Os autores agradecem Alex Schier para gentilmente compartilhar a linhagem transgênica Zebrabow-M, Geoffrey Burns, para o vetor pDEST e Renee Ethier-Daigle para excelente atendimento das instalações e linhas de peixe. FINANCIAMENTO: Estamos gratos pelo apoio generoso financiamento do NIDCR RO3DE024490 e Shriners Hospitals for Children (ECL) e bolsas de formação pós-doutoramento do Shriners Hospitals for Children (LR e YK).

Cuidado e Uso Comitê Massachusetts General Hospital Institucional Animal (IACUC) aprovou todas as operações sob o protocolo de número # 2010N000106. Isso está em conformidade com a Associação de Avaliação e Acreditação do Laboratório Animal Care International (AAALAC) orientações. 1. Os reagentes e materiais de preparação <ol><li> Prepare 1 L de 50X meio de embrião E3 (Ver Tabela 1) e preparar-se 1 L de meio de embrião E3 1X (Ver Tabela 2). </li><li> Prepare meio embrião E3 com N-feniltioureia (PTU) por adição de 30 mg de PTU a 1 L de 1X E3. Agitar O / N para assegurar que o PTU se ter dissolvido completamente. Armazenar à temperatura ambiente. </li><li> Para preparar a solução de pronase, diluir 150 uL de pronase (0,5 mg / ml) com 15 ml de 1X E3. Este montante é suficiente para uma placa de Petri. Utilizar imediatamente. </li><li> Prepare solução de metilcelulose. <ol><li> Preparar a solução E3-tricaina por mistura de 75 ml de 0,2% com 25 ml tricaina1X da E3. Ferver 3 g de metilcelulose em 75 ml de solução E3-tricaina. </li><li> Completar o volume final de 100 ml com solução E3-tricaina. A solução final metilcelulose é viscosa e opaco com uma tonalidade amarelada. Armazenamento: RT protegido contra a luz. </li></ol></li><li> Estoque Tamoxifen e solução de indução <ol><li> Prepare 5 mM de solução stock de tamoxifeno por dissolução de 4-hidroxitamoxifeno em etanol a 100%. Estoque armazenar a -80 ° C. </li><li> Preparar fresco diluição de Tamoxifen à concentração desejo em 1X E3 para obter a solução de indução. CUIDADO! Por favor, consultar o MSDS, antes de usar. </li></ol></li><li> Prepare 1 L de 0,2% tricaina conforme indicado na Tabela 3. </li><li> Obter lâminas confocal. Cole quatro lamela (18 x 18) em conjunto para formar um bloco, em seguida, colocá-2 em blocos de 24 x 60 cm de distância lamela 2 para permitir a montagem do embrião no meio. </li></ol> 2. Preparação de Embriões <ol><li> Linhagens transgênicas. <br/&gt; NOTA: Zebrabow-M foi uma oferta generosa do laboratório de Alex Schier. </li><li> SOX10: ERT2-Cre NOTA: Gerar o vector alvo pDestTol2- SOX10: ERT2-Cre usando métodos de clonagem molecular padrão e comercialmente obtido recombinação tecnologia de clonagem. <ol><li> Combinar 5 &#39;clone de entrada (pENTR5&#39;- sox10p) contendo o promotor de 7.2Kb SOX10, um clone meio Gateway (PME-ERT2-Cre), e uma 3&#39; do clone de entrada (pENTR3&#39;-poliA) numa reacção com LR destino lente vetor pDestTol2- α-cristalina: YFP. </li><li> Purificar construto pDestTol2- SOX10: ERT2-Cre. A co-injectar o construto purificado (100 ng / ul) com Tol2 ARNm da transposase (50 ng / ul) em embriões de WT (F0) no estádio de uma célula. </li><li> Tela fundadores F0 adultos para a transmissão da linha germinal com base na forte fluorescência amarela em embriões de F1. </li></ol></li><li> SOX10: ERT2-Cre; Zebrabow-M <ol><li> Outcross o Zebrabow-Mline (2.1.1) com a SOX10: linhagem transgênica ERT2-Cre. </li><li> Selecionar embriões que apresentam uma forte expressão RFP onipresente e marcador lente YFP e cultivá-las até adultos. </li></ol></li></ol> Coleção 3. Embryo <ol><li> Configure vários pares de SOX10: ERT2-Cre; Zebrabow-M peixes-zebra transgénicos cinco horas - seis horas no Dia 1. </li><li> No dia seguinte, retire os divisores de manhã e recolher os ovos em torno de meio-dia. </li><li> Transferi-los para placas de petri e adicionar 15 ml da solução de pronase a dechorionate os embriões. </li><li> Incubar os embriões de 1 a 5 min, até cerca de 60% dos embriões foram dechorionated. Parar a reacção por decantação da solução de pronase e lavar os embriões 3-4 vezes com meio fresco E3. </li><li> Incubar os embriões dechorionated na E3 na RT O / N e deixá-los a desenvolver para chegar à fase 10 somitos. Incubar 50-60 embriões por embreagem para evitar o crescimento de desenvolvimento diferente. </li></ol&gt; 4. Tratamento <ol><li> Verifique estágio de desenvolvimento dos embriões no âmbito de um campo de microscópio de luz para garantir que eles estão em fase de 10 somitos. </li><li> Usando um microscópio de fluorescência com uma proteína fluorescente (RFP) filtro vermelho, isolar os embriões vermelhos brilhantes. </li><li> Proceda à indução da Cre-recombinação pela adição de 10 uM de solução hidroxitamoxifeno numa placa de Petri e incubou-se os embriões isolados a 28,5 ° C durante 3 h. </li><li> Decantar a solução tamoxifeno e lavar os embriões várias vezes com E3. CUIDADO! descartar a solução tamoxifeno em um recipiente especial resíduos biológicos. </li><li> Incubar os embriões a 28,5 ° CO / N. </li><li> Quando os embriões são aproximadamente a 28-29 fase somites (cerca de 24 horas após a fertilização), incubar os embriões a 28,5 ° C na E3-PTU solução a seguir. NOTA: o PTU é aqui utilizado para inibir a formação de melanóforos nos embriões em desenvolvimento. Este tratamento é necessárioevitar a distorção do sinal de fluorescência por melanóforos auto-fluorescente. </li><li> Incubar os embriões a 28,5 ° C </li></ol> 5. Seleção de Embriões <ol><li> Para visualizar as estruturas craniofaciais totalmente desenvolvidas, seleccionar os embriões em 4 dias após a fertilização para a intensidade do sinal vermelho e Cre marcador expressão positividade (amarelo na retina). </li><li> Anestesiar os embriões com uma solução de E3 / 0,015% tricaina. A anestesia é confirmado quando há movimentos ativos ou atividade fin é observado quando cutucando delicadamente o embrião. </li></ol> 6. Montagem do embrião em metilcelulose <ol><li> Transferir o embrião seleccionado para a imagem latente numa placa de Petri contendo uma gota de metilcelulose e embalsamar suavemente o embrião com metilcelulose. </li><li> Em um slide confocal limpo, coloque uma gota de metilcelulose fresco e montar o seu embrião dentro da gota utilizando uma ponta microloader. Posição embrião dorsal tomando cuidado para não tocaro embrião directamente. </li><li> Cobrir o embrião montadas com uma lamela de 25 x 25 e ajustar a posição do embrião, se necessário através da manipulação da lamela. </li><li> O embrião está agora pronto para a imagem. </li></ol> 7. Análise por Microscopia de Fluorescência <ol><li> Use a objetiva de 20x lente seca (abertura numérica 0,75; tamanho pinhole 2,0 mm) para focar o embrião. </li><li> Pressione o botão L100 no microscópio e selecionar os canais do software. </li><li> Selecione o botão de configuração confocal e clicar em &#39;auto&#39; e selecionar as seguintes canais antes de fechar a janela: Ch1: PCP, Ch2: GFP, Ch3: RFP ou mCherry </li><li> Ligue CH2 e CH3 antes de clicar no botão &quot;remover interlock&quot;. Clique em &#39;play&#39; para iniciar a digitalização. </li><li> Concentre-se em estrutura de interesse, que é o melhor feito por começando com moldura ½ / seg e alta tensão (HV) 150 e, em seguida, ajustar as configurações de acordo até a qualidade de imagem desejada é achieved. A RFP seria mais brilhante do que as outras cores, por conseguinte, ajustar o HV. Mude a posição Z para encontrar tanto YFP e células positivas RFP. </li><li> Uma vez definido com as configurações, capturar a imagem de seu embrião. Salvar a imagem no formato confocal formato de software de imagem e TIFF para processamento de imagem em cada canal de divisão. </li><li> Em seguida, para a imagem latente PCP, desligue CH2 e CH3 e ligue Ch1. Re-ajustar as configurações como no passo 5 sem mudar a área de foco. NOTA: PCP pode ser muito difícil de detectar devido ao sinal de fundo em azul canal que pode ser contornado, ajustando o tamanho pinhole. Um tamanho maior pinhole permite uma melhor detecção de fluorescência, reduzindo ruído / sinal de fundo. No entanto, uma pinhole maiores reduzirá efeito confocal, comprometer a qualidade da imagem. Portanto, é necessário um ajuste cuidadoso das configurações para obter a qualidade de imagem desejada e intensidade. </li><li> Capturar a imagem e salvá-lo no formato de ambos (software confocal e TIFF) para processamento de imagens. As imagens podem então ser processados ​​usando software de processamento de imagem comum para mesclar camadas e melhorar as configurações de cores como descrito por Pan e colegas 8. </li></ol>

<ol>
	<li>Dougherty, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+requirements+for+wnt9a+and+irf6+in+extension+and+integration+mechanisms+during+zebrafish+palate+morphogenesis.">Distinct requirements for wnt9a and irf6 in extension and integration mechanisms during zebrafish palate morphogenesis.</a> Development. 140, 76-81 (2013).</li><li>Dougherty, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+fate+map+of+first+pharyngeal+arch+structures+in+the+sox10:+kaede+zebrafish+transgenic+model.">Embryonic fate map of first pharyngeal arch structures in the sox10: kaede zebrafish transgenic model.</a> The Journal of craniofacial surgery. 23, 1333-1337 (2012).</li><li>Eberhart, J. K., Swartz, M. E., Crump, J. G., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+Hedgehog+signaling+from+neural+to+oral+epithelium+organizes+anterior+craniofacial+development.">Early Hedgehog signaling from neural to oral epithelium organizes anterior craniofacial development.</a> Development. 133, 1069-1077 (2006).</li><li>Dixon, M. J., Marazita, M. L., Beaty, T. H., Murray, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleft+lip+and+palate:+understanding+genetic+and+environmental+influences.">Cleft lip and palate: understanding genetic and environmental influences.</a> Nature reviews Genetics. 12, 167-178 (2011).</li><li>Gfrerer, L., Dougherty, M., Liao, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+craniofacial+development+in+the+sox10:+kaede+transgenic+zebrafish+line+using+time-lapse+confocal+microscopy.">Visualization of craniofacial development in the sox10: kaede transgenic zebrafish line using time-lapse confocal microscopy.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , e50525 (2013).</li><li>McCollum, C. W., Ducharme, N. A., Bondesson, M., Gustafsson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+toxicity+screening+in+zebrafish.+Birth+defects+research.">Developmental toxicity screening in zebrafish. Birth defects research.</a> Part C, Embryo today : reviews. 93, 67-114 (2011).</li><li>Mossey, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dental+education+and+CPD:+are+you+being+served.">Dental education and CPD: are you being served.</a> British dental journal. Suppl, 3-4 (2002).</li><li>Pan, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrabow:+multispectral+cell+labeling+for+cell+tracing+and+lineage+analysis+in+zebrafish.">Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish.</a> Development. 140, 2835-2846 (2013).</li><li>Vieira, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Journal of dental research. 87, 119-125 (2008).</li><li>Le Pabic, P., Ng, C., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fat-Dachsous+Signaling+Coordinates+Cartilage+Differentiation+and+Polarity+during+Craniofacial+Development.">Fat-Dachsous Signaling Coordinates Cartilage Differentiation and Polarity during Craniofacial Development.</a> PLoS genetics. 10, e1004726 (2014).</li><li>Ricks, J. E., Ryder, V. M., Bridgewater, L. C., Schaalje, B., Seegmiller, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+mandibular+development+precedes+the+time+of+palate+closure+in+mice+homozygous+for+disproportionate+micromelia:+an+oral+clefting+model+supporting+the+Pierre-Robin+sequence.">Altered mandibular development precedes the time of palate closure in mice homozygous for disproportionate micromelia: an oral clefting model supporting the Pierre-Robin sequence.</a> Teratology. 65, 116-120 (2002).</li><li>Javidan, Y., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+cartilage+and+bone.">Development of cartilage and bone.</a> Methods in cell biology. 76, 415-436 (2004).</li><li>McCarthy, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pdgfra+protects+against+ethanol-induced+craniofacial+defects+in+a+zebrafish+model+of+FASD.">Pdgfra protects against ethanol-induced craniofacial defects in a zebrafish model of FASD.</a> Development. 140, 3254-3265 (2013).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Linhas transgénicas e azul Alcian photoconvertible como descrito acima complementa uns aos outros para definir o processo complicado de cartilagem e desenvolvimento ósseo. No entanto, a migração celular ao vivo e organização durante a organogénese tem sido a hipótese e, indiretamente, mas nunca demonstrou visualizado. A linha transgénica Zebrabow-H acoplado com uma cartilagem Cre específica permite a observação vivo simultânea de todos estes eventos distintas envolvidas na formação do osso e cartilagem. E...

Desenvolvimento craniofacial requer, interacções celulares e teciduais moleculares complexas para conduzir a proliferação celular, migração e diferenciação 1,2, 3. Este processo bem regulado e complexo está sujeito a perturbações genéticas e ambientais, de tal forma que deformidades craniofaciais estão entre as malformações congénitas mais comuns 1-9. Enquanto intervenções cirúrgicas continuam a ser a base do tratamento para anomalias craniofaciais, compreender a base de desenvolvimento é essencial para inovar futuras terapias. Portanto, estudar a morfogênese e os mecanismos para a convergência e extensão e integração de células proporciona novos insights sobre a formação do esqueleto craniofacial 1. Cranial migração e de crista neural preencher o primeiro arco faríngeo, processos mandibulares então formar pares que se estendem para formar cartilagem de Meckel, o que prefigura a mandíbula. Morfogênese of cartilagem de Meckel exige organização dos condrócitos via proliferação direcional, polarização e diferenciação celular 1,10. No entanto, a complexidade da organização dos condrócitos no crescimento e extensão da cartilagem de Meckel permanece obscuro. Entender o comportamento de células dinâmica é fundamental para compreender malformações congênitas que afetam o tamanho da mandíbula, como fenótipos mandibulares hipoplásicos 11. Zebrafish embriões oferecem muitas vantagens de desenvolvimento e genéticos para estudo detalhado da cartilagem de Meckel morfogênese. Sua rastreabilidade genética, transparência, ex vivo e rápido desenvolvimento são vantagens poderosas emprestando-lhe bem para observação do movimento celular e organização de imagens ao vivo 6. Usando ferramentas de rastreamento de linhagem, tais como: SOX10 linhagem transgênica kaede, nós e outros delinearam as origens da crista neural do esqueleto craniofacial embrionário 1,5. Using a SOX10: ERT2-Cre com o ubi: linhagem transgênica Zebrabow-M, é agora possível explorar detalhes de movimentos celulares durante o desenvolvimento craniofacial. O Zebrabow-H, é uma linha transgénica desenvolvida com o promotor da ubiquitina que conduz a expressão de fluoróforos diferentes, cada um flanqueado por locais lox 8. O fluoróforo padrão Zebrabow-M é Vermelho, expressando RFP. Após indução da expressão de Cre, o Zebrabow-H construir recombina e células expressam uma combinação de diferentes fluoróforos (RFP, CFP e YFP), criando expressão multi-espectral no embrião. Todas as células filhas que dividem a partir das células marcadas após o evento de recombinação são então clonalmente marcado, de modo que as populações de células que derivam de diferentes progenitoras justapostas são clonalmente marcado. Por esta marcação celular clonagem, células proliferação e migração com resolução clonal pode ser seguido (Figura 1 e 2).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Roche Life Sciences</td>
			<td>10165921001</td>
			<td>Prepare 500 &#956;L stock aliquots at 50mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcellulose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTU (N-Phenylthiourea)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7619</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-HydoxyTamoxifen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 x 60 coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-548-5P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 x 18 coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-540A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 x 25 coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-540C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pENTR5&#39;-TOPO TA Cloning Kit</td>
			<td>Life technologies&#160;</td>
			<td>K591-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pENTR/D-TOPO Cloning Kit&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>K2400-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pENTR3&#39;-pA</td>
			<td>Tol2Kit</td>
			<td>302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pDEST</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Gift from Geoffrey Burns labs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright field microscope&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of chondrocyte intercalation and directional proliferation via zebrabow clonal cell analysis in the embryonic meckel&#8217;s cartilage

Desenvolvimento das estruturas craniofaciais vertebrados requer uma coordenação precisa de migração celular, a proliferação, a adesão e a diferenciação. Padronização da cartilagem de Meckel, um primeiro arco derivado da faringe, envolve a migração das células da crista neural cranial (CNC) e do particionamento progressiva, proliferação e organização dos condrócitos diferenciados. Vários estudos têm descrito a migração CNC durante inferior morfogênese mandíbula, mas os detalhes de como alcançar os condrócitos organização no crescimento e extensão da cartilagem de Meckel permanece obscuro. O SOX10 restrito e Cre recombinase mediada por recombinação induzida quimicamente gera permutações de proteínas fluorescentes diferentes (RFP, YFP e PCP), criando, assim, um rótulo multi-espectral de células progenitoras e a sua descendência, que reflecte as populações clonais distintos. Usando fotografia confocal time-lapse, é possível observar os condrócitos behaviou durante o desenvolvimento da cartilagem do peixe-zebra de Meckel. Rotulagem célula Multispectral permite aos cientistas demonstrar extensão de condrócitos de Meckel. Durante a fase de extensão da cartilagem de Meckel, o que prefigura a mandíbula, condrócitos intercalar para efetuar extensão como eles se comportam em uma fileira em camadas de uma única célula organizada. A falha deste processo de intercalação organizado para mediar extensão célula fornece a explicação mecanicista celular para mandíbula hipoplásica que observamos em malformações mandibulares.

Visualização cartilagem tradicional pela montagem Alcian manchas azuis inteiras tem sido inestimável para observar o desenvolvimento da cartilagem de Meckel e comumente usado para visualizar celular organização 12 (Figura 1A) final. Para analisar melhor os condrócitos em desenvolvimento horas extras, linhagem rastreamento usando SOX10: linhagens transgênicas Kaede nos permitiu estudar a migração de células, a convergência ea extensão em embriões vivos 2,12 <st...

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Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic Meckel&amp;#8217;s Cartilage

Organização celular dos ossos craniofaciais tem sido a hipótese, mas nunca diretamente visualizado. Rotulagem célula multi-espectral e in vivo ao vivo imaging permite a visualização do comportamento das células dinâmica no peixe-zebra maxilar inferior. Aqui, nós detalhe o protocolo para manipular Zebrabow peixes transgénicos e observar diretamente intercalação celular e alterações morfológicas de condrócitos na cartilagem de Meckel.

Visualização de condrócitos Intercalation e Direcional Proliferação via Zebrabow Análise celular clonal na cartilagem de Meckel o Embryonic

Development of the vertebrate craniofacial structures requires precise coordination of cell migration, proliferation, adhesion and differentiation. ...

visualization-chondrocyte-intercalation-directional-proliferation-via

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic Meckel&#8217;s Cartilage

9.0K visualizações.  Harvard Medical School.  Organização celular dos ossos craniofaciais tem sido a hipótese, mas nunca diretamente visualizado. Rotulagem célula multi-espectral e in vivo ao vivo imaging permite a visualização do comportamento das células dinâmica no peixe-zebra maxilar inferior. Aqui, nós detalhe o protocolo para manipular Zebrabow peixes transgénicos e observar diretamente intercalação celular e alterações morfológicas de condrócitos na cartilagem de Meckel. 

Vídeo: Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic Meckel&#8217;s Cartilage

Analysis of Coronary Vessels in Cleared Embryonic Hearts

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard microscopy techniques, due to the scattering of imaging light by the thick heart tissue, as these vessels are localized deep within the walls of the developing heart. As optical clearing of tissues using organic solvents such as BABB (1 part benzyl alcohol to 2 parts benzyl benzoate) has been shown to greatly improve the optical penetration depth that can be achieved, we combined clearance of whole, PECAM1-immunostained hearts, with laser-scanning confocal microscopy, in order to obtain high-resolution images of vessels throughout the entire heart. BABB clearance of embryonic hearts takes place rapidly and also acts to preserve the fluorescent signal for several weeks; in addition, samples can be imaged multiple times without loss of signal. This straightforward method is also applicable to imaging other types of blood vessels in whole embryos.

We present a protocol for the analysis of coronary vessels in whole embryonic murine hearts up to E15.5, using standard immunological staining methods followed by optical clearance and confocal microscopy. This technique enables visualization of blood vessels throughout the entire heart without the need for time-consuming analysis of serial sections.

Análise de vasos coronarianos nos corações embrionárias Cancelado

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard ...

Biologia do Desenvolvimento

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

The dedifferentiation of hyaline chondrocytes into fibroblastic chondrocytes often accompanies monolayer expansion of chondrocytes in vitro. The global DNA methylation level of chondrocytes is considered to be a suitable biomarker for the loss of the chondrocyte phenotype. However, results based on different experimental methods can be inconsistent. Therefore, it is important to establish a precise, simple, and rapid method to quantify global DNA methylation levels during chondrocyte dedifferentiation.
Current genome-wide methylation analysis techniques largely rely on bisulfite genomic sequencing. Due to DNA degradation during bisulfite conversion, these methods typically require a large sample volume. Other methods used to quantify global DNA methylation levels include high-performance liquid chromatography (HPLC). However, HPLC requires complete digestion of genomic DNA. Additionally, the prohibitively high cost of HPLC instruments limits HPLC&#39;s wider application.
In this study, genomic DNA (gDNA) was extracted from human chondrocytes cultured with varying number of passages. The gDNA methylation level was detected using a methylation-specific dot blot assay. In this dot blot approach, a gDNA mixture containing the methylated DNA to be detected was spotted directly onto an N+ membrane as a dot inside a previously drawn circular template pattern. Compared with other gel electrophoresis-based blotting approaches and other complex blotting procedures, the dot blot method saves significant time. In addition, dot blots can detect overall DNA methylation level using a commercially available 5-mC antibody. We found that the DNA methylation level differed between the monolayer subcultures, and therefore could play a key role in chondrocyte dedifferentiation. The 5-mC dot blot is a reliable, simple, and rapid method to detect the general DNA methylation level to evaluate chondrocyte phenotype.

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

We present a method to quantify DNA methylation based on the 5-methylcytosine (5-mC) dot blot. We determined the 5-mC levels during chondrocyte dedifferentiation. This simple technique could be used to quickly determine the chondrocyte phenotype in ACI treatment.

Um Ensaio de Blot de Ponto de 5 mC Quantificando o Nï¿½el de Metilaï¿½o de ADN da Dediferenciaï¿½o de Condrocitos<em&gt; In Vitro</em

The dedifferentiation of hyaline chondrocytes into fibroblastic chondrocytes often accompanies monolayer expansion of chondrocytes in vitro. The global ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The efficient in vivo visualization of blood vessels and the reliable quantification of their complexity are key to understanding the biology and disease of the vascular network. Here, we provide a detailed method to visualize blood vessels with a commercially available fluorescent dye, human plasma acetylated low density lipoprotein DiI complex (DiI-AcLDL), and to quantify their complexity in Xenopus tropicalis. Blood vessels can be labeled by a simple injection of DiI-AcLDL into the beating heart of an embryo, and blood vessels in the entire embryo can be imaged in live or fixed embryos. Combined with gene perturbation by the targeted microinjection of nucleic acids and/or the bath application of pharmacological reagents, the roles of a gene or of a signaling pathway on vascular development can be investigated within one week without resorting to sophisticated genetically engineered animals. Because of the well-defined venous system of Xenopus and its stereotypic angiogenesis, the sprouting of pre-existing vessels, vessel complexity can be quantified efficiently after perturbation experiments. This relatively simple protocol should serve as an easily accessible tool in diverse fields of cardiovascular research.

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

This protocol demonstrates a fluorescence-based method to visualize the vasculature and to quantify its complexity in Xenopus tropicalis. Blood vessels can be imaged minutes after the injection of a fluorescent dye into the beating heart of an embryo after genetic and/or pharmacological manipulations to study cardiovascular development in vivo.

Visualização e Análise Quantitativa da Angiogênese Embrionária<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth factors, and extracellular matrix. The ability of HSCs to remain quiescent, self-renew or differentiate, and acquire mutations and become malignant depends upon the complex interactions they establish with different stromal components. To observe the crosstalk between human HSCs and the human BM niche in physiological and pathological conditions, we designed a protocol to ectopically model and image a humanized BM niche in immunodeficient mice. We show that the use of different cellular components allows for the formation of humanized structures and the opportunity to sustain long-term human hematopoietic engraftment. Using two-photon microscopy, we can live-image these structures in situ at the single-cell resolution, providing a powerful new tool for the functional characterization of the human BM microenvironment and its role in regulating normal and malignant hematopoiesis.

A method to create and live-image different humanized bone-marrow niches in mice is presented. Based on the supportive niche created by human mesenchymal cells, the addition of human endothelial cells induces the formation of human vessels, while the addition of rhBMP-2 induces the formation of human-mouse chimeric mature bone tissue.

Bioengenharia de microrganismos humanizados de medula óssea no mouse e sua visualização por imagem ao vivo

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

Clonal Analysis of Embryonic Hematopoietic Stem Cell Precursors Using Single Cell Index Sorting Combined with Endothelial Cell Niche Co-culture

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early embryo and the lack of assays that functionally identify the long-term multilineage engraftment potential of individual putative HSC precursors. Here, we describe methodology that enables the isolation and characterization of functionally validated HSC precursors at the single cell level. First, we utilize index sorting to catalog the precise phenotypic parameter of each individually sorted cell, using a combination of phenotypic markers to enrich for HSC precursors with additional markers for experimental analysis. Second, each index-sorted cell is co-cultured with vascular niche stroma from the aorta-gonad-mesonephros (AGM) region, which supports the maturation of non-engrafting HSC precursors to functional HSC with multilineage, long-term engraftment potential in transplantation assays. This methodology enables correlation of phenotypic properties of clonal hemogenic precursors with their functional engraftment potential or other properties such as transcriptional profile, providing a means for the detailed analysis of HSC precursor development at the single cell level.

Here we present methodology for the clonal analysis of hematopoietic stem cell precursors during murine embryonic development. We combine index sorting of single cells from the embryonic aorta-gonad-mesonephros region with endothelial cell co-culture and transplantation to characterize the phenotypic properties and engraftment potential of single hematopoietic precursors.

Análise clonal de precursores embrionárias células-tronco hematopoiéticas usando índice de célula única classificação combinada com células endoteliais nicho co-cultura

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early ...

Visualization of Tangential Cell Migration in the Developing Chick Optic Tectum

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture can be recorded under video microscopy. For analyzing cell migration in the developing brain, slice culture is commonly used to observe cell migration parallel to the slice section, such as radial cell migration. However, limited information can be obtained from the slice culture method to analyze cell migration perpendicular to the slice section, such as tangential cell migration. Here, we present the protocols for time-lapse imaging to visualize tangential cell migration in the developing chick optic tectum. A combination of cell labeling by electroporation in ovo and a subsequent flat-mount culture on the cell culture insert enables detection of migrating cell movement in the horizontal plane. Moreover, our method facilitates detection of both individual cell behavior and the collective action of a group of cells in the long term. This method can potentially be applied to detect the sequential change of the fluorescent-labeled micro-structure, including the axonal elongation in the neural tissue or cell displacement in the non-neural tissue.

We describe the methods for fluorescent labeling of tangentially migrating cells by electroporation, and for time-lapse imaging of the labeled cell movement in a flat-mount culture in order to visualize migrating cell behavior in the developing chick optic tectum.

Visualização da migração celular tangencial no desenvolvimento Tectum óptica de Chick

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture ...

In Vitro Assays to Evaluate the Migration, Invasion, and Proliferation of Immortalized Human First-trimester Trophoblast Cell Lines

Cell movement is a critical property of trophoblasts during placental development and early pregnancy. The significance of proper trophoblast migration and invasion is demonstrated by pregnancy disorders such as pre-eclampsia and intrauterine growth restriction, which are associated with inadequate trophoblast invasion of the maternal vasculature. Unfortunately, our understanding of the mechanisms by which the placenta develops from migrating trophoblasts is limited. In vitro analysis of cell migration via the scratch assay is a useful tool in identifying factors that regulate trophoblast migratory capacity. However, this assay alone does not define the cellular changes that can result in altered cell migration. This protocol describes three different in vitro assays that are used collectively to evaluate trophoblast cell movement: the scratch assay, the invasion assay, and the proliferation assay. The protocols described here may also be modified for use in other cell lines to quantify cell movement in response to stimuli. These methods allow investigators to identify individual factors that contribute to the cell movement and provide a thorough examination of potential mechanisms underlying apparent changes in cell migration.

Here, we present a highly accessible protocol for evaluating the cell movement in human trophoblast cells using three in vitro assays: the scratch assay, the transwell invasion assay, and the cell proliferation assay.

Em Vitro ensaios para avaliar a migração, invasão e proliferação de linhas de células humanas imortalizado primeiro trimestre trofoblasto

Cell movement is a critical property of trophoblasts during placental development and early pregnancy. The significance of proper trophoblast migration ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a general challenge in developmental biology research. In the embryonic heart, this can be particularly difficult as regional differences in the expression of transcriptional regulators, paracrine/juxtacrine signaling cues, and hemodynamic force are all known to influence cardiomyocyte maturation. A simplified method to alter a developing cardiomyocyte's molecular and biomechanical microenvironment would, therefore, serve as a powerful technique to examine how local conditions influence cell fate and function. To address this, we have optimized a method to physically transplant juvenile cardiomyocytes into ectopic locations in the heart or the surrounding embryonic tissue. This allows us to examine how microenvironmental conditions influence cardiomyocyte fate transitions at single cell resolution within the intact embryo. Here, we describe a protocol in which embryonic myocytes can be isolated from a variety of cardiac sub-domains, dissociated, fluorescently labeled, and microinjected into host embryos with high precision. Cells can then be directly analyzed in situ using a variety of imaging and histological techniques. This protocol is a powerful alternative to traditional grafting experiments that can be prohibitively difficult in a moving tissue such as the heart. The general outline of this method can also be adapted to a variety of donor tissues and host environments, and its ease of use, low cost, and speed make it a potentially useful application for a variety of developmental studies.

In this method, embryonic cardiac tissues are surgically microdissected, dissociated, fluorescently labeled, and implanted into host embryonic tissues. This provides a platform for studying the individual or tissue level developmental organization under ectopic hemodynamic conditions, and/or altered paracrine/juxtacrine environments.

Sistema baseado em microinjeção para na implantação de Vivo do Cardiomyocytes embrionárias no embrião aviária

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

C. elegans is the premier system for the systematic analysis of cell fate specification and morphogenetic events during embryonic development. One challenge is that embryogenesis dynamically unfolds over a period of about 13 h; this half day-long timescale has constrained the scope of experiments by limiting the number of embryos that can be imaged. Here, we describe a semi-high-throughput protocol that allows for the simultaneous 3D time-lapse imaging of development in 80&#8211;100 embryos at moderate time resolution, from up to 14 different conditions, in a single overnight run. The protocol is straightforward and can be implemented by any laboratory with access to a microscope with point visiting capacity. The utility of this protocol is demonstrated by using it to image two custom-built strains expressing fluorescent markers optimized to visualize key aspects of germ-layer specification and morphogenesis. To analyze the data, a custom program that crops individual embryos out of a broader field of view in all channels, z-steps, and timepoints and saves the sequences for each embryo into a separate tiff stack was built. The program, which includes a user-friendly graphical user interface (GUI), streamlines data processing by isolating, pre-processing, and uniformly orienting individual embryos in preparation for visualization or automated analysis. Also supplied is an ImageJ macro that compiles individual embryo data into a multi-panel file that displays maximum intensity fluorescence projection and brightfield images for each embryo at each time point. The protocols and tools described herein were validated by using them to characterize embryonic development following knock-down of 40 previously described developmental genes; this analysis visualized previously annotated developmental phenotypes and revealed new ones. In summary, this work details a semi-high-throughput imaging method coupled with a cropping program and ImageJ visualization tool that, when combined with strains expressing informative fluorescent markers, greatly accelerates experiments to analyze embryonic development.

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

This work describes a semi-high-throughput protocol that allows simultaneous 3D time-lapse imaging of embryogenesis in 80&#8211;100 C. elegans embryos in a single overnight run. Additionally, image processing and visualization tools are included to streamline data analysis. The combination of these methods with custom reporter strains enables detailed monitoring of embryogenesis.

Um método de imagem semi-alta-fonte e um kit de ferramentas de visualização de dados para analisar o desenvolvimento embrionário de C. elegans

C. elegans is the premier system for the systematic analysis of cell fate specification and morphogenetic events during embryonic development. One ...

Laser Capture Microdissection of Mouse Embryonic Cartilage and Bone for Gene Expression Analysis

Laser capture microdissection (LCM) is a powerful tool to isolate specific cell types or regions of interest from heterogeneous tissues. The cellular and molecular complexity of skeletal elements increases with development. Tissue heterogeneity, such as at the interface of cartilaginous and osseous elements with each other or with surrounding tissues, is one obstacle to the study of developing cartilage and bone. Our protocol provides a rapid method of tissue processing and isolation of cartilage and bone that yields high quality RNA for gene expression analysis. Fresh frozen tissues of mouse embryos are sectioned and brief cresyl violet staining is used to visualize cartilage and bone with colors distinct from surrounding tissues. Slides are then rapidly dehydrated, and cartilage and bone are isolated subsequently by LCM. The minimization of exposure to aqueous solutions during this process maintains RNA integrity. Mouse Meckel&rsquo;s cartilage and mandibular bone at E16.5 were successfully collected and gene expression analysis showed differential expression of marker genes for osteoblasts, osteocytes, osteoclasts, and chondrocytes. High quality RNA was also isolated from a range of tissues and embryonic ages. This protocol details sample preparation for LCM including cryoembedding, sectioning, staining and dehydrating fresh frozen tissues, and precise isolation of cartilage and bone by LCM resulting in high quality RNA for transcriptomic analysis.

This protocol describes laser capture microdissection for the isolation of cartilage and bone from fresh frozen sections of the mouse embryo. Cartilage and bone can be rapidly visualized by cresyl violet staining and collected precisely to yield high quality RNA for transcriptomic analysis.

Microdissecção de captura a laser da cartilagem embrionária do rato e osso para análise de expressão gênica

Laser capture microdissection (LCM) is a powerful tool to isolate specific cell types or regions of interest from heterogeneous tissues. The cellular and ...