This research was supported by Cleveland State University Faculty Development Funds.

Parazit Hücre Kültürleri 1. Hazırlık, Parazit Peletleri Koleksiyonu <ol><li> 1 L RPMI-1640 tozun 10 g, gentamisin sülfat, 66 mg, 2 g sodyum bikarbonat, 5.9 g HEPES tamponu, 50 mg hipoksantin ve 3.8 g dekstroz eklenerek RPMI-1640-HEPES ortamları hazırlamak steril dH 2 O 1 L damıtılmış su içinde her türlü toz çözünene kadar Tablo manyetik karıştırıcı ile karıştırın. 0.22 mikron filtre kullanarak medya mikro filtrasyon gerçekleştirin. Steril şişelerde medyayı saklayın. </li><li> Bulaşmamış (taze) yıkayın RPMI kullanarak A + eritrositleri yazın. Eritrositlerin% 5 hematokrit (9.5 mi,% 10 RPMI + insan serumu içinde yıkandı, taze eritrositlerin 0.5 ml) hazırlayın. </li><li> % 15 insan serumu + RPMI (insan serumu ve 15 ml RPMI 85 mi) parazitlerin ekimi başlatmak için yapın. % 10 insan serumu ve RPMI (insan serumu ve 10 ml RPMI 90 mi), kırmızı kan hücreleri parazitlerin kültürlenmesini devam edin. </li><li> Kültür P. falsiparum (3D7 ve FCR-3 suşları) tip% 5 ve% 20 hematokrit parazitemya petri veya 75 cm 3 kültür şişesi A + insan eritrosit. Trager ve Jensen mum kavanozu 26 yöntemine göre, in vitro olarak kültür muhafaza edin. Alternatif olarak, kültürler% 9.5 CO2 ve% 3.4 N2 gazı muhafaza 37 ° C&#39;de inkübatör içinde korumaktadır. Kültür P. falciparum&#39;un RPMI 1640-HEPES ortam,% 10 insan serumu ile takviye edilmiştir. </li><li> P. senkronize % 65 Percoll kültürüne (Percoll + insan serum olmadan RPMI-1640 içinde 35 mi, 65 ml) ilave edilerek falciparum kültürü 27 konsantre edilir. </li><li> 3 kat sonuçlanan 5 dakika 2500 xg&#39;de Percoll&#39;un kültür konsantresini santrifüjleyin. Dikkatle, bir transfer pipet kullanarak aseptik koşullarda 27 altında ayrı bir tüp içine orta tabaka transferi schizontsun izole. </li><li> 5 dakika boyunca 7500 x g&#39;de santrifüjleme ile, fazla Percoll temizlemek için iki kez% 10 insan serumu + RPMI-1640 ile izole edilmiş kültürleri yıkayın. DiSüpernatan, aseptik koşullar altında 27 her scard. </li><li> Senkronize P. kültürleme Devam % 10 insan serumu + 27 RPMI-1640 falciparum şizont. </li><li> 10 mM Tris pH 8.8 ile Plasmodium enfekte olan eritrositlerin tedavisi ve 15 dakika 23 15000 xg&#39;de santrifüjleme ile schizontsun toplayın. Peletlere proteaz inhibitörü (aprotinin) içinde 5 ul ilave edildikten sonra -70 ° C&#39;de saklayın, parazit topakları. Protein ekstre etme, genomik DNA izolasyonu ve RNA izolasyonu için parazit topakları kullanın. </li></ol> 2. plazmid vektörünün hazırlanması <ol><li> P. genomik DNA izole yaklaşık% 20 parazitemya kültürlerinden hazırlanabilir falsiparum şizont peletler. </li><li> Bir mikrosantrifüj tüpü içinde peletlere pH 7.6 olan 10 mM Tris-HCI, 50 mM EDTA, pH 8.0,% 0.1 SDS ve 1 mg / ml proteinaz K, 600 ul ekle 26 G iğne takılı bir 1 ml şırınga ile pelet homojenleştirin. Şırınga doldurma AlternatifPelet karışımı bir mikrosantrifüj tüpü içine boşalma 20 kez. Bir 50 ° C su banyosu içinde tüp içeren homojenat O / N inkübe edin. </li><li> P + C, 600 ul (300 ul fenol ve kloroform 300 ul) homojenize edilmiş pelet eklenerek, kloroform (P + C) çıkarma - fenol gerçekleştirin. Cap tüpü sıkıca ve tüp uçtan uca ters çevirerek kuvvetlice karışımı sallayın. 2 dakika için 14,000 x g&#39;de santrifüjleyin ve tüp yeni bir mikrosantrifüj tüpü içine bir mikropipet kullanılarak, üst sulu çözelti toplar. İki kez bu adımı yineleyin. </li><li> Aşama 2.1.2 yeni bir tüp içinde, sulu tabaka kloroform 600 ul ekle. 2 dakika için 14,000 x g&#39;de 10 saniye ve santrifüj tüpü vorteksleyin. Bir mikropipet ile üst sulu tabaka ölçün ve yeni bir mikrosantrifüj tüp transfer. </li><li> Sulu, yumurtlama (sulu katman, 300 ul 5 M sodyum asetat pH izopropanol 5.5 + 330 ul, 30 ul ise), 5 M sodyum asetat pH 5.5 ve 0.1 hacim izopropanol ile 1 hacim eklemeadım 2.1.3 den er. 15 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin tüpü. </li><li> DNA pelet çökeltmek için 10 dakika için 14,000 x g&#39;de santrifüjleyin tüpü. Süpernatant atılır ve DNA fazla tuzu çıkarmak için% 70 etanol içinde 100 ul (etanol içinde 70 ul ve dH 2 O 30 ul) ile pelet yıkayın. -20 ° C&#39;de dH 2 O 50 ul saklayın DNA arasında değişir. </li><li> P. yükseltilmesi için elle ileri Tasarım ve yazılımı kullanarak ters primerleri veya Tablo 2&#39;de gösterildiği gibi, falsiparum genleri PF3D7_1361800, PF3D7_0925900, PF3D7_1436300 ve PF3D7_0114100 önce proteome çalışmaları sentezleme plasmidi pT7CFE1-CHIS&#39;in çoklu klonlama sitelerinin gen dizilerinin klonlanması izin vermek için uygun sınırlama siteleri ile 16,18 tespit etmesidir. </li><li> Ilave bir 50 ul reaksiyon karışımı yapmak; Izole edilmiş P. 5 ul falsiparum genomik DNA&#39;sı, 10x tampon 5 ul, MgCl2 5ul, ileri primer, 1.5 ul, 1.5 ulters primer, T7 DNA polimerazı 0.5 ul dH 2 O 31.5 ul ve denatürasyon için 8 dakika boyunca 94 ° C &#39;de, polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) yerine, uzatma 1 dakika 30 saniye için 50 ° C, 9 72 ° C Tablo 1 &#39;de gösterilen genlerin amplifiye edilmesi için tavlama ve renatürasyon için min. </li><li> % 1 agaroz jeli (agaroz 1 g Tris asetat EDTA, 100 ml (TAE) tamponu) 32 ile ayrı ayrı PCR ürünleri. </li><li> Agaroz jelinden PCR ile çoğaltılan DNA bantları kesin bir DNA jel özütleme spin kolon DNA ihtiva eden jel dilimleri yerleştirmek ve 5 dakika boyunca -20 ° C&#39;de dondurun. 5 dakika için 14,000 x g&#39;de donmuş jel dilimlerinin ve santrifüj izopropanol 100 ul ekle. </li><li> Mikropipet kullanılarak sulu akış yoluyla adım 2.5 arasında bir toplama tüpü içinde, süzüldü ölçülür ve yeni bir tüpe aktarılır. 5 dakika için 14,000 x g&#39;de 5 M sodyum asetat ve santrifüj 0.1 hacim ekleyin. Süpernatantı atın ve inci dH 2 O 10 ulE DNA pelleti. </li><li> Plazmid 3 ul ve her bir tüpe, PCR gen ürünlerinin 5 ul ekleyerek iki ayrı tüplerde pT7CFE1-CHIS ekspresyon vektörü ve (2.6) ile birlikte saflaştınlmış DNA fragmanlarının Digest. Her bir tüpe belirli bir kısıtlama enzimleri 1 ul reaksiyon tampon maddesi, 2 ul ve dH 2 O 14 ul ekle </li><li> Sindirilmiş plasmid 3 ul, sindirilmiş DNA fragmanlarının 5 ul 10x ligaz tampon maddesi, 2 ul, ligaz 1 ul bir mikrosantrifüj tüpü içinde dH 2 O 9 ul ekle. 12 ° CO / N inkübe. </li><li> PH 5.5 ve 2 hacim etanol ile 3 M sodyum asetat ve 0.1 hacim ekleme adımında 2.14 tüpe (daki bağlama borular hacmi ise 20 ul 3 M sodyum asetat, etanol içinde, + 44 ul 2 ul). İyice karıştırın ve 15 dakika boyunca -20 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> 15 dakika için 14,000 x g&#39;de santrifüjleyin tüpü. Dikkatle pelet bozmadan mikro pipet kullanarak süpernatant kaldırmak. </li><li> % 70 etanol, t, 100 ul ekleadım 2.10 den pelet o. 5 dakika için 14,000 x g&#39;de santrifüjleyin tüpü. Süpernatantı çıkarın ve atın. DNA pelet nükleaz içermeyen su, 10 ul ekle. </li></ol> Vitro İnsan Hücre Özgür İfade Sistemde Kullanılması 3. Protein Ekspresyonu <ol><li> Rekombinant pT7CFE1-CHIS plazmid DNA, 2 ul 5x transkripsiyon tamponu 4 ul NTP karışımı 4 ul, T7 RNA Polimeraz 2 ul ve nükleaz içermeyen su 8 ul 2-adım için ölçülerek transkripsiyon karışımından 20 ul hazırlanması DNA şablonları kullanarak Vitro Protein Ekspresyonu İnsan. Mikrosantrifüj tüpü içinde karıştırın ve bir su banyosunda 30 ° C&#39;de 75 dakika inkübe edilir. </li><li> Transkripsiyon karışımı 2 ul almak ve HeLa hücre lisatı, 12.5 ul, yardımcı proteinler 2.5 ul tuz çözeltisi A 1 ul, amino asitler 0.5 ul Met, amino asitler 0.5 ul ihtiva eden için karışım 23 ul eklemek Leu, 181; RNaz inhibitörü l, enerji karışımları 1.25 ul ve nükleaz içermeyen su 3.75 ul. </li><li> 90 dakika boyunca 30 ° C &#39;de aşama 3.2 için karışımı inkübe edin. Mağaza -20 ° C&#39;de ürünleri çevrilmiştir. </li><li> 1-adım için rekombinant pT7CFE1-CHIS plasmid DNA 3 ul, nükleaz içermeyen su, 2 ul reaksiyon karışımı 5 ul HeLa lizat 12.5 ul ve yardımcı proteinlerinin 2.5 ul ekleyerek transkripsiyon ve çeviri karışımı 25 ul hazırlanması DNA şablonları İnsan Coupled IVT Protein Ekspresyonu. </li><li> 30 ° C&#39;de 90 dakika ila 6 saat süreyle için adım 3.4 reaksiyon karışımı inkübe edin. Çeviri ürünleri de Mağaza -20 ° C. </li></ol> Sentezlenen rekombinant proteinler, 4. saflaştırılması <ol><li> Bu saflaştırma karışımına 100 ul yapmak için ürünün 25 ul 1x saflaştırma tamponunda 75 ul ekle. </li><li> Saflaştırma mikst 100 ul nikel kenetleme reçinesi 100 ul ekleure. Yıkama Ni-reçine iki kez dH 2 O 300 ul ve bağlayıcı tampon 300 ul ekleyerek. Aşırı etanolü ortadan kaldırmak için 1 dakika için 14,000 x g&#39;de reçine ve santrifüj yeniden askıya. </li><li> Aşama nikel kenetleme reçinesi 4,2-100 ul saflaştırma karışımına 100 ul ilave edin ve oda sıcaklığında 60 dakika süreyle inkübe karışımı. </li><li> 1 dakika boyunca 14.000 xg&#39;de karışımı Santrifüj ve &quot;akışı&quot; olarak etiketlenmiş Taze bir tüp içine süpernatant toplamak. </li><li> 1x yıkama tamponu içinde 100 ul (20 mM imidazol, 250, pH 8 mM NaH 2 PO 4, 2.5 M NaCl ve dH 2 O) ile yıkayın reçinesi. 1 dakika boyunca 14.000 xg&#39;de Santrifüj ve &quot;yıkama&quot; etiketli taze tüp içinde süpernatant toplamak. Adımı yineleyin 4.5 kez. </li><li> 1x elüsyon tamponu 100 ul ekle (pH 8.0, 100 mM imidazol, 250 mM Na-2 PO 4, 2.5 M NaCI ve DH 2 O) reçineye ve 15 dakika boyunca inkübe edin. 1 dakika için 14,000 x g&#39;de santrifüjleyin. İki kez elüsyon adımı yapın. Herzaman &quot;elüat&quot; taze mikrosantrifüj tüpleri ve etiket içine süpernatant toplamak. </li><li> Aşama 4.5 de tarif edildiği gibi yıkanmasından sonra, iki kez reçine yıkayın. Mağaza -20 ° C veya daha düşük sıcaklıklarda aracılığıyla yıkar ve elüsyon örnekleri akış. Reçine, 4 ° C &#39;de muhafaza edilmesi gerekir. SDS-PAGE ve immunoblotting analizi için, her numune için 30 ul kullanın. </li></ol> 5. Coomassie (Bradford) Protein Deneyi 34 <ol><li> Konsantrasyon, standart sığır serum albümini (BSA) çözelti hazırlayın 20 ug / ml, 40 ug / ml (BSA içinde 20 ul karışımı (BSA (2 mg / ml) ve dH 2 O 90 ul 10 ul karışımı) (2 mg / ml) ve DH 2 O), 80 ul, 60 ug / ml ((2 mg BSA (2 mg / ml) ve DH 2 O), 70 ul, 80 ug / ml (BSA içinde 40 ul karışımı 30 ul karıştırın / ml) ve DH 2 O), 60 ul, 100 ug / ml (BSA (2 mg / ml) 50 ul ve DH 2 O) 50 ul, 160 ug / ml (BSA içinde 80 ul mix (2 mg / ml) ve dH 20 ul2 O) ve 200 ug / ml (BSA, 100 ul (2 mg / ml). </li><li> Ölçü aşama 4,7 boyunca akış, yıkama ve elüat numune 5 ul. DH 2 O. 95 ul ekleyin </li><li> Adım 5.1 ve 5.2 arasında karışımlarına Coomassie mavisi reaktif 5 ml. Sn daha sonra oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edilir, 10 için parafilm ve vorteks Tüpleri örtün. </li><li> Bir spektrofotometre kullanılarak, Aşama 5.3 protein borular 650 nm dalga boyunda optik yoğunluk (OD) ölçün. OD okuma vs Plot konsantrasyonu protein konsantrasyonlarını belirlemek için 34. </li></ol> 6. Western Blot <ol><li> P. şizont özler 5 ul ekle falciparum, Escherichia coli 2 ul rekombinant rhOP-3 proteinler 31 belirtilmiştir, yeniden birleştirici proteinlerin 5 ul tüpleri ayırmak için afinite yöntemi kullanılarak 2-adım ve in vitro insan ekspresyon sistemlerinde 1 adım ve protein ürünleri 10 ul saflaştırılmış kullanılarak ifade edilir. </li&gt; <li> Çözündürülmüş protein örnekleri yapmak için 20 ul bir son hacim için, her bir tüpe elektroforez örnek tamponu ihtiva eden merkaptoetanol ekleyin. 2 dakika süreyle tüpleri kaynatın. </li><li> Proteinleri ayırmak için% 10 SDS-PAGE jelleri üzerine çözündürülmüş protein örneklerinin yükleyin. </li><li> 2 saat için bir yarı kuru VVestern blot odasındaki jel başına 35 mA akımda elektroforezlenerek nitroselüloz kağıda (NCP), SDS-PAGE jelleri ayrılmış proteinler aktarın. </li><li> % 2 yağsız süt ile transferi aşağıdaki Blok NCP&#39;ler. </li><li> Inkübe 1 seyreltilmiş aşağıdaki poliklonal antikorlarla NCP&#39;ler bloke: batı blotting gerçekleştirmek için% 2 süt 100; tavşan antikoru P. özgü 676. 21 falsiparum Merozoit rhoptries, P. 20, belirli fare antikorları ve P. yoelii P. özgü berghei Merozoit rhoptries antiserumlar # 685 Maurer için spesifik falsiparum parasitophorous vacuole&#39;nin proteini, SERA (serin bakımından zengin antijeni) 22 ve antikorlar217; s yarık protein KMYK-2TM 28. </li><li> 1 de NCP&#39;ler inkübe: 100 seyreltilmiş normal fare ve tavşan serumu ve SP2 miyelom hücrelerinin harcanan kültürün üzerinde yüzer (SCS) olarak negatif kontroller. </li><li> 4 ºC O / N de antikorlar ve kontroller ile NCP&#39;ler kuluçkaya yatmaktadır. </li><li> Blot ile yıkayın NCP 4x tampon ve yaban turpu peroksidazı (HRP) konjuge edilmiş türler, belirli sekonder antikor ile inkübe NCP suyla 1: 2,% süt 1000. </li><li> Leke tamponu ile yıkayın NCP 4x. Inkübe renk gelişimi çözeltisi ile yıkandı, NCP A + B (Çözelti A: tampon 1x Blot 50ml ekleyebilir ve H2O 2 30 ul; Çözelti B: 10 ml metanol ve 3-kloro-naftol, 30 mg) eklemek için 30 Karanlıkta min. Kolorimetrik western blot sonuçlarını analiz. </li></ol>

<ol>
	<li>Alexandrov, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leishmania.+cell-free+expression+system.">Leishmania. cell-free expression system.</a> Methods. 55 (1), 58-64 (2011).</li><li>Alexandrov, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+the+construction+of+expressed+proteomes+using+a+Leishmania+tarentolae.+based+cell-free+expression+system.">Towards the construction of expressed proteomes using a Leishmania tarentolae. based cell-free expression system.</a> PLOS One. 5 (12), e14388 (2010).</li><li>Baca, A. M., Hol, W. G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+codon+bias:+A+method+for+high-level+over-expression+of+Plasmodium.+and+other+AT-rich+parasite+genes+in+Escherichia+coli.">Overcoming codon bias: A method for high-level over-expression of Plasmodium. and other AT-rich parasite genes in Escherichia coli.</a> Int J Parasitol. 30 (2), 113-118 (2000).</li><li>Birkholtz, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterologous+expression+of+plasmodial+proteins+for+structural+studies+and+functional+annotation.">Heterologous expression of plasmodial proteins for structural studies and functional annotation.</a> Malar. J. 7, 197 (2008).</li><li>Doolan, D. L., Mu, Y., Unal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+humoral+immune+responses+to+P.+falciparum.+infection+with+protein+microarrays.">Profiling humoral immune responses to P. falciparum. infection with protein microarrays.</a> Proteomics. 8 (22), 4680-4694 (2008).</li><li>Endo, Y., Sawasaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+expression+systems+for+eukaryotic+protein+production.">Cell-free expression systems for eukaryotic protein production.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 17 (4), 373-380 (2006).</li><li>Fern&#225;ndez-Robledo, J. A., Vasta, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+recombinant+proteins+from+protozoan+parasites.">Production of recombinant proteins from protozoan parasites.</a> Trends Parasitol. 26 (5), 244-254 (2010).</li><li>Gowda, D. C., Davidson, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+glycosylation+in+the+malaria+parasite.">Protein glycosylation in the malaria parasite.</a> Parasitol. Today. 15 (4), 147-152 (1999).</li><li>Goshima, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+protein+factory+for+converting+the+transcriptome+into+an+in+vitro-expressed+proteome.">Human protein factory for converting the transcriptome into an in vitro-expressed proteome.</a> Nat. Methods. 5, 1011-1017 (2008).</li><li>Hinnebusch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mechanism and regulation of initiator methionyl-tRNA binding to ribosomes. 5, 185-243 (2000).</li><li>Hino, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiency+of+cell-free+protein+synthesis+based+on+a+crude+cell+extract+from+Escherichia+coli.,+wheat+germ,+and+rabbit+reticulocytes.">Efficiency of cell-free protein synthesis based on a crude cell extract from Escherichia coli., wheat germ, and rabbit reticulocytes.</a> Journal of Biotechnology. 133 (2), 183-189 (2008).</li><li>Le Roch, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+gene+function+by+expression+profiling+of+the+malaria+parasite+life+cycle.">Discovery of gene function by expression profiling of the malaria parasite life cycle.</a> Science. 301 (5639), 1503-1508 (2003).</li><li>Makrides, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+achieving+high-level+expression+of+genes+in+Escherichia+coli.">Strategies for achieving high-level expression of genes in Escherichia coli.</a> Microbiol. Rev. 60 (3), 512-538 (1996).</li><li>Mehlin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterologous+expression+of+proteins+from+Plasmodium+falciparum.:+results+from+1000+genes.">Heterologous expression of proteins from Plasmodium falciparum.: results from 1000 genes.</a> Mol. Biochem. Parasitol. 148 (2), 144-160 (2006).</li><li>Mikami, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+cell-derived+in+vitro+coupled+transcription/translation+system+optimized+for+production+of+recombinant+proteins.">A human cell-derived in vitro coupled transcription/translation system optimized for production of recombinant proteins.</a> Protein Expr. Purif. 62 (2), 190-198 (2008).</li><li>Sam-Yellowe, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome+analysis+of+rhoptry:+Enriched+isolated+from+Plasmodium.+merozoites.">Proteome analysis of rhoptry: Enriched isolated from Plasmodium. merozoites.</a> Journal of Proteome Research. 3 (5), 995-1001 (2004).</li><li>Sam-Yellowe, T. Y., Fujioka, H., Aikawa, M., Hall, T., Drazbar, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+falciparum.+protein+located+in+Maurer&#8217;s+clefts+underneath+knobs+and+protein+localization+in+association+with+Rhop-3+and+SERA+in+the+intracellular+network+of+infected+erythrocytes.">Plasmodium falciparum. protein located in Maurer&#8217;s clefts underneath knobs and protein localization in association with Rhop-3 and SERA in the intracellular network of infected erythrocytes.</a> Parasitol Res. 87 (3), 173-185 (2001).</li><li>Sam-Yellowe, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Plasmodium.+gene+family+encoding+Maurer&#8217;s+cleft+membrane+proteins:+Structural+properties+and+expression+profiling.">A Plasmodium. gene family encoding Maurer&#8217;s cleft membrane proteins: Structural properties and expression profiling.</a> Genome Res. 14 (6), 1052-1059 (2004).</li><li>Sam-Yellowe, T. Y., Banks, T. L., Fujioka, H., Drazba, J. A., Yadav, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+yoelii.:+Novel+rhoptry+proteins+identified+within+the+body+of+merozoite+rhoptries+in+rodent+Plasmodium+malaria.">Plasmodium yoelii.: Novel rhoptry proteins identified within the body of merozoite rhoptries in rodent Plasmodium malaria.</a> Exp Parasitol. 120 (1), 113-117 (2008).</li><li>Sam-Yellowe, T. Y., Rio, D., Fujioka, H., Aikawa, M., Yang, J. C., Yakubu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+merozoite+rhoptries,+identification+of+novel+rhoptry+associated+proteins+from+P.+yoelii.,+P.+chabaudi.,+P.+berghei.+and+conserved+interspecies+reactivity+of+organelles+and+proteins+with+P.+falciparum.+rhoptry-specific+antibodies.">Isolation of merozoite rhoptries, identification of novel rhoptry associated proteins from P. yoelii., P. chabaudi., P. berghei. and conserved interspecies reactivity of organelles and proteins with P. falciparum. rhoptry-specific antibodies.</a> Exp Parasitol. 89 (3), 271-284 (1998).</li><li>Sam-Yellowe, T. Y., Fujioka, H., Masamichi, A., Messineo, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+falciparum.+rhoptry+proteins+of+140/130/110kd+(Rhop-H)+are+located+in+an+electron+lucent+compartment+in+the+neck+of+the+rhoptries.">Plasmodium falciparum. rhoptry proteins of 140/130/110kd (Rhop-H) are located in an electron lucent compartment in the neck of the rhoptries.</a> J Euk Microbial. 42 (3), 224-231 (1995).</li><li>Sam-Yellowe, T. Y., Hishashi, F., Masamichi, A., Messineo, D. G., Leash, A. M., Hall, T., Drazba, J. A., Ndengele, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Organization+and+cross+linking+analysis+of+the+Plasmodium+falciparum+erythrocyte+binding+proteins+Rhop-H+and+SERA.">Molecular Organization and cross linking analysis of the Plasmodium falciparum erythrocyte binding proteins Rhop-H and SERA.</a> J Protozool. Res. 10 (3), 128-154 (2000).</li><li>Sam-Yellowe, T. Y., Shio, H., Perkins, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretion+of+Plasmodium+falciparum.+rhoptry+protein+into+plasma+membrane+of+host+erythrocytes.">Secretion of Plasmodium falciparum. rhoptry protein into plasma membrane of host erythrocytes.</a> J Cell Biol. 106 (5), 1507-1513 (1988).</li><li>Sundaresh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+humoral+immune+responses+in+protein+microarrays+using+DNA+microarray+data+analysis+techniques.">Identification of humoral immune responses in protein microarrays using DNA microarray data analysis techniques.</a> Bioinformatics. 22 (14), 1760-1766 (2006).</li><li>Terpe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+bacterial+expression+systems+for+heterologous+protein+production:+from+molecular+and+biochemical+fundamentals+to+commercial+systems.">Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 72 (2), 211-222 (2006).</li><li>Trager, W., Jensen, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+malaria+parasites+in+continuous+culture.">Human malaria parasites in continuous culture.</a> Science. 193 (4254), 673-675 (1976).</li><li>Tsarukyanova, I., Drazba, J. A., Fujioka, H., Yadav, S., Sam-Yellowe, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteins+of+the+Plasmodium+falciparum.+two+transmembrane+Maurer&#8217;s+cleft+protein+family,+PfMC-2TM+and+the+130+kDa+Maurer&#8217;s+cleft+protein+define+different+domains+of+the+infected+erythrocyte+intramembranous+network.">Proteins of the Plasmodium falciparum. two transmembrane Maurer&#8217;s cleft protein family, PfMC-2TM and the 130 kDa Maurer&#8217;s cleft protein define different domains of the infected erythrocyte intramembranous network.</a> Parasitol Res. 104 (4), 875-891 (2009).</li><li>Tsuboi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wheat+germ+cell-free+system-based+production+of+malaria+proteins+for+discovery+of+novel+vaccine+candidates.">Wheat germ cell-free system-based production of malaria proteins for discovery of novel vaccine candidates.</a> Infect. Immun. 76 (4), 1702-1708 (2008).</li><li>Tsuboi, T., Takeo, S., Sawasaki, T., Torii, M., Endo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+approach+to+the+production+of+vaccines+against+the+malaria+parasite.">An efficient approach to the production of vaccines against the malaria parasite.</a> Methods in Mol. Biol. 607, 73-83 (2010).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+protein+microarray+platform+enabling+antibody+profiling+against+denatured+proteins.">A versatile protein microarray platform enabling antibody profiling against denatured proteins.</a> Proteomics Clin. Appl. 7 (5-6), 378-383 (2013).</li><li>Wang, T., Fujioka, H., Drazba, J. A., Sam-Yellowe, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhop-3+protein+conservation+among+Plasmodium.">Rhop-3 protein conservation among Plasmodium.</a> species and induced protection against lethal. 99 (3), 238-252 (2006).</li><li>Yadavalli, R., Ledger, C., Sam Yellowe, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+human+cell+free+expression+for+synthesis+of+malaria+proteins.">In vitro human cell free expression for synthesis of malaria proteins.</a> Parasitol Res. 111 (6), 2461-2465 (2012).</li><li>Machida, K., Masutan, M., Imataka, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Synthesis+in+vitro.:+Cell-Free+Systems+Derived+from+Human+Cells.">Protein Synthesis in vitro.: Cell-Free Systems Derived from Human Cells.</a> Intech. , (2012).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantification+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li></ol>

We do not have any competing financial interests in this study.

vitro insan hücre barındırmayan sentezleme sistemi ve arıtma iki adımı kullanarak proteinin başarılı bir şekilde ifadesi için önemli adımlardır: 1) başarılı bir yükseltme ve pT7CFE-CHIS plazmid vektörü içine genlerin klonlanması; 2) 30 o C RNA transkripsiyonu; RNaz inhibitör varlığında, 30 ° C&#39;de protein 3) yapıldı; 4) poliklonal ve monoklonal antikorlar kullanılarak reçine Ni ve 5 ile kaplı haplar), batı lekesi üzerinde analiz sonuçları kullanılarak afinite bazlı saf...

Sıtma araştırmada, prokaryotik ya da ökaryotik hücre bazlı sistemler kullanılarak imünojenik protein ekspresyonu, bir sorun olmaya devam etmektedir. Plasmodium genomu ve bilinmeyen post-translasyonel mekanizmalar 14,7, AT zenginliği, antikor üretimi ve aşı çalışmaları için uygun bir şekilde katlanmış ve immünojenik proteinlerini elde etmekle bağlantılı güçlükler katkıda bulunur. Escherichia coli gibi prokaryotik sistemlerde rekombinan protein ekspresyonu için kullanılmaktadır. Prokaryotik sistemleri, etkili, düşük maliyetli olan rekombinant proteinin yüksek verimlerinin üretilmesi ve birden çok klonlama vektörleri. E. Ev Sahipliği E. coli hücrelerini dönüştürmek için kolay ve hızlı bir şekilde hücreler büyür. Bununla birlikte, prokaryotik sistemler gibi amino asit ikamesi, post-translasyonel modifikasyon, inklüzyon gövdelerinin 24 içinde kirlenme heterojen ürünlerin ve rekombinant proteinlerin birikmesi riski eksikliği gibi sınırlılıklara sahiptir. IçindeMehlin ve arkadaşları tarafından çalışma. (2006), 1000, açık okuma çerçeveleri (ORF) olarak ifade edildi. Ifade edilen proteinlerin yaklaşık% 7 çözünen 14 idi. gözlenen çözünmeme genlerinin önyargılı doğası ve zengin genom 14 AT Plasmodium tarafından ideal kullanılan kodonların yüksek frekans kaynaklanmaktadır. Bu problemin üstesinden gelmek için bir alternatif strateji, plazmidler veya nadir kodonları ya da frekansları 3 eşleşen kodonları tanıyan tRNAs ihtiva eden konakçı hücreler kullanılarak geliştirilmiştir. Hatta bu en iyi duruma gerçekleştirdikten sonra, proteinler, çok küçük bölümleri, çözülebilir aktif 14 imünojenik olarak ifade edilmiştir. hücresiz sentezleme sistemleri, ribozom, başlatma faktörleri, uzatma faktörleri (çevirileri faktörler), tRNA ve aminoasil-tRNA sentetaz olarak transkripsiyonu ve translasyonu için gerekli olan tüm bileşenleri içerir. Hem transkripsiyon ve translasyon reaksiyonları tek aşamalı prosedür 11,29 içinde birleştirilir. transcrimRNA uygun bir miktar farklı boru 11,29 çeviri makine ile inkübe edilmeden önce ption Reaksiyon tüpü içinde gerçekleştirilir. Bu yöntemler, Plasmodium sp., Protein ekspresyonu başarılı olsa da, önemli bir dezavantajı, yaklaşık 22 saat 29 olan protein ekspresyonu için zaman dilimidir. Buna ek olarak, protokoller 29 eklenmek üzere malzeme yüksek maliyet, bileşen hazırlıkları emek-yoğun hücre lizatının hazırlıkları ve tutarsızlıklar, bu sistemler ulaşılamaz olun. Bir hücre özgür ifade sisteminin geliştirilmesi için araştırmacıların ana odak bu hızlı genetik modifikasyon, yüksek konsantrasyonlarda ve yalındır lisatı hazırlıkları 1 hızlı verim gibi faktörlere bağlıdır. Maya, memeli hücre çizgileri, bakulovirüs dolayımlı sentezleme sistemi, Tetrahymena thermophilia, Dictyostelium discoideum ve parazitik ekspresyon sistemleri su olarak ökaryotik sistemlerdeLeishmania olarak kanal yeniden birleştirici protein ekspresyonu 7 kullanılmaktadır. Ökaryotik sistemler filogenetik ilişkiyi paylaşmak ve bu nedenle de bu tür glikosilasyon, asilleme, disülfür bağı oluşumu, hastabakıcı etkileşimi, proteoliz ve alt hücresel bölümlendirme gibi özelliklere paylaşabilirsiniz. Ökaryotlarda protein salgılanması olayları birikmesini önlemek ve ifade sistemleri 13 toksisite azalır. bunlar, büyük ölçekli protein ekspresyonu için ve yüksek verim 4 elde etmek için uygun olan maya sistemlerinin kullanılması tercih edilir. İki P. falsiparum proteinleri PfCP-29 ve Pvs25 maya sistemi 4 kullanılarak elde edilmiştir. Bununla birlikte, proteinlerin çoğu sentezinde önemli bir dezavantajı, düzensiz N ve O-glikosilasyon modelleri, uygun olmayan katlama ve doğal biçiminde 4 proteinlerin kesme oldu. Rekombinant proteinlerin sentezi için memeli hücrelerinin kullanımı, emek yoğun ve masraflı olup bustabil yeniden birleştirici hücre çizgileri 4 muhafaza etmek sive. Bu nedenle, memeli hücreleri, protein sinyalizasyon, protein etkileşimleri ve parazit konakçı etkileşimleri analiz için sınırlı kalmıştır ve DNA aşıları 4 test etmek için. Burada tarif edilen insan DNA&#39;sı ve mRNA in vitro protein ekspresyonu, hücre içermeyen sistemi 3 saat proteinleri eksprese eden bir HeLa hücre-türevli, memeli-bazlı bir sistemdir. Proteinler kimlik ve saf hale getirilmesini kolaylaştıran bir C-terminali etiket pT7CFE1-CHIS ekspresyon vektörü olan kullanılarak ifade edilir. HeLa tabanlı sistem, böylece çeviri sisteminin etkinliğinin artırılması, çeviri başlatma faktörleri ve çeviri regülatörü ile takviye edilmiştir. Proteinler hızla çevrilmiştir filtrelenmiş, belirlenmiş ve çeşitli immünolojik ve yapısal uygulamalar 15 kullanılmak üzere işlenebilir. Buğday tohumu ve tavşan retikülosit gibi ökaryotik hücre içermeyen sentezleme sistemleri şu anda var ekspresyonu için kullanılanPlasmodium proteinleri de dahil olmak üzere 11,29 ious ökaryotik proteinler. Buna ek olarak, E. E. coli göre hücre içermeyen sistemler de ökaryotik protein ekspresyonu için kullanılmaktadır 11. Tablo 1, sistemin özelliklerinin yanı sıra, protein ekspresyonu için sistemler kullanılarak kolaylığı karşılaştırarak farklı hücre serbest sentezleme sistemleri özetlemektedir. diğerlerine kıyasla insan hücresi serbest sistemi sonrası ve co-translasyonel modifikasyonlar yapmak yeteneğine sahiptir ve daha az pahalıdır. Kodon optimizasyonu da mümkündür ve bütün reaksiyonlar, 3 saat içinde uygulanabilir. HeLa sistem laboratuvar ortamında protein sentezi için ideal bir çeviri sistemidir. Diğer hücre barındırmayan sistemler üzerinde insan hücre serbest sentezleme sistemlerinin önemli bir avantajı, farklı organ ve dokularda türetilen birkaç farklı hücre hatları mevcudiyetidir. Hücresiz sistemlerin pek çok çeşidi, hücre hattı ile ilgili olarak dizayn edilebilir. özütMemeli hücrelerinden türetilen ler başka hücre özgür ifade sistemlerine göre büyük proteinleri sentezlemek için yüksek verimliliğe sahiptir. Bu hücresiz sentezleme sistemleri, aynı zamanda, mikro dizileri 30 gibi teşhis ve protein karakterizasyon uygulamalarında kullanılabilir. Popüler HeLa hücre hatları, en yaygın olarak protein 33 ekspresyonunu gerçekleştirmek için kullanılır. HeLa hücre hatları, endoplazmik retikulum post-translasyonel glikosilasyon modifikasyon aktivitesi 33 yokluğuna yol az gelişmiştir. Bununla birlikte, bu sistem, aynı zamanda, Plasmodium glikosilasyon sonrası değişikliği bir 29 yoksun olarak Plasmodium protein sentezi için yararlı olduğuna inanılmaktadır. HeLa hücre serbest transkripsiyon için protokol, ucuz, kolay uygulanabilir ve proteinlerin saflaştırılması ve daha sonraki alt akış uygulamaları için hazır, 90 dakika içinde ifade edilebilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Two-step in vitro human cell free expression system</td>
			<td>Thermo fischer</td>
			<td>88856</td>
			<td>Discontinued. Always store at -80oC. Do not thaw in warm water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One-step in vitro coupled translation system</td>
			<td>Thermo fischer</td>
			<td>88860</td>
			<td>Always store at -80oC. Do not thaw in warm water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProBond Purification system</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>K850-01</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probond Nickel-Chelating Resin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R801-01</td>
			<td>Store at 4oC.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;A+ Human Blood</td>
			<td>Interstate Blood Bank</td>
			<td></td>
			<td>Store at 4oC.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hela based cell free expression systems for expression of plasmodium rhoptry proteins

Sıtma önemli küresel morbidite ve mortaliteye neden. Hiçbir rutin aşı mevcut değildir. Bir aşının olmaması için en önemli nedenlerinden biri, uygun aşı adayları belirleme mücadeledir. Sıtma proteinleri prokaryotik ve ökaryotik hücre tabanlı ifade sistemleri zayıf düşürülmüş immünojenikliği giden uygunsuz katlama, genellikle çözünmez glıkosıle ve tabi olan kullanarak dile getirdi. buğday tohumu, tavşan retikülosit lizat ve Escherichia coli lisat hücresiz sentezleme sistemleri şu anda sıtma protein ekspresyonu için kullanılmaktadır. Ancak, ifade, zaman ve proteinlerin yanlış glikolizasyonu uzunluğu hala bir sorun olmaya devam etmektedir. Bu &quot;in vitro insan hücre serbest sentezleme sistemleri&quot; olarak adlandırılan HeLa göre hücresiz sentezleme sistemleri kullanılarak in vitro Plasmodium proteinlerin sentezlenmesini göstermektedir. 2 HeLa tabanlı cep özgür ifade sistemleri 75 dakika ve transcrib 3 ul mRNA uyarlamaked mRNA, 90 dakika proteinleri çevirmek yeterlidir. 1 adım sentezleme sistemi, bir transkripsiyon ve translasyon bağlanmış sentezleme sistemidir; transkripsiyonu ve eş için 3 saat içinde oluşur. süreci de ek enerji sağlayarak 6 saat süreyle uzatılabilir. 2 adımlı sentezleme sisteminde, mRNA, ilk transkripsiyonu ve daha sonra protein ekspresyonu için yapıldı karışımına ilave edildi. Biz sıtma proteinleri ifade açıklanmıştır; bir hidrofobik PF3D7_0114100 Maurer&#39;in Yarık - 2 transmembran (KMYKK-2TM) proteini, bir hidrofilik PF3D7_0925900 proteini ve HeLa göre hücresiz sentezleme sistemi kullanılarak protein PF3D7_1361800 ihtiva eden bir armadillonun tekrarlar. Proteinler 2-adım ve 1 adım ifadesi stratejilerini kullanan mikro hacimlerde ifade edilir. Bir afinite saflaştırma yöntemi de tarif edilir ve in vitro insan hücre serbest sentezleme sistemi kullanılarak ifade edilen proteinlerin 25 ul saflaştırmak için. Protein verimi Bradford tahliliyle belirlenir ve ekspreseve saflaştırılmış proteinler Western lekesi analizi ile teyit edilebilir. Sentezlenen rekombinant proteinler, aşılar, bağışıklık ve protein dizilemesi için kullanılabilir.

Spesifik antikorlar ile reaktivite ile eksprese edilen rekombinant proteinleri Doğrulama ifade edilen proteinlerin düzgün katlanmasını teyit önemli bir ilk adımdır. Rekombinant sıtma proteinler bir adım ve in vitro insan hücre özgür ifade sistemlerinde iki adımı kullanarak ifade edildi. Rekombinant proteinler, saflaştırılmış Ni-kelat yapıcı afinite yöntemdir. Daha sonra, SDS-PAGE, ayrılmış yeniden birleştirici proteinlerin western blotting bütün Merozoit rhoptries karşı antisera kullanıl?...

Watch this Scientific Journal Video about HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins at JoVE.com

HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins

Hücre temelli sistemlerde sıtma proteinlerin sentezlenmesi zor kalır. Biz HeLa hücrelerinden sıtma rekombinant proteinleri ifade rhoptry için iki adım ve (in vitro çeviri) bir adım IVT hücresi serbest ifade sistemlerini göstermektedir. Biz rhoptry proteinleri saflaştırmak için bir Ni-afinite reçinesi bazlı saflaştırma sistemini kullanır.

İfadesi için HeLa Tabanlı Hücre Özgür İfade Sistemleri<em&gt; Plasmodium</em&gt; Rhoptry Proteinler

Malaria causes significant global morbidity and mortality. No routine vaccine is currently available. One of the major reasons for lack of a vaccine is ...

hela-based-cell-free-expression-systems-for-expression-plasmodium

Research

JoVE Journal

Biology

HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins

12.0K Görüntüleme.  Cleveland State University.  Hücre temelli sistemlerde sıtma proteinlerin sentezlenmesi zor kalır. Biz HeLa hücrelerinden sıtma rekombinant proteinleri ifade rhoptry için iki adım ve (in vitro çeviri) bir adım IVT hücresi serbest ifade sistemlerini göstermektedir. Biz rhoptry proteinleri saflaştırmak için bir Ni-afinite reçinesi bazlı saflaştırma sistemini kullanır. 

Video: HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

Hazırlık Elektroporasyon murin Kemik İliği itibaren İlköğretim Hematopoetik Hücre Kültürleri

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Biyoloji

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Organik Solvent ve Asetik Asit olmadan Jeller Coomassie G-250 ile Proteinlerin Boyama

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Yüksek Verimli Primer Hücre Transfect Gen Verici MXcell Elektroporasyon Sistemi

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

Gen İfadesi Çalışmaları basitleştirin Otomatik Hücre Sayıcı kullanma: Namalwa Hücreler IL-4 Bağımlı Gen İfadesi siRNA demonte

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Parafin ve Dondurulmuş Bölüm Drosophila Yetişkin Kaslar

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

Active T. in vitro Sulandırma castaneum Telomeraz

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Assessment of GFP Expression and Viability Using the Tali Image-Based Cytometer

Single-cell and population information are commonly obtained either by flow cytometry or fluorescence microscopy. However, these two methods provide different information. Flow cytometry gives quantitative multi-parametric information about physical characteristics and staining or expression, but doesn't allow for visualization. Stand-alone fluorescence microscopy provides visual data, but doesn't allow for straightforward quantitative measurements1.
Image-based cytometry bridges the gap between these two methods, enabling the quick visualization and simultaneous quantitative analysis of thousands of cells in heterogeneous populations2. Here, we present a method for performing cell viability and green fluorescent protein (GFP) expression assays using the Tali Image-Based Cytometer3. The Tali instrument is a 3-channel (bright field, green fluorescence, red fluorescence) benchtop assay platform that offers several advantages over flow cytometry and fluorescence microscopy. The Tali cytometer is less expensive, takes up less bench space, requires less maintenance, and the work flow has been simplified so that the operation and analysis is much simpler and quicker. The Tali cytometer is capable of performing a range of suspension cell-based assays, including GFP and red fluorescent protein (RFP) expression, apoptosis4-6 and cell viability analysis with propidium iodide (PI)7-11.
Here, we demonstrate the use of the Tali instrument in performing a cell viability assay in cells expressing GFP. GFP-transduced cells are stained using the Tali Viability Kit - Dead Cell Red. The cells are then pipetted into a Tali Cellular Analysis Slide and loaded into the cytometer. Bright field, red fluorescence and green fluorescence images are captured and analyzed using assay specific algorithms. Histograms are then generated to display cell size, PI fluorescence intensity, and GFP fluorescence intensity. These parameters can then be thresholded to home in on a specific cell population.
A side-by side comparison of the Tali Image-Based Cytometer and traditional flow cytometry demonstrates that the two methods provide comparable data regarding cell viability and protein expression. However, the Tali instrument provides additional visual information about the cell population that cannot be obtained using a flow cytometer.

This protocol describes how to perform cell viability and fluorescence expression assays using the Tali Image-Based Cytometer.

Tali Görüntü Tabanlı Sitometre kullanarak GFP İfade ve Canlılık Değerlendirilmesi

Single-cell and population information are commonly obtained either by flow cytometry or fluorescence microscopy. However, these two methods provide ...

Small-scale Nuclear Extracts for Functional Assays of Gene-expression Machineries

A great deal of progress in understanding gene expression has been made using in vitro systems. For most studies, functional assays are carried out using extracts that are prepared in bulk from 10-50 or more liters of cells grown in suspension. However, these large-scale preparations are not amenable to rapidly testing in vitro effects that result from a variety of in vivo cellular treatments or conditions. This journal video article shows a method for preparing functional small-scale nuclear extracts, using HeLa cells as an example. This method is carried out using as few as three 150 mm plates of cells grown as adherent monolayers. To illustrate the efficiency of the small-scale extracts, we show that they are as active as bulk nuclear extracts for coupled RNA Polymerase II transcription/splicing reactions. To demonstrate the utility of the extract protocol, we show that splicing is abolished in extracts prepared from HeLa cells treated with the splicing inhibitor drug E7107. The small-scale protocol should be generally applicable to any process or cell type that can be investigated in vitro using cellular extracts. These include patient cells that are only available in limited quantities or cells exposed to numerous agents such as drugs, DNA damaging agents, RNAi, or transfection, which require the use of small cell populations. In addition, small amounts of freshly grown cells are convenient and/or required for some applications.

A protocol for preparation of robust, small-scale HeLa nuclear extracts is described. This protocol is valuable for assays that require use of small populations of cells, such as cells treated with drugs or RNAi. The method should be applicable to a wide variety of gene expression assays and other cell types, including patient cells.

Gen-ifadesi Makinaları Fonksiyonel Tahliller için Küçük ölçekli Nükleer ayıklar

A great deal of progress in understanding gene expression has been made using in vitro systems.  For most studies, functional assays are carried out using ...

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for expressing proteins and genetic circuits in a controlled manner as well as for providing a prototyping environment for synthetic biology.2,3 To achieve the latter goal, cell-free expression systems that preserve endogenous Escherichia coli transcription-translation mechanisms are able to more accurately reflect in vivo cellular dynamics than those based on T7 RNA polymerase transcription. We describe the preparation and execution of an efficient endogenous E. coli based transcription-translation (TX-TL) cell-free expression system that can produce equivalent amounts of protein as T7-based systems at a 98% cost reduction to similar commercial systems.4,5 The preparation of buffers and crude cell extract are described, as well as the execution of a three tube TX-TL reaction. The entire protocol takes five days to prepare and yields enough material for up to 3000 single reactions in one preparation. Once prepared, each reaction takes under 8 hr from setup to data collection and analysis. Mechanisms of regulation and transcription exogenous to E. coli, such as lac/tet repressors and T7 RNA polymerase, can be supplemented.6 Endogenous properties, such as mRNA and DNA degradation rates, can also be adjusted.7 The TX-TL cell-free expression system has been demonstrated for large-scale circuit assembly, exploring biological phenomena, and expression of proteins under both T7- and endogenous promoters.6,8 Accompanying mathematical models are available.9,10 The resulting system has unique applications in synthetic biology as a prototyping environment, or "TX-TL biomolecular breadboard."

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

This five-day protocol outlines all steps, equipment, and supplemental software necessary for creating and running an efficient endogenous Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system from scratch. With reagents, the protocol takes 8 hours or less to setup a reaction, collect, and process data.

Bir uygulama için Protokoller<em&gt; Escherichia coli</emSentetik Biyoloji&gt; Tabanlı TX-TL Hücre-Özgür İfade Sistemi

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Ününüz Aşağıdaki Tek Hücre Düzeyinde Küresel RNA Sentezi Analizi

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...