなタンパク質を合成するためのより高い効率を有します。これらの無細胞発現系はまた、マイクロアレイ30として診断およびタンパク質特徴付け用途に使用することができます。人気のあるHeLa細胞株は、最も広くタンパク質33の発現を行うために使用されます。 HeLa細胞株での小胞体は、翻訳後グリコシル化修飾活性33の不在をもたらす、未発達です。 マラリア原虫はまた、グリコシル化の翻訳後修飾を欠く29しかし、このシステムは、 マラリア原虫のタンパク質合成のために有利で ​​あると考えられます。 HeLa細胞無細胞転写翻訳プロトコルは、安価で実施が容易であり、タンパク質を精製し、さらに下流の適用の準備ができて、90分で表すことができます。

<table><tbody><tr><td>2-step &lt;em&gt;in vitro&lt;/em&gt; human cell free expression system</td><td>Thermo Fisher</td><td>88856</td><td>Discontinued. Always store at -80 &amp;deg;C. Do not thaw in warm water</td></tr><tr><td>1-step &lt;em&gt;in vitro&lt;/em&gt; coupled translation system</td><td>Thermo fischer</td><td>88860</td><td>Always store at -80 &amp;deg;C. Do not thaw in warm water</td></tr><tr><td>ProBond Purification system</td><td>Invitrogen</td><td>K850-01</td><td>Store at RT</td></tr><tr><td>Probond Nickel-Chelating Resin</td><td>Invitrogen</td><td>R801-01</td><td>Store at 4&lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C.</td></tr><tr><td>A+ Human Blood</td><td>Interstate Blood Bank</td><td></td><td>Store at 4 &amp;deg;C.</td></tr></tbody></table>

hela based cell free expression systems for expression of plasmodium rhoptry proteins

マラリアは、重要な世界的な罹患率および死亡率の原因となります。いいえルーチンワクチンは現在利用できません。ワクチンの欠如の主な理由の一つは、適切なワクチン候補を同定する課題です。マラリアタンパク質ベースの発現系が不完全にグリコシル化一般に不溶性及び免疫原性の低下につながる不適切なフォールディングを受けている原核および真核細胞を用いて発現させました。小麦胚芽、ウサギ網状赤血球溶解物および大腸菌溶解物の無細胞発現系は、現在、マラリアタンパク質の発現のために使用されます。しかし、発現時間およびタンパク質の不適切なグリコシル化の長さは、依然として課題のまま残されています。我々は、「 インビトロのヒト無細胞発現系」と呼ばれる、ヒーラ基づく無細胞発現系を用いてインビトロでマラリア原虫タンパク質の発現を示します。 2 HeLa細胞ベースの無細胞発現系では75分とtranscribの3μlの中のmRNAを転写しますED mRNAは、90分でタンパク質を翻訳するのに十分です。 1段階の発現系は、転写および翻訳結合発現系です。転写および同時翻訳が3時間で発生します。プロセスはまた、追加のエネルギーを提供することによって、6時間延長することができます。 2段階の発現系では、mRNAは、最初に転写され、次いで、タンパク質の発現のための翻訳混合物に加えました。私たちは、マラリアのタンパク質を発現する方法について説明します。疎水性PF3D7_0114100マウラーの裂 - 2貫通（PFMC-2TM）タンパク質、親水性PF3D7_0925900タンパク質およびタンパク質PF3D7_1361800を含むアルマジロリピート、HeLa細胞ベースの無細胞発現系を使用して。タンパク質は、2段と1段の発現戦略を採用したマイクロボリュームで表されています。アフィニティー精製の ​​方法も記載されているインビトロのヒト無細胞発現系を用いて発現されたタンパク質の25μLを精製します。タンパク質の収率は、ブラッドフォードアッセイによって決定され、発現されそして精製されたタンパク質は、ウェスタンブロット分析により確認することができます。発現された組換えタンパク質は、免疫化、免疫アッセイおよびタンパク質配列決定のために使用することができます。

特異的抗体との反応性を介して発現された組換えタンパク質の検証は、発現されたタンパク質の適切なフォールディングを確認する上で重要な最初のステップです。組換えマラリアタンパク質は、1つのステップと、インビトロのヒト無細胞発現系における2つの段階を用いて発現させました。組換えタンパク質をNiキレートアフィニティー法により精製されます。私たちはその後、組換えタン...

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HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins

セルベースの​​システムにおけるマラリアのタンパク質の発現は、依然として厳しいです。我々は、HeLa細胞からマラリアrhoptry組換えタンパク質を発現するための2つのステップと、一段階IVT（ インビトロ翻訳 ）無細胞発現系を示します。我々はrhoptryタンパク質を精製するのNi-樹脂親和性に基づく精製システムを使用しています。

の発現のためのHeLaベースの無細胞発現系<em&gt;マラリア原虫</em&gt; Rhoptryタンパク質

Malaria causes significant global morbidity and mortality. No routine vaccine is currently available. One of the major reasons for lack of a vaccine is ...

hela-based-cell-free-expression-systems-for-expression-plasmodium

Research

JoVE Journal

Biology

HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins

12.0K ビュー.  Cleveland State University. セルベースの​​システムにおけるマラリアのタンパク質の発現は、依然として厳しいです。我々は、HeLa細胞からマラリアrhoptry組換えタンパク質を発現するための2つのステップと、一段階IVT（ インビトロ翻訳 ）無細胞発現系を示します。我々はrhoptryタンパク質を精製するのNi-樹脂親和性に基づく精製システムを使用しています。 

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Modifying Baculovirus Expression Vectors to Produce Secreted Plant Proteins in Insect Cells

It has been a challenge for scientists to express recombinant secretory eukaryotic proteins for structural and biochemical studies. The baculovirus-mediated insect cell expression system is one of the systems used to express recombinant eukaryotic secretory proteins with some post-translational modifications. The secretory proteins need to be routed through the secretory pathways for protein glycosylation, disulfide bonds formation, and other post-translational modifications. To improve the existing insect cell expression of secretory plant proteins, a baculovirus expression vector is modified by the addition of either a GP67 or a hemolin signal peptide sequence between the promoter and multiple-cloning sites. This newly designed modified vector system successfully produced a high yield of soluble recombinant secreted plant receptor proteins of Arabidopsis thaliana. Two of the expressed plant proteins, the extracellular domains of Arabidopsis TDR and PRK3 plasma membrane receptors, were crystallized for X-ray crystallographic studies. The modified vector system is an improved tool that can potentially be used for the expression of recombinant secretory proteins in the animal kingdom as well.

Here, we present the protocols for utilizing the insect cell and baculovirus protein expression system to produce large quantities of plant secreted proteins for protein crystallization. A baculovirus expression vector has been modified with either GP67 or insect hemolin signal peptide for plant protein secretion expression in insect cells.

植物昆虫細胞でのタンパク質を分泌生産するバキュロ ウイルス発現ベクターを変更します。

It has been a challenge for scientists to express recombinant secretory eukaryotic proteins for structural and biochemical studies. The ...

生化学

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of free merozoites from the blood by phagocytic cells. However assessing the functional efficacy of merozoite specific opsonizing antibodies is challenging due to the short half-life of merozoites and the variability of primary phagocytic cells. Described in detail herein is a method for generating viable merozoites using the E64 protease inhibitor, and an assay of merozoite opsonin-dependent phagocytosis using the pro-monocytic cell line THP-1. E64 prevents schizont rupture while allowing the development of merozoites which are released by filtration of treated schizonts. &#160;Ethidium bromide labelled merozoites are opsonized with human plasma samples and added to THP-1 cells. Phagocytosis is assessed by a standardized high throughput protocol. Viable merozoites are a valuable resource for assessing numerous aspects of P. falciparum biology, including assessment of immune function. Antibody levels measured by this assay are associated with clinical immunity to malaria in naturally exposed individuals. The assay may also be of use for assessing vaccine induced antibodies. &#160;

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

Measuring antibody function is key to understanding immunity to Plasmodium falciparum malaria. This method describes the purification of viable merozoites, and measurement of opsonization-dependent phagocytosis by flow cytometry.

高収率の精製<em&gt;熱帯熱マラリア原虫</emオプソニン抗体アッセイにおける使用のための&gt;メロゾイト

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

免疫・感染学

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The molecular basis of this resistance, which is known to be multifactorial, remains incompletely understood. Recent studies found that the differential expression of erythrocyte microRNAs, once translocated into malaria parasites, affect both gene regulation and parasite growth. These miRNAs were later shown to inhibit mRNA translation by forming a chimeric RNA transcript via 5&#39; RNA fusion with discreet subsets of parasite mRNAs. Here, the techniques that were used to study the functional role and putative mechanism underlying erythrocyte microRNAs on the gene regulation and translational potential of P. falciparum, including the transfection of modified synthetic microRNAs into host erythrocytes, will be detailed.&#160; Finally, a polysome gradient method is used to determine the extent of translation of these transcripts. Together, these techniques allowed us to demonstrate that the dysregulated levels of erythrocyte microRNAs contribute to cell-intrinsic malaria resistance of sickle erythrocytes.

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

Human microRNAs translocate from host erythrocytes to Plasmodium falciparum parasites. Here, the techniques used to transfect synthetic microRNAs into host erythrocytes and isolate all RNAs from P. falciparum are described. In addition, this paper will detail a method of polysome isolation in P. falciparum to determine the ribosomal occupancy and translational potential of parasite transcripts.

小さなRNAおよびリボソームの占有の調節の役割を調査する方法<em&gt;熱帯熱マラリア原虫</em

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The ...

A Convenient and General Expression Platform for the Production of Secreted Proteins from Human Cells

Recombinant protein expression in bacteria, typically E. coli, has been the most successful strategy for milligram quantity expression of proteins. However, prokaryotic hosts are often not as appropriate for expression of human, viral or eukaryotic proteins due to toxicity of the foreign macromolecule, differences in the protein folding machinery, or due to the lack of particular co- or post-translational modifications in bacteria. Expression systems based on yeast (P. pastoris or S. cerevisiae) 1,2, baculovirus-infected insect (S. frugiperda or T. ni) cells 3, and cell-free in vitro translation systems 2,4 have been successfully used to produce mammalian proteins. Intuitively, the best match is to use a mammalian host to ensure the production of recombinant proteins that contain the proper post-translational modifications. A number of mammalian cell lines (Human Embryonic Kidney (HEK) 293, CV-1 cells in Origin carrying the SV40 larget T-antigen (COS), Chinese Hamster Ovary (CHO), and others) have been successfully utilized to overexpress milligram quantities of a number of human proteins 5-9. However, the advantages of using mammalian cells are often countered by higher costs, requirement of specialized laboratory equipment, lower protein yields, and lengthy times to develop stable expression cell lines. Increasing yield and producing proteins faster, while keeping costs low, are major factors for many academic and commercial laboratories.
Here, we describe a time- and cost-efficient, two-part procedure for the expression of secreted human proteins from adherent HEK 293T cells. This system is capable of producing microgram to milligram quantities of functional protein for structural, biophysical and biochemical studies. The first part, multiple constructs of the gene of interest are produced in parallel and transiently transfected into adherent HEK 293T cells in small scale. The detection and analysis of recombinant protein secreted into the cell culture medium is performed by western blot analysis using commercially available antibodies directed against a vector-encoded protein purification tag. Subsequently, suitable constructs for large-scale protein production are transiently transfected using polyethyleneimine (PEI) in 10-layer cell factories. Proteins secreted into litre-volumes of conditioned medium are concentrated into manageable amounts using tangential flow filtration, followed by purification by anti-HA affinity chromatography. The utility of this platform is proven by its ability to express milligram quantities of cytokines, cytokine receptors, cell surface receptors, intrinsic restriction factors, and viral glycoproteins. This method was also successfully used in the structural determination of the trimeric ebolavirus glycoprotein 5,10.
In conclusion, this platform offers ease of use, speed and scalability while maximizing protein quality and functionality. Moreover, no additional equipment, other than a standard humidified CO2 incubator, is required. This procedure may be rapidly expanded to systems of greater complexity, such as co-expression of protein complexes, antigens and antibodies, production of virus-like particles for vaccines, or production of adenoviruses or lentiviruses for transduction of difficult cell lines.

In the post-human genomics era, the availability of recombinant proteins in native conformations is crucial to structural, functional and therapeutic research and development. Here, we describe a test- and large-scale protein expression system in human embryonic kidney 293T cells that can be used to produce a variety of recombinant proteins.

ヒト細胞から分泌タンパク質の生産のための便利で一般式プラットフォーム

Recombinant protein expression in bacteria, typically E. coli, has been the most successful strategy for milligram quantity expression of proteins. ...

生物学

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 protein variants encoded by the var genes.
The haploid P. falciparum genome harbors approximately 60 different var genes of which only one has been believed to be transcribed per cell at a time during the blood stage of the infection. How such mutually exclusive regulation of var gene transcription is achieved is unclear, as is the identification of individual var genes or sub-groups of var genes associated with different receptors and the consequence of differential binding on the clinical outcome of P. falciparum infections. Recently, the mutually exclusive transcription paradigm has been called into doubt by transcription assays based on individual P. falciparum transcript identification in single infected erythrocytic cells using RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) analysis of var gene transcription by the parasite in individual nuclei of P. falciparum IE1.
Here, we present a detailed protocol for carrying out the RNA-FISH methodology for analysis of var gene transcription in single-nuclei of P. falciparum infected human erythrocytes. The method is based on the use of digoxigenin- and biotin- labeled antisense RNA probes using the TSA Plus Fluorescence Palette System2 (Perkin Elmer), microscopic analyses and freshly selected P. falciparum IE. The in situ hybridization method can be used to monitor transcription and regulation of a variety of genes expressed during the different stages of the P. falciparum life cycle and is adaptable to other malaria parasite species and other organisms and cell types.

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

Fluorescent in situ hybridization (FISH) to identify mRNA transcripts in individual cells allows analysis of polygenic activity such as the simultaneous transcription of more than one member of the var multigene family in Plasmodium falciparum infected erythrocytes 1. The technique is adaptable and can be used on different types of genes, cells and organisms.

RNAの蛍光による単一細胞遺伝子転写の解析<em&gt; in situで</em&gt;ハイブリダイゼーション（FISH）

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

Generating Genetically Modified Plasmodium berghei Sporozoites

Malaria is a deadly disease caused by the parasite Plasmodium and is transmitted through the bite of female Anopheles mosquitoes. The sporozoite stage of Plasmodium deposited by mosquitoes in the skin of vertebrate hosts undergoes a phase of mandatory development in the liver before initiating clinical malaria. We know little about the biology of Plasmodium development in the liver; access to the sporozoite stage and the ability to genetically modify such sporozoites are critical tools for studying the nature of Plasmodium infection and the resulting immune response in the liver. Here, we present a comprehensive protocol for the generation of transgenic Plasmodium berghei sporozoites. We genetically modify blood-stage P. berghei and use this form to infect Anopheles mosquitoes when they take a blood meal. After the transgenic parasites undergo development in the mosquitoes, we isolate the sporozoite stage of the parasite from the mosquito salivary glands for in vivo and in vitro experimentation. We demonstrate the validity of the protocol by generating sporozoites of a novel strain of P. berghei expressing the green fluorescent protein (GFP) subunit 11 (GFP11), and show how it could be used to investigate the biology of liver-stage malaria.

Generating Genetically Modified Plasmodium berghei Sporozoites

Malaria is transmitted through inoculation of the sporozoite stage of Plasmodium by infected mosquitoes. Transgenic Plasmodium has allowed us to understand the biology of malaria better and has contributed directly to malaria vaccine development efforts. Here, we describe a streamlined methodology to generate transgenic Plasmodium berghei sporozoites.

遺伝子組換え マラリア原虫ベルヘイ ・スポロゾイトの生成

Malaria is a deadly disease caused by the parasite Plasmodium and is transmitted through the bite of female Anopheles mosquitoes. The sporozoite stage of ...

Recombinant Protein Expression for Structural Biology in HEK 293F Suspension Cells: A Novel and Accessible Approach

The expression and purification of large amounts of recombinant protein complexes is an essential requirement for structural biology studies. For over two decades, prokaryotic expression systems such as E. coli have dominated the scientific literature over costly and less efficient eukaryotic cell lines. Despite the clear advantage in terms of yields and costs of expressing recombinant proteins in bacteria, the absence of specific co-factors, chaperones and post-translational modifications may cause loss of function, mis-folding and can disrupt protein-protein interactions of certain eukaryotic multi-subunit complexes, surface receptors and secreted proteins. The use of mammalian cell expression systems can address these drawbacks since they provide a eukaryotic expression environment. However, low protein yields and high costs of such methods have until recently limited their use for structural biology. Here we describe a simple and accessible method for expressing and purifying milligram quantities of protein by performing transient transfections of suspension grown HEK (Human Embryonic Kidney) 293F cells.

The expression of recombinant proteins by mammalian systems is becoming an attractive method for producing protein complexes for structural biology. Here we present a simple yet highly efficient expression system using suspension grown mammalian cells to purify protein complexes for structural studies.

HEK 293F懸濁細胞における構造生物学のための組換えタンパク質の発現：小説とアクセアプローチ

The expression and purification of large amounts of recombinant protein complexes is an essential requirement for structural biology studies. For over two ...

<meta charset="utf8"></head><body>Leishmania Translational Extract(LTE)生産のための合理化されたプロトコール

Production and Optimization of LTE, a Leishmania tarentolae Derived Cell-Free Protein Expression System for Recombinant Protein Production

This protocol outlines the production and optimization of a eukaryotic Cell-Free Protein Expression System (CFPS) derived from the unicellular flagellate Leishmania tarentolae, referred to as Leishmania Translational Extract or LTE. Although this organism originally evolved as a parasite of geckos, it can be cultivated easily and inexpensively in flasks or bioreactors. Unlike Leishmania major, it is non-pathogenic to humans and does not require special laboratory precautions. Another advantage of using Leishmania for CFPS is that the addition of a single antisense oligonucleotide to the CFPS, targeting a conserved splice leader sequence on the 5'-end of all protein-coding RNAs, can suppress endogenous protein expression. We provide procedures for cell disruption and lysate processing, which have been simplified and improved compared to previous versions. These procedures start with simple flask cultures. Additionally, we explain how to introduce genetic information using vectors containing species-independent translation initiation sites (SITS) and how to perform straightforward batch optimization and quality control to ensure consistent protein expression quality.

<meta charset="utf8"></head><body>著者スポットライト:LTE 真核生物の無細胞タンパク質発現システムを使用したタンパク質生産

Leishmania Translational Extract (LTE) is a eukaryotic cell-free protein expression system derived from the single-celled parasite, Leishmania tarentolae. This optimized protocol makes LTE simple and cost-effective to manufacture. It is suitable for various applications focused on the multiparallel expression and study of complex eukaryotic proteins and their interactions.

リーシュマニアタレントラエ由来の無細胞タンパク質発現システムであるLTEの作製と最適化

This protocol outlines the production and optimization of a eukaryotic Cell-Free Protein Expression System (CFPS) derived from the unicellular flagellate ...

の発現のためのHeLaベースの無細胞発現系

要約

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植物昆虫細胞でのタンパク質を分泌生産するバキュロウイルス発現ベクターを変更します。

高収率の精製

小さなRNAおよびリボソームの占有の調節の役割を調査する方法

ヒト細胞から分泌タンパク質の生産のための便利で一般式プラットフォーム

RNAの蛍光による単一細胞遺伝子転写の解析

遺伝子組換えマラリア原虫ベルヘイ・スポロゾイトの生成

HEK 293F懸濁細胞における構造生物学のための組換えタンパク質の発現：小説とアクセアプローチ

リーシュマニアタレントラエ由来の無細胞タンパク質発現システムであるLTEの作製と最適化

リーシュマニアタレントラエ由来の無細胞タンパク質発現システムであるLTEの作製と最適化

リーシュマニアタレントラエ由来の無細胞タンパク質発現システムであるLTEの作製と最適化

の発現のためのHeLaベースの無細胞発現系

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植物昆虫細胞でのタンパク質を分泌生産するバキュロ ウイルス発現ベクターを変更します。

高収率の精製

小さなRNAおよびリボソームの占有の調節の役割を調査する方法

ヒト細胞から分泌タンパク質の生産のための便利で一般式プラットフォーム

RNAの蛍光による単一細胞遺伝子転写の解析

遺伝子組換え マラリア原虫ベルヘイ ・スポロゾイトの生成

HEK 293F懸濁細胞における構造生物学のための組換えタンパク質の発現：小説とアクセアプローチ

リーシュマニアタレントラエ由来の無細胞タンパク質発現システムであるLTEの作製と最適化

リーシュマニアタレントラエ由来の無細胞タンパク質発現システムであるLTEの作製と最適化

リーシュマニアタレントラエ由来の無細胞タンパク質発現システムであるLTEの作製と最適化

植物昆虫細胞でのタンパク質を分泌生産するバキュロウイルス発現ベクターを変更します。

遺伝子組換えマラリア原虫ベルヘイ・スポロゾイトの生成