This research was supported by Cleveland State University Faculty Development Funds.

1. Herstellung von Parasite Zellkulturen, Sammlung von Parasite Pellets <ol><li> Vorbereitung RPMI-1640-HEPES Medien durch Zugabe von 10 g RPMI-1640-Pulver, 66 mg Gentamicinsulfat, 2 g Natriumbicarbonat, 5,9 g HEPES-Puffer, 50 mg Hypoxanthin und 3,8 g Dextrose in 1 l sterilem dH 2 O. Mischen Sie mit Hilfe der Tabelle Magnetrührer, bis das Pulver löst sich in 1 L destilliertem Wasser. Zuführen Mikrofiltration von Medien unter Verwendung von 0,22 um Filter. Lagern Sie das Material in sterile Flaschen. </li><li> Waschen Sie nicht infiziert (frisch) Typ A + Erythrozyten mit RPMI. Bereiten Sie 5% Hämatokrit von Erythrozyten (0,5 ml frisch gewaschenen Erythrozyten in 9,5 ml 10% RPMI + Humanserum). </li><li> Machen Sie 15% Humanserum + RPMI (15 ml Humanserum und 85 ml RPMI), den Anbau von Parasiten zu initiieren. Machen 10% Humanserum und RPMI (10 ml Humanserum und 90 ml RPMI) nach Kultivierung von Parasiten in Erythrozyten fortzusetzen. </li><li> Kultur P. falciparum (3D7 und FCR-3 Stämme) in TypA + menschlichen Erythrozyten bei 5% Hämatokrit und 20% Parasitämie in Petrischale oder einer 75 cm 3 Kulturflasche. Aufrechtzuerhalten Kultur in vitro nach der Methode von Trager und Jensen Kerzenfläschchen 26. Alternativ halten Kulturen sind im Inkubator bei 37 ° C aufrechterhalten 9,5% CO 2 und 3,4% N &amp; sub2; -Gas. Kultur P. falciparum in RPMI 1640-Medium HEPES mit 10% Humanserum. </li><li> Synchronisieren P. falciparum Kultur durch Zugabe von 65% Percoll (65 ml Percoll + 35 ml RPMI-1640 ohne Humanserum) zur Kulturkonzentrat 27. </li><li> Zentrifugieren Sie die Kultur-Konzentrat mit Percoll bei 2500 xg für 5 min, die in 3 Schichten führt. Vorsichtig mit einer Transferpipette isolieren Schizonten von der mittleren Schichtübertragung in ein separates Röhrchen unter aseptischen Bedingungen 27. </li><li> Die isolierten Kulturen mit 10% Humanserum + RPMI-1640 zweimal zu waschen, um überschüssige Percoll durch Zentrifugation bei 7500 × g für 5 Minuten entfernt werden. DiSCARD der Überstand jedes Mal unter aseptischen Bedingungen 27. </li><li> Weiter Kultivieren des synchronisierten P. falciparum-Schizonten in 10% Humanserum + RPMI-1640 27. </li><li> Sammeln Schizonten durch Behandeln Plasmodium infizierten Erythrozyten mit 10 mM Tris pH 8,8 und Zentrifugieren bei 15000 × g für 15 min 23. Speicher Parasiten Pellets bei -70 ° C nach Zugabe von 5 ul Protease-Inhibitor (Aprotinin) auf das Granulat. Verwenden Parasiten Pellets für Proteinextraktion, genomische DNA Isolierung und RNA-Isolierung. </li></ol> 2. Vorbereitung Plasmid Vektor <ol><li> Isolieren genomischer DNA aus P. falciparum Schizont Pellets aus Kulturen von etwa 20% Parasitämie hergestellt. </li><li> Mit 600 &amp; mgr; l 10 mM Tris-HCl pH 7,6, 50 mM EDTA pH 8,0, 0,1% SDS und 1 mg / ml Proteinase K, um Pellets in ein Mikrozentrifugenröhrchen, homogenisieren Pellet unter Verwendung einer 1 ml Spritze mit einer 26 G Nadel. Alternate Befüllen der Spritzemit der Granulatmischung und Entleeren in einem Mikrozentrifugenröhrchen 20 mal. Das Röhrchen haltige Homogenisat O / N in einem 50 ° C Wasserbad. </li><li> Führen Phenol - Chloroform (P + C) Extraktion durch Zugabe von 600 &amp; mgr; l von P + C (300 ul Phenol und 300 ul Chloroform) homogenisierte Pellet. Cap Röhrchen fest und die Mischung kräftig schütteln durch Umkehren Rohr End-to-End. Zentrifugenröhrchen bei 14.000 × g für 2 min und sammeln obere wässrige Lösung mit einer Mikropipette in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal. </li><li> Mit 600 &amp; mgr; l Chloroform zu der wäßrigen Schicht in den neuen Rohrs aus Schritt 2.1.2. Das Röhrchen vortexen für 10 sec und Zentrifuge bei 14.000 × g für 2 min. Messen die obere wässrige Schicht wurde mit einer Mikropipette und überträgt es zu einem neuen Reaktionsgefäß. </li><li> In 0,1 Vol von 5 M Natriumacetat pH 5,5 und 1 Vol Isopropanol (wenn wässrige Schicht ist 300 ul fügen 30 ul 5 M Natriumacetat pH 5,5 + 330 ul Isopropanol) zu wässrigen Laiener von Schritt 2.1.3. Das Röhrchen bei RT für 15 min. </li><li> Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 14.000 × g für 10 min, um DNA-Pellet auszufällen. Überstand verwerfen und Pellet Waschen mit 100 ul 70% Ethanol (70 ul Ethanol und 30 ul dH &amp; sub2; O), um überschüssiges Salz aus der DNA zu entfernen. Speicher DNA in 50 ul dH &amp; sub2; O bei -20 ° C. </li><li> Gestalten Sie Vorwärts- und Rückwärtsprimer unter Verwendung von Software oder manuell zur Amplifikation von P. falciparum Genen PF3D7_1361800, PF3D7_0925900, PF3D7_1436300 und PF3D7_0114100 zuvor in Proteomstudien 16,18 mit geeigneten Restriktionsstellen, um die Klonierung der Gensequenzen in die multiplen Klonierungsstellen von Expressionsplasmid pT7CFE1-ChiS Bedingungen zulassen, wie in Tabelle 2 gezeigt. </li><li> Machen Sie eine 50 &amp; mgr; l Reaktionsmischung durch Zugabe; 5 ul der isolierten P. falciparum genomische DNA, 5 ul 10x-Puffer, 5 ul MgCl 2, 1,5 &amp; mgr; l Vorwärts-Primer, 1,5 ulRückwärts-Primer, 0,5 &amp; mgr; l T7-DNA-Polymerase und 31,5 &amp; mgr; l dH 2 O und führen Polymerasekettenreaktion (PCR) bei 94 ° C für 8 min zur Denaturierung, 50 ° C für 1 min 30 sec für die Erweiterung und 72 ° C für 9 min zum Tempern und Renaturierung zum Verstärken in Tabelle 1 gezeigten Genen. </li><li> Getrennte PCR-Produkte auf 1% Agarose-Gel (1 g Agarose und 100 ml Tris-Acetat-EDTA (TAE) -Puffer) 32. </li><li> Schneiden Sie die PCR-amplifizierte DNA-Banden aus dem Agarose-Gel, legen Sie die Gelscheiben DNA enthält, in einem DNA-Gel Extraction Spin-Säule und bei -20 ° C für 5 min. 100 l Isopropanol zu den gefrorenen Gelscheiben und Zentrifuge bei 14.000 xg für 5 min. </li><li> Messung der wässrigen Durchströmung in das Sammelrohr aus Schritt 2.5 filtriert Verwendung einer Mikropipette und Transfer in ein neues Gefäß. Mit 0,1 Vol von 5 M Natriumacetat und Zentrifuge bei 14.000 × g für 5 min. Überstand verwerfen und fügen Sie 10 ul dH 2 O zu the DNA-Pellet. </li><li> Verdauen die pT7CFE1-ChiS Expressionsvektor und gereinigte DNA-Fragmente (2,6) in zwei getrennten Röhrchen durch Zugabe von 3 ul von Plasmid und 5 ul PCR-Genprodukte in jedes Röhrchen. In jedes Röhrchen wurden 1 ul von spezifischen Restriktionsenzymen, 2 ul Reaktionspuffer und 14 ul dH 2 O. </li><li> Werden 3 ul verdauten Plasmid, 5 ul verdauten DNA-Fragmente, 2 ul 10fach Ligasepuffer, 1 ul Ligase und 9 &amp; mgr; l dH 2 O in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Inkubation bei 12 ° CO / N. </li><li> Mit 0,1 vol 3 M Natriumacetat bei pH 5,5 und 2 Volumen Ethanol (wenn die Ligationsröhrchen Volumen beträgt 20 &amp; mgr; l add 2 ul 3 M Natriumacetat + 44 ul Ethanol), um die Röhre aus dem Schritt 2.14. Gut mischen und Inkubation bei -20 ° C für 15 min. </li><li> Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 14.000 × g für 15 min. Den Überstand mit einem Mikro-Pipette vorsichtig entfernen, ohne das Pellet zu stören. </li><li> 100 ul 70% Ethanol to des Pellets aus Schritt 2.10. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 14.000 xg für 5 min. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand. Zugabe von 10 &amp; mgr; l Nuklease-freies Wasser auf die DNA-Pellet. </li></ol> 3. Protein Expression mittels in vitro Menschliche Zelle Kostenlose Expression System <ol><li> Es werden 20 &amp; mgr; l-Transkriptionsmischung durch Messung 2 ul des rekombinanten pT7CFE1-ChiS Plasmid-DNA, 4 ul 5x Transkriptionspuffer, 4 ul NTP-Mix, 2 &amp; mgr; l T7-RNA-Polymerase und 8 &amp; mgr; l Nuklease-freies Wasser für 2-Schritt humanen in vitro Proteinexpression mit Hilfe von DNA-Templates. Mischungskomponenten in einem Mikrozentrifugenröhrchen und Inkubation für 75 min bei 30 ° C in einem Wasserbad. </li><li> Take 2 ul der Transkriptionsansatz und auf 23 &amp; mgr; l Translationsgemisch, das 12,5 &amp; mgr; l von HeLa-Zelllysat, 2,5 ul akzessorischen Proteinen, 1 &amp; mgr; l Salzlösung A, 0,5 &amp; mgr; l der Aminosäuren Met, 0,5 ul von Aminosäuren hinzuzufügen Leu, 181; l RNase-Inhibitor, 1,25 ul des Energiemix und 3,75 ul Nuklease-freies Wasser. </li><li> Inkubieren Übersetzung Mischung aus Schritt 3.2 bei 30 ° C für 90 min. Speicher Translationsprodukte bei -20 ° C. </li><li> Vorbereitung 25 ul der Transkription und Translationsgemisch durch Zugabe von 3 &amp; mgr; l der rekombinanten pT7CFE1-ChiS Plasmid-DNA, 2 &amp; mgr; l Nuklease-freies Wasser, 5 ul der Reaktionsmischung wurden 12,5 ul HeLa Lysat und 2,5 ul Helferproteine ​​für 1-Schritt menschliche Coupled IVT Protein Expression der DNA-Vorlagen. </li><li> Inkubieren der Reaktionsmischung aus Schritt 3.4 für 90 min bis 6 h bei 30 ° C. Bewahren Sie die Übersetzung Produkte bei -20 ° C. </li></ol> 4. Reinigung des exprimierten rekombinanten Proteins <ol><li> Hinzuzufügen 75 ul 1x Reinigungspuffer auf 25 &amp; mgr; l Translationsprodukt zu 100 ul Reinigungsmischung herzustellen. </li><li> 100 l Nickel Chelatharz zu 100 ul Reinigungs mixture. Wasch Ni-Harz zweimal durch Zugabe von 300 &amp; mgr; l dH 2 O und 300 &amp; mgr; l Bindungspuffer. Re-suspend Harz und Zentrifuge bei 14.000 · g für 1 min, um überschüssiges Ethanol zu entfernen. </li><li> 100 l Reinigungsmischung aus Schritt 4,2 bis 100 &amp; mgr; l von Nickel Chelatharz und Inkubieren des Gemisches für 60 min bei RT. </li><li> Zentrifugieren der Mischung bei 14.000 · g für 1 min und sammeln Stand in ein frisches Röhrchen als &quot;durchströmen&quot; gekennzeichnet. </li><li> Wasch Harz mit 100 ul 1x-Waschpuffer (20 mM Imidazol, 250 mM NaH 2 PO 4 bei pH 8, 2,5 M NaCl und dH 2 O). Zentrifuge bei 14.000 · g für 1 min und sammeln Stand in frisches Röhrchen &quot;wash&quot; gekennzeichnet. Wiederholen Sie Schritt 4.5 zweimal. </li><li> 100 ul 1x Elutionspuffer (100 mM Imidazol, 250 mM Na 2 PO 4, pH 8,0, 2,5 M NaCl und dH 2 O), um das Harz und die Proben für 15 min. Zentrifugieren bei 14.000 × g für 1 min. Haben die Elutionsschritt zweimal. JederZeit zu sammeln Überstand in frische Reaktionsgefäße und Label als &quot;Eluat&quot;. </li><li> Nach der Elution waschen Harz zweimal, wie in Schritt 4.5 beschrieben. Shop durch, wäscht und Elution Proben fließen bei -20 ° C oder niedriger. Harz muß bei 4 ° C gelagert werden. Verwenden 30 ul jeder Probe für die SDS-PAGE und Immunoblotting-Analyse. </li></ol> 5. Coomassie (Bradford) Protein Assay 34 <ol><li> Sind Standardrinderserumalbumin (BSA) Lösung mit der Konzentration 20 ug / ml (Mischungs 10 ul BSA (2 mg / ml) und 90 ul dH &amp; sub2; O), 40 ug / ml (Mischungs 20 ul BSA (2 mg / ml) und 80 ul dH &amp; sub2; O), 60 ug / ml (Mischungs 30 ul BSA (2 mg / ml) und 70 ul dH &amp; sub2; O), 80 ug / ml (Mischungs 40 ul BSA (2 mg / ml) und 60 ul dH &amp; sub2; O), 100 ug / ml (Mischungs 50 ul BSA (2 mg / ml) und 50 ul dH &amp; sub2; O), 160 ug / ml (Mischungs 80 ul BSA (2 mg / ml) und 20 ul dH2 O) und 200 ug / ml (100 ul BSA (2 mg / ml). </li><li> Maßnahme 5 ul der Strömung durch, wäscht und Eluat-Proben von Schritt 4.7. Hinzuzufügen 95 ul dH 2 O. </li><li> 5 ml Coomassie-Blau-Reagens zu den Mischungen aus den Schritten 5.1 und 5.2. Decken Sie die Röhrchen mit Parafilm und Vortex für 10 Sekunden, dann für 20 min bei RT inkubieren. </li><li> Verwendung eines Spektrophotometers, Die optische Dichte (OD) bei einer Wellenlänge von 650 nm für die Proteinröhrchen aus Schritt 5.3. Plot Konzentration gegen OD Lesen, um die Proteinkonzentrationen 34 zu bestimmen. </li></ol> 6. Western Blotting <ol><li> In 5 ul Schizont Extrakte aus P. falciparum, 2 ul von Escherichia coli exprimierte rekombinante Proteine ​​rhOP-3 31, 5 &amp; mgr; l der rekombinanten Proteine ​​exprimiert unter Verwendung von 2-Schritt-und 1-Schritt in vitro menschliche Expressionssystemen und 10 ul Protein-Produkte wurden gereinigt unter Verwendung von Affinitätsverfahren, um Rohre zu trennen. </li&gt; <li> Hinzuzufügen Elektrophorese-Probenpuffer, enthaltend Mercaptoethanol in jedes Röhrchen bis zu einem Endvolumen von 20 ul zu solubilisierten Proteins Proben bilden. Sieden Rohre für 2 min. </li><li> Laden solubilisierten Proteins Proben auf 10% SDS-PAGE-Gelen, um die Proteine ​​zu trennen. </li><li> Übertragen getrennten Proteine ​​von SDS-PAGE-Gelen auf Nitrozellulosepapier (NCP) durch Elektrophorese bei 35 mA pro Gel in einem halbtrockenen Westernblot Kammer für 2 Stunden. </li><li> Block NKS folgende Übertragungs mit 2% Magermilch. </li><li> Inkubation blockiert NKS mit den folgenden polyklonalen Antikörpern 1: 100 verdünnt in 2% Milch Western-Blot durchzuführen; Kaninchen-Antikörper # 676 21 spezifisch für P. falciparum Merozoiten Rhoptrien, Maus-Antikörper 20 spezifisch für P. yoelii und P. berghei Merozoiten Rhoptrien Antiseren # 685 spezifisch für das P. falciparum parasitophoren Vakuole Protein, SERA (Serin-reiche Antigen) 22 und Antikörper, die für die Maurer217; s Spalte Protein PFMC-2TM 28. </li><li> Inkubieren NKS auch in 1: 100 verdünnt normale Maus und Kaninchen-Serum und verbrachten Kulturüberstand (SCS) von SP2-Myelomzellen als Negativkontrollen. </li><li> Inkubieren NKS mit Antikörpern und Kontrollen bei 4 ºC O / N. </li><li> Wash NKS 4x mit Blot-Puffer und Inkubation NKS mit artspezifischen Sekundärantikörper mit Meerrettich-Peroxidase (HRP) konjugiert 1: 1000 verdünnt in 2% Milch. </li><li> Wash NKS 4x mit Blot-Puffer. Inkubiere gewaschen NCPs mit der Farbentwicklungslösung A + B (Lösung A: in 50 ml 1x Blot-Puffer und 30 ul H &amp; sub2; O &amp; sub2; Lösung B: 10 ml Methanol und 30 mg 3-Chlor-naphtol) 30 min in Dunkelheit. Western-Blot-Analyse Ergebnisse kolorimetrisch. </li></ol>

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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Organization+and+cross+linking+analysis+of+the+Plasmodium+falciparum+erythrocyte+binding+proteins+Rhop-H+and+SERA.">Molecular Organization and cross linking analysis of the Plasmodium falciparum erythrocyte binding proteins Rhop-H and SERA.</a> J Protozool. Res. 10 (3), 128-154 (2000).</li><li>Sam-Yellowe, T. Y., Shio, H., Perkins, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretion+of+Plasmodium+falciparum.+rhoptry+protein+into+plasma+membrane+of+host+erythrocytes.">Secretion of Plasmodium falciparum. rhoptry protein into plasma membrane of host erythrocytes.</a> J Cell Biol. 106 (5), 1507-1513 (1988).</li><li>Sundaresh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+humoral+immune+responses+in+protein+microarrays+using+DNA+microarray+data+analysis+techniques.">Identification of humoral immune responses in protein microarrays using DNA microarray data analysis techniques.</a> Bioinformatics. 22 (14), 1760-1766 (2006).</li><li>Terpe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+bacterial+expression+systems+for+heterologous+protein+production:+from+molecular+and+biochemical+fundamentals+to+commercial+systems.">Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 72 (2), 211-222 (2006).</li><li>Trager, W., Jensen, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+malaria+parasites+in+continuous+culture.">Human malaria parasites in continuous culture.</a> Science. 193 (4254), 673-675 (1976).</li><li>Tsarukyanova, I., Drazba, J. A., Fujioka, H., Yadav, S., Sam-Yellowe, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteins+of+the+Plasmodium+falciparum.+two+transmembrane+Maurer&#8217;s+cleft+protein+family,+PfMC-2TM+and+the+130+kDa+Maurer&#8217;s+cleft+protein+define+different+domains+of+the+infected+erythrocyte+intramembranous+network.">Proteins of the Plasmodium falciparum. two transmembrane Maurer&#8217;s cleft protein family, PfMC-2TM and the 130 kDa Maurer&#8217;s cleft protein define different domains of the infected erythrocyte intramembranous network.</a> Parasitol Res. 104 (4), 875-891 (2009).</li><li>Tsuboi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wheat+germ+cell-free+system-based+production+of+malaria+proteins+for+discovery+of+novel+vaccine+candidates.">Wheat germ cell-free system-based production of malaria proteins for discovery of novel vaccine candidates.</a> Infect. Immun. 76 (4), 1702-1708 (2008).</li><li>Tsuboi, T., Takeo, S., Sawasaki, T., Torii, M., Endo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+approach+to+the+production+of+vaccines+against+the+malaria+parasite.">An efficient approach to the production of vaccines against the malaria parasite.</a> Methods in Mol. Biol. 607, 73-83 (2010).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+protein+microarray+platform+enabling+antibody+profiling+against+denatured+proteins.">A versatile protein microarray platform enabling antibody profiling against denatured proteins.</a> Proteomics Clin. Appl. 7 (5-6), 378-383 (2013).</li><li>Wang, T., Fujioka, H., Drazba, J. A., Sam-Yellowe, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhop-3+protein+conservation+among+Plasmodium.">Rhop-3 protein conservation among Plasmodium.</a> species and induced protection against lethal. 99 (3), 238-252 (2006).</li><li>Yadavalli, R., Ledger, C., Sam Yellowe, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+human+cell+free+expression+for+synthesis+of+malaria+proteins.">In vitro human cell free expression for synthesis of malaria proteins.</a> Parasitol Res. 111 (6), 2461-2465 (2012).</li><li>Machida, K., Masutan, M., Imataka, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Synthesis+in+vitro.:+Cell-Free+Systems+Derived+from+Human+Cells.">Protein Synthesis in vitro.: Cell-Free Systems Derived from Human Cells.</a> Intech. , (2012).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantification+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li></ol>

We do not have any competing financial interests in this study.

Die wichtigsten Schritte zur erfolgreichen Expression von Proteinen unter Verwendung von zweistufigen in vitro menschliche Zelle frei Expressionssystem und Reinigung sind: 1) eine erfolgreiche Amplifikation und Klonierung von Genen in pT7CFE-ChiS Plasmidvektor; 2) Transkription RNA bei 30 o C; 3) Übersetzung von Protein bei 30 ° C in Gegenwart von RNAse-Inhibitor; 4) Entwicklung der Affinität basiert Reinigungsprotokoll mit Harzkügelchen mit Ni und 5 beschichtet) Analyse der Ergebnisse auf Western-Blot un...

Malariaforschung, Expression von immunogenen Proteinen unter Verwendung von prokaryotischen oder eukaryotischen Systemen auf Zellbasis bleibt eine Herausforderung. Die AT Reichtum des Plasmodium Genom und unbekannte posttranslationale Mechanismen 14,7, auf die Schwierigkeiten bei der Beschaffung richtig gefaltet und immunogene Proteine ​​zur Antikörperproduktion und Impfstoffstudien assoziiert beitragen. Prokaryontischen Systemen wie Escherichia coli für die rekombinante Proteinexpression verwendet. Prokaryotische Systeme sind kostengünstig, effektiv, erzeugen hohe Ausbeuten an rekombinantem Protein und mehrere Klonierungsvektoren. Host E. coli-Zellen sind leicht zu transformieren und Zellen schnell wachsen. Jedoch haben prokaryotischen Systemen Einschränkungen wie der Mangel an Aminosäure-Substitution, eine posttranslationale Modifikation, Verschmutzungsgefahr heterogene Produkte und Akkumulation von rekombinanten Proteinen in Einschlusskörpern 24. In einemStudie Mehlin et al. (2006) wurden 1000 offenen Leserahmen (ORF) ausgedrückt. Etwa 7% der exprimierten Proteine ​​waren löslich 14. Die beobachtete Unlöslichkeit ist aufgrund der vorgespannten Natur der Gene und der hohen Frequenz von Codons, die idealerweise durch die AT-reiche Plasmodium Genom 14 verwendet. Eine alternative Strategie zur Überwindung dieses Problems wurde durch die Verwendung von Plasmiden oder Wirtszellen, tRNAs, die seltenen Codons oder Codons, die Frequenzen 3 entsprechen erkennen entwickelt. Selbst nach der Durchführung dieser Optimierungen werden sehr kleine Teile von Proteinen als lösliche, aktive und immunogenen 14 ausgedrückt. Die zellfreie Expressionssysteme enthalten sämtliche zur Transkription und Translation notwendigen Komponenten wie Ribosomen, Initiationsfaktoren, Elongationsfaktoren (Übersetzungen Faktoren), tRNA und Aminoacyl-tRNA-Synthetasen. Beide Transkription und Translation Reaktionen werden in einem einstufigen Verfahren 11,29 gekoppelt. Die transcription Reaktion in einem Röhrchen durchgeführt werden, bevor entsprechende Menge an mRNA mit Translationsmaschinerie in einem anderen Rohr 11,29 inkubiert. Obwohl diese Verfahren in Plasmodium sp. Protein Expression erfolgreich sind, ein großer Nachteil ist die Länge der Zeit für die Proteinexpression, die etwa 22 Stunden 29 ist. Darüber hinaus ist die hohen Kosten der Versorgung für die Aufnahme in den Protokollen 29, die arbeitsintensiven Vorbereitungen des Zelllysats und Inkonsistenzen in der Komponente Zubereitungen, stellen diese Systeme unerreichbar. Das Hauptaugenmerk der Forscher für die Entwicklung einer zellfreien Expressionssystem ist abhängig von Faktoren wie schnelle genetische Veränderung, schnelle Erträge mit hohen Konzentrationen und geradlinig Lysat Vorbereitungen 1. Eukaryontischen Systemen wie Hefe, Säugerzelllinien, Baculovirus-Expressionssystem vermittelt, Tetrahymena thermophilia, Dictyostelium discoideum und parasitären Expressionssysteme such wie Leishmania wurden für die rekombinante Proteinexpression 7 verwendet. Eukaryotische Systeme teilen phylogenetische Verwandtschaft und damit Eigenschaften wie Glykosylierung, Acylierung, Disulfid-Bindungsbildung, Chaperon-Wechselwirkung, Proteolyse und subzellulären Kompartimentierung teilen auch. Proteinsekretion Veranstaltungen in Eukaryoten zu verhindern Anhäufung und verringert die Toxizität für Expressionssysteme 13. Die Verwendung von Hefe-Systemen wird bevorzugt, da sie für die Proteinexpression in großem Maßstab und zur Erzielung hoher Ausbeuten 4 sind. Zwei P. falciparum Proteine ​​PFCP-29 und Pvs25 wurden unter Verwendung des Hefe-System 4 erzeugt. , Ein großer Nachteil bei der Synthese der meisten der Proteine ​​wurde jedoch unregelmäßige N und O-Glykosylierungsmuster, unsachgemäße Falten und Abschneiden von Proteinen aus ihrer nativen Form 4. Die Verwendung von Säugetierzellen für die Synthese von rekombinanten Proteinen ist arbeitsintensiv und es ist Expensive zu stabilen rekombinanten Zelllinien 4 aufrecht zu erhalten. Daher wurden Säugerzellen für die Analyse von Protein-Signalisierung, Protein-Interaktionen und Parasit-Wirt-Wechselwirkungen beschränkt und auch für das Testen von DNA-Impfstoffen 4. Die menschliche DNA und mRNA in vitro-Proteinexpression zellfreies System ist hierin ein HeLa-Zell-abgeleitete Säugetier-basiertes System, das Proteine ​​in 3 h ausdrückt. Proteine ​​exprimiert Verwendung pT7CFE1-ChiS Expressionsvektor haben einen C-terminalen Tag erleichtert Identifizierung und Reinigung. Die HeLa basiertes System mit Translationsinitiationsfaktoren und einem Übersetzungsregler ergänzt, wodurch die Effizienz des Übersetzungssystems zu verbessern. Proteine ​​können schnell umgesetzt werden, abgeschirmt, überprüft und für den Einsatz in verschiedenen immunologischen und Strukturanwendungen 15 verarbeitet. Eukaryotischen zellfreie Expressionssysteme wie Weizenkeime und Kaninchen-Retikulozyten sind zur Zeit für die Expression von var verwendetious eukaryotischen Proteinen einschließlich Plasmodium Proteine ​​11,29. Zusätzlich E. coli basiert zellfreie Systeme sind auch für eukaryotische Proteinexpression. 11 verwendeten Tabelle 1 fasst verschiedene zellfreie Expressionssysteme durch Vergleichen von Merkmalen der Systeme sowie die Leichtigkeit der Verwendung der Systeme für die Proteinexpression. Der menschliche zellfreien System im Vergleich zu den anderen hat die Fähigkeit, Pfosten und co-translationale Modifikationen durchzuführen und ist weniger teuer. Codon-Optimierung ist möglich, und alle Reaktionen in 3 Stunden durchgeführt werden. Die HeLa-System ist eine ideale Übersetzungssystem für die Proteinsynthese in der Laborumgebung. Ein Hauptvorteil der menschlichen Zelle freie Expressionssysteme gegenüber anderen zellfreien Systemen ist die Verfügbarkeit von mehreren verschiedenen Zelllinien aus verschiedenen Organen und Geweben abgeleitet ist. Mehrere Sorten von zellfreien Systemen können in Abhängigkeit von der Zelllinie ausgebildet sein. Der Extrakts aus Säugerzellen haben einen höheren Wirkungsgrad, große Proteine ​​zu synthetisieren als andere zellfreie Expressionssysteme. Diese zellfreie Expressionssysteme können auch in diagnostischen und Proteincharakterisierung Anwendungen wie Mikro-Arrays 30 verwendet werden. Die beliebten HeLa-Zelllinien werden am häufigsten verwendet, um die Durchführung der Expression von Proteinen, 33. Das endoplasmatische Retikulum in den HeLa-Zelllinien unterentwickelt, was zu einer Abwesenheit von posttranslationalen Glykosylierung Modifikation Aktivität 33. Allerdings ist dieses System glaubten für Plasmodium Proteinsynthese als vorteilhaft, als Plasmodium fehlt auch Glykosylierung Übersetzungs- Änderung 29. Der HeLa-Zell-freien Transkriptions-Translations-Protokoll ist einfach auszuführen, preisgünstig und Proteine ​​können in 90 min ausgedrückt werden, bereit für die Reinigung und Downstream Applikationen.

<table><tbody><tr><td>2-step &lt;em&gt;in vitro&lt;/em&gt; human cell free expression system</td><td>Thermo Fisher</td><td>88856</td><td>Discontinued. Always store at -80 &amp;deg;C. Do not thaw in warm water</td></tr><tr><td>1-step &lt;em&gt;in vitro&lt;/em&gt; coupled translation system</td><td>Thermo fischer</td><td>88860</td><td>Always store at -80 &amp;deg;C. Do not thaw in warm water</td></tr><tr><td>ProBond Purification system</td><td>Invitrogen</td><td>K850-01</td><td>Store at RT</td></tr><tr><td>Probond Nickel-Chelating Resin</td><td>Invitrogen</td><td>R801-01</td><td>Store at 4&lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C.</td></tr><tr><td>A+ Human Blood</td><td>Interstate Blood Bank</td><td></td><td>Store at 4 &amp;deg;C.</td></tr></tbody></table>

hela based cell free expression systems for expression of plasmodium rhoptry proteins

Malaria verursacht erhebliche globale Morbidität und Mortalität. Keine Routine-Impfstoff ist derzeit verfügbar. Einer der wichtigsten Gründe für die mangelnde eines Impfstoffes ist die Herausforderung der Identifizierung geeigneter Impfstoffkandidaten. Malariaproteine ​​exprimiert mit prokaryotischen und eukaryotischen Zellen basierenden Expressionssystemen schlecht glycosyliert allgemeinen unlöslich und unterliegen falsche Faltung führt zu verringerten Immunogenizität. Die Weizenkeime, Kaninchenretikulocytlysat und Escherichia coli Lysat zellfreie Expressionssysteme sind derzeit für die Expression des Malaria-Proteine ​​verwendet. Jedoch ist die Länge des Expressionszeit und unsachgemäße Glykosylierung von Proteinen immer noch eine Herausforderung. Wir zeigen die Expression von Plasmodium Proteinen in vitro unter Verwendung von HeLa-Zelle basierend freie Expressionssysteme, die als &quot;in vitro menschliche Zelle freie Expressionssysteme&quot;. Die 2 HeLa anhand zellfreie Expressionssysteme transkribieren mRNA in 75 min und 3 ul transcribed mRNA reicht aus, um Proteine ​​in 90 min zu übersetzen. Die 1-Schritt-Expressionssystem ist eine Transkription und Translation gekoppelt Expressionssystem; die Transkription und Co-Übersetzung erfolgt in 3 Stunden. Das Verfahren kann auch für 6 Stunden, indem zusätzliche Energie erweitert werden. In der 2-Schritt-Expressionssystem wird mRNA transkribiert erste und dann in die Übersetzung Mischung für die Proteinexpression zugegeben. Wir beschreiben, wie die Malaria-Proteine ​​zu exprimieren; eine hydrophobe PF3D7_0114100 Maurers Cleft - 2 Transmembran (PFMC-2TM) Protein, ein hydrophiles PF3D7_0925900 Protein und ein Gürteltier wiederholt mit Protein PF3D7_1361800, mit der HeLa anhand zellfreien Expressionssystem. Die Proteine ​​werden in Mikrovolumina unter Verwendung 2-Schritt und 1-step-Ausdruck Strategien ausgedrückt. Ein Affinitätsreinigungsverfahren zur Reinigung von 25 ul exprimierten Proteine ​​unter Verwendung des in vitro menschliche Zelle frei Expressionssystem wird ebenfalls beschrieben. Proteinausbeute durch Bradford-Assay bestimmt und die zum Ausdruckund gereinigte Proteine ​​durch Western-Blot-Analyse bestätigt werden. Exprimierten rekombinanten Proteine ​​können für Impfungen, Immunoassays und Proteinsequenzierung verwendet werden.

Validierung der exprimierten rekombinanten Proteine ​​durch Reaktivität mit spezifischen Antikörpern ist ein wichtiger erster Schritt bei der Bestätigung der korrekten Faltung der exprimierten Proteine. Rekombinanten Malaria-Proteine ​​wurden mit dem einen Schritt und zwei Schritt in vitro menschliche Zelle frei Expressionssystemen exprimiert. Die rekombinanten Proteine ​​werden gereinigt Ni-Chelat-Affinitäts-Verfahren. Dann verwendeten wir Antiseren gegen ganze Merozoiten Rhoptrien in Western-Blotting v...

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HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins

Expression des Malaria-Proteinen in zellbasierten Systemen bleibt eine Herausforderung. Wir zeigen zwei Schritt und einen Schritt IVT (in vitro-Translation) zellfreie Expressionssysteme zur Expression von rekombinanten Malaria-rhoptry Proteine ​​aus HeLa-Zellen. Wir verwenden eine Ni-Harz Affinität Kläranlage, die rhoptry Proteine ​​zu reinigen.

Basierend HeLa Zellfreie Expressionssysteme zur Expression von<em&gt; Plasmodium</em&gt; Rhoptry Proteine

Malaria causes significant global morbidity and mortality. No routine vaccine is currently available. One of the major reasons for lack of a vaccine is ...

hela-based-cell-free-expression-systems-for-expression-plasmodium

Research

JoVE Journal

Biology

HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins

12.0K Aufrufe.  Cleveland State University.  Expression des Malaria-Proteinen in zellbasierten Systemen bleibt eine Herausforderung. Wir zeigen zwei Schritt und einen Schritt IVT (in vitro-Translation) zellfreie Expressionssysteme zur Expression von rekombinanten Malaria-rhoptry Proteine ​​aus HeLa-Zellen. Wir verwenden eine Ni-Harz Affinität Kläranlage, die rhoptry Proteine ​​zu reinigen. 

Serie: HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins

Modifying Baculovirus Expression Vectors to Produce Secreted Plant Proteins in Insect Cells

It has been a challenge for scientists to express recombinant secretory eukaryotic proteins for structural and biochemical studies. The baculovirus-mediated insect cell expression system is one of the systems used to express recombinant eukaryotic secretory proteins with some post-translational modifications. The secretory proteins need to be routed through the secretory pathways for protein glycosylation, disulfide bonds formation, and other post-translational modifications. To improve the existing insect cell expression of secretory plant proteins, a baculovirus expression vector is modified by the addition of either a GP67 or a hemolin signal peptide sequence between the promoter and multiple-cloning sites. This newly designed modified vector system successfully produced a high yield of soluble recombinant secreted plant receptor proteins of Arabidopsis thaliana. Two of the expressed plant proteins, the extracellular domains of Arabidopsis TDR and PRK3 plasma membrane receptors, were crystallized for X-ray crystallographic studies. The modified vector system is an improved tool that can potentially be used for the expression of recombinant secretory proteins in the animal kingdom as well.

Here, we present the protocols for utilizing the insect cell and baculovirus protein expression system to produce large quantities of plant secreted proteins for protein crystallization. A baculovirus expression vector has been modified with either GP67 or insect hemolin signal peptide for plant protein secretion expression in insect cells.

Pflanzliche Proteine in Insektenzellen abgesondert ändern Baculovirus Expressionsvektoren herstellen

It has been a challenge for scientists to express recombinant secretory eukaryotic proteins for structural and biochemical studies. The ...

Forschung

Biochemie

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of free merozoites from the blood by phagocytic cells. However assessing the functional efficacy of merozoite specific opsonizing antibodies is challenging due to the short half-life of merozoites and the variability of primary phagocytic cells. Described in detail herein is a method for generating viable merozoites using the E64 protease inhibitor, and an assay of merozoite opsonin-dependent phagocytosis using the pro-monocytic cell line THP-1. E64 prevents schizont rupture while allowing the development of merozoites which are released by filtration of treated schizonts. &#160;Ethidium bromide labelled merozoites are opsonized with human plasma samples and added to THP-1 cells. Phagocytosis is assessed by a standardized high throughput protocol. Viable merozoites are a valuable resource for assessing numerous aspects of P. falciparum biology, including assessment of immune function. Antibody levels measured by this assay are associated with clinical immunity to malaria in naturally exposed individuals. The assay may also be of use for assessing vaccine induced antibodies. &#160;

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

Measuring antibody function is key to understanding immunity to Plasmodium falciparum malaria. This method describes the purification of viable merozoites, and measurement of opsonization-dependent phagocytosis by flow cytometry.

High Yield Reinigung von<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Merozoiten Zur Verwendung in opsonierende Antikörper-Assays

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

Immunologie und Infektion

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The molecular basis of this resistance, which is known to be multifactorial, remains incompletely understood. Recent studies found that the differential expression of erythrocyte microRNAs, once translocated into malaria parasites, affect both gene regulation and parasite growth. These miRNAs were later shown to inhibit mRNA translation by forming a chimeric RNA transcript via 5&#39; RNA fusion with discreet subsets of parasite mRNAs. Here, the techniques that were used to study the functional role and putative mechanism underlying erythrocyte microRNAs on the gene regulation and translational potential of P. falciparum, including the transfection of modified synthetic microRNAs into host erythrocytes, will be detailed.&#160; Finally, a polysome gradient method is used to determine the extent of translation of these transcripts. Together, these techniques allowed us to demonstrate that the dysregulated levels of erythrocyte microRNAs contribute to cell-intrinsic malaria resistance of sickle erythrocytes.

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

Human microRNAs translocate from host erythrocytes to Plasmodium falciparum parasites. Here, the techniques used to transfect synthetic microRNAs into host erythrocytes and isolate all RNAs from P. falciparum are described. In addition, this paper will detail a method of polysome isolation in P. falciparum to determine the ribosomal occupancy and translational potential of parasite transcripts.

Methoden, um die regulatorische Rolle kleiner RNAs und Ribosomal Belegung von Untersuchen<em&gt; Plasmodium falciparum</em

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The ...

A Convenient and General Expression Platform for the Production of Secreted Proteins from Human Cells

Recombinant protein expression in bacteria, typically E. coli, has been the most successful strategy for milligram quantity expression of proteins. However, prokaryotic hosts are often not as appropriate for expression of human, viral or eukaryotic proteins due to toxicity of the foreign macromolecule, differences in the protein folding machinery, or due to the lack of particular co- or post-translational modifications in bacteria. Expression systems based on yeast (P. pastoris or S. cerevisiae) 1,2, baculovirus-infected insect (S. frugiperda or T. ni) cells 3, and cell-free in vitro translation systems 2,4 have been successfully used to produce mammalian proteins. Intuitively, the best match is to use a mammalian host to ensure the production of recombinant proteins that contain the proper post-translational modifications. A number of mammalian cell lines (Human Embryonic Kidney (HEK) 293, CV-1 cells in Origin carrying the SV40 larget T-antigen (COS), Chinese Hamster Ovary (CHO), and others) have been successfully utilized to overexpress milligram quantities of a number of human proteins 5-9. However, the advantages of using mammalian cells are often countered by higher costs, requirement of specialized laboratory equipment, lower protein yields, and lengthy times to develop stable expression cell lines. Increasing yield and producing proteins faster, while keeping costs low, are major factors for many academic and commercial laboratories.
Here, we describe a time- and cost-efficient, two-part procedure for the expression of secreted human proteins from adherent HEK 293T cells. This system is capable of producing microgram to milligram quantities of functional protein for structural, biophysical and biochemical studies. The first part, multiple constructs of the gene of interest are produced in parallel and transiently transfected into adherent HEK 293T cells in small scale. The detection and analysis of recombinant protein secreted into the cell culture medium is performed by western blot analysis using commercially available antibodies directed against a vector-encoded protein purification tag. Subsequently, suitable constructs for large-scale protein production are transiently transfected using polyethyleneimine (PEI) in 10-layer cell factories. Proteins secreted into litre-volumes of conditioned medium are concentrated into manageable amounts using tangential flow filtration, followed by purification by anti-HA affinity chromatography. The utility of this platform is proven by its ability to express milligram quantities of cytokines, cytokine receptors, cell surface receptors, intrinsic restriction factors, and viral glycoproteins. This method was also successfully used in the structural determination of the trimeric ebolavirus glycoprotein 5,10.
In conclusion, this platform offers ease of use, speed and scalability while maximizing protein quality and functionality. Moreover, no additional equipment, other than a standard humidified CO2 incubator, is required. This procedure may be rapidly expanded to systems of greater complexity, such as co-expression of protein complexes, antigens and antibodies, production of virus-like particles for vaccines, or production of adenoviruses or lentiviruses for transduction of difficult cell lines.

In the post-human genomics era, the availability of recombinant proteins in native conformations is crucial to structural, functional and therapeutic research and development. Here, we describe a test- and large-scale protein expression system in human embryonic kidney 293T cells that can be used to produce a variety of recombinant proteins.

Eine bequeme und allgemein Expression Plattform für die Produktion von sekretierten Proteinen aus menschlichen Zellen

Recombinant protein expression in bacteria, typically E. coli, has been the most successful strategy for milligram quantity expression of proteins. ...

Biologie

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 protein variants encoded by the var genes.
The haploid P. falciparum genome harbors approximately 60 different var genes of which only one has been believed to be transcribed per cell at a time during the blood stage of the infection. How such mutually exclusive regulation of var gene transcription is achieved is unclear, as is the identification of individual var genes or sub-groups of var genes associated with different receptors and the consequence of differential binding on the clinical outcome of P. falciparum infections. Recently, the mutually exclusive transcription paradigm has been called into doubt by transcription assays based on individual P. falciparum transcript identification in single infected erythrocytic cells using RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) analysis of var gene transcription by the parasite in individual nuclei of P. falciparum IE1.
Here, we present a detailed protocol for carrying out the RNA-FISH methodology for analysis of var gene transcription in single-nuclei of P. falciparum infected human erythrocytes. The method is based on the use of digoxigenin- and biotin- labeled antisense RNA probes using the TSA Plus Fluorescence Palette System2 (Perkin Elmer), microscopic analyses and freshly selected P. falciparum IE. The in situ hybridization method can be used to monitor transcription and regulation of a variety of genes expressed during the different stages of the P. falciparum life cycle and is adaptable to other malaria parasite species and other organisms and cell types.

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

Fluorescent in situ hybridization (FISH) to identify mRNA transcripts in individual cells allows analysis of polygenic activity such as the simultaneous transcription of more than one member of the var multigene family in Plasmodium falciparum infected erythrocytes 1. The technique is adaptable and can be used on different types of genes, cells and organisms.

Analyse von Einzel-Zell-Gene Transkription durch RNA-Fluorescent<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisierung (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

Generating Genetically Modified Plasmodium berghei Sporozoites

Malaria is a deadly disease caused by the parasite Plasmodium and is transmitted through the bite of female Anopheles mosquitoes. The sporozoite stage of Plasmodium deposited by mosquitoes in the skin of vertebrate hosts undergoes a phase of mandatory development in the liver before initiating clinical malaria. We know little about the biology of Plasmodium development in the liver; access to the sporozoite stage and the ability to genetically modify such sporozoites are critical tools for studying the nature of Plasmodium infection and the resulting immune response in the liver. Here, we present a comprehensive protocol for the generation of transgenic Plasmodium berghei sporozoites. We genetically modify blood-stage P. berghei and use this form to infect Anopheles mosquitoes when they take a blood meal. After the transgenic parasites undergo development in the mosquitoes, we isolate the sporozoite stage of the parasite from the mosquito salivary glands for in vivo and in vitro experimentation. We demonstrate the validity of the protocol by generating sporozoites of a novel strain of P. berghei expressing the green fluorescent protein (GFP) subunit 11 (GFP11), and show how it could be used to investigate the biology of liver-stage malaria.

Generating Genetically Modified Plasmodium berghei Sporozoites

Malaria is transmitted through inoculation of the sporozoite stage of Plasmodium by infected mosquitoes. Transgenic Plasmodium has allowed us to understand the biology of malaria better and has contributed directly to malaria vaccine development efforts. Here, we describe a streamlined methodology to generate transgenic Plasmodium berghei sporozoites.

Gentechnisch veränderte Plasmodium berghei Sporozoiten

Malaria is a deadly disease caused by the parasite Plasmodium and is transmitted through the bite of female Anopheles mosquitoes. The sporozoite stage of ...

Recombinant Protein Expression for Structural Biology in HEK 293F Suspension Cells: A Novel and Accessible Approach

The expression and purification of large amounts of recombinant protein complexes is an essential requirement for structural biology studies. For over two decades, prokaryotic expression systems such as E. coli have dominated the scientific literature over costly and less efficient eukaryotic cell lines. Despite the clear advantage in terms of yields and costs of expressing recombinant proteins in bacteria, the absence of specific co-factors, chaperones and post-translational modifications may cause loss of function, mis-folding and can disrupt protein-protein interactions of certain eukaryotic multi-subunit complexes, surface receptors and secreted proteins. The use of mammalian cell expression systems can address these drawbacks since they provide a eukaryotic expression environment. However, low protein yields and high costs of such methods have until recently limited their use for structural biology. Here we describe a simple and accessible method for expressing and purifying milligram quantities of protein by performing transient transfections of suspension grown HEK (Human Embryonic Kidney) 293F cells.

The expression of recombinant proteins by mammalian systems is becoming an attractive method for producing protein complexes for structural biology. Here we present a simple yet highly efficient expression system using suspension grown mammalian cells to purify protein complexes for structural studies.

Expression rekombinanter Proteine ​​für Strukturbiologie in HEK 293F Suspensionszellen: eine neue und Barriere Ansatz

The expression and purification of large amounts of recombinant protein complexes is an essential requirement for structural biology studies. For over two ...

<meta charset="utf8"></head><body>Optimiertes Protokoll für die Herstellung von Leishmania Translational Extract (LTE)

Production and Optimization of LTE, a Leishmania tarentolae Derived Cell-Free Protein Expression System for Recombinant Protein Production

This protocol outlines the production and optimization of a eukaryotic Cell-Free Protein Expression System (CFPS) derived from the unicellular flagellate Leishmania tarentolae, referred to as Leishmania Translational Extract or LTE. Although this organism originally evolved as a parasite of geckos, it can be cultivated easily and inexpensively in flasks or bioreactors. Unlike Leishmania major, it is non-pathogenic to humans and does not require special laboratory precautions. Another advantage of using Leishmania for CFPS is that the addition of a single antisense oligonucleotide to the CFPS, targeting a conserved splice leader sequence on the 5'-end of all protein-coding RNAs, can suppress endogenous protein expression. We provide procedures for cell disruption and lysate processing, which have been simplified and improved compared to previous versions. These procedures start with simple flask cultures. Additionally, we explain how to introduce genetic information using vectors containing species-independent translation initiation sites (SITS) and how to perform straightforward batch optimization and quality control to ensure consistent protein expression quality.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor im Rampenlicht: Proteinproduktion mit dem eukaryotischen zellfreien Proteinexpressionssystem LTE

Leishmania Translational Extract (LTE) is a eukaryotic cell-free protein expression system derived from the single-celled parasite, Leishmania tarentolae. This optimized protocol makes LTE simple and cost-effective to manufacture. It is suitable for various applications focused on the multiparallel expression and study of complex eukaryotic proteins and their interactions.

Produktion und Optimierung von LTE, einem von Leishmania tarentolae abgeleiteten zellfreien Proteinexpressionssystem für die rekombinante Proteinproduktion

This protocol outlines the production and optimization of a eukaryotic Cell-Free Protein Expression System (CFPS) derived from the unicellular flagellate ...

Basierend HeLa Zellfreie Expressionssysteme zur Expression von

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Pflanzliche Proteine in Insektenzellen abgesondert ändern Baculovirus Expressionsvektoren herstellen

High Yield Reinigung von

Methoden, um die regulatorische Rolle kleiner RNAs und Ribosomal Belegung von Untersuchen

Eine bequeme und allgemein Expression Plattform für die Produktion von sekretierten Proteinen aus menschlichen Zellen

Analyse von Einzel-Zell-Gene Transkription durch RNA-Fluorescent

Gentechnisch veränderte Plasmodium berghei Sporozoiten

Expression rekombinanter Proteine für Strukturbiologie in HEK 293F Suspensionszellen: eine neue und Barriere Ansatz

Produktion und Optimierung von LTE, einem von Leishmania tarentolae abgeleiteten zellfreien Proteinexpressionssystem für die rekombinante Proteinproduktion

Produktion und Optimierung von LTE, einem von Leishmania tarentolae abgeleiteten zellfreien Proteinexpressionssystem für die rekombinante Proteinproduktion

Produktion und Optimierung von LTE, einem von Leishmania tarentolae abgeleiteten zellfreien Proteinexpressionssystem für die rekombinante Proteinproduktion

Basierend HeLa Zellfreie Expressionssysteme zur Expression von

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Gentechnisch veränderte Plasmodium berghei Sporozoiten

Expression rekombinanter Proteine ​​für Strukturbiologie in HEK 293F Suspensionszellen: eine neue und Barriere Ansatz

Produktion und Optimierung von LTE, einem von Leishmania tarentolae abgeleiteten zellfreien Proteinexpressionssystem für die rekombinante Proteinproduktion

Produktion und Optimierung von LTE, einem von Leishmania tarentolae abgeleiteten zellfreien Proteinexpressionssystem für die rekombinante Proteinproduktion

Produktion und Optimierung von LTE, einem von Leishmania tarentolae abgeleiteten zellfreien Proteinexpressionssystem für die rekombinante Proteinproduktion

Expression rekombinanter Proteine für Strukturbiologie in HEK 293F Suspensionszellen: eine neue und Barriere Ansatz