Este trabalho foi financiado pelo Ministério Federal Alemão de Educação e Pesquisa (Bernstein Foco para Neurotechnology conceder 01GQ0810, a T. Moser, e MED-EL Alemanha); Fundação Alemã de Pesquisa, através do Centro de Microscopia nanoescala e Fisiologia Molecular do Cérebro (fzt 103, T. Moser) e através do SFB889, a N. Strenzke e T. Moser).

Todos os experimentos apresentados neste trabalho foram realizados com os padrões éticos definidos pela lei alemã de proteção dos animais experimentais. O conselho da Universidade de Goettingen para bem-estar animal e do animal escritório de assistência social do estado da Baixa Saxônia aprovou os experimentos. 1 Preparação de μLED-estimulador <ol><li> Para μLEDs, primeiro prepare o estimulador μLED. Use LEDs azuis com 200 por 200 mM superfície ativa (μLED, ver Tabela Materiais). </li><li> Fios solda na μLED. Em seguida, encapsular o μLED e as conexões usando cola epóxi. Deixe o dispositivo durante a noite para permitir a cura epóxi. </li><li> Para a estabilidade mecânica e o isolamento eléctrico dos fios do funil através de um capilar de vidro fino, use 1 mm de diâmetro exterior capilares de borosilicato e vedar a junção com epoxi (Figura 1D), tal que o capilar pode ser montado sobre um manipulador mecânico. NOTA: Taqui é um trade-off de fazer a cápsula grossa o suficiente para obter um bom isolamento elétrico (evitando artefatos de estimulação), mas fina o suficiente para permitir que o LED se mover livremente dentro da bolha e para localizá-lo na cocleostomias. É uma boa prática para preparar mais de um LED. </li><li> Para confirmar bom isolamento elétrico, primeiro preparar uma placa de Petri com 0,9% de NaCl e dip 3 fios de cobre nu encerrados no líquido. Isso serve para simular um animal com eletrodos ABR. Conecte os fios ao ABR-amplificador e de lá para um osciloscópio. </li><li> Em seguida, conecte o LED para o estimulador e mergulhá-lo na solução até que esteja totalmente coberta. Conduzir o LED com pulsos (consulte a etapa 3.1.1) na corrente máxima permitida por mais de 20 minutos e verifique se há artefatos de estimulação. Se eles aparecem, descarte o LED e tentar uma nova. </li></ol> 2 Procedimento Cirúrgico <ol><li> Use 4-10 semanas de idade, camundongos transgênicos expressando ChR2 sob o promotor THY1.2 (linha 9em Wang et al. 13). Para manipular o animal e realizar a cirurgia, sempre use ferramentas cirúrgicas limpas e bem identificados. </li><li> Anestesiar os animais com uma injecção ip de uma mistura de uretano (1,32 mg / kg), xilazina (5 mg / kg) e buprenorfina a 0,1 mg / g diluídos em solução de NaCl a 0,9% estéril e colocar o rato sobre uma placa de aquecimento para manter o organismo temperatura a 37 ° C. Com esta dose, a anestesia dura em geral de todo o protocolo experimental. <ol><li> A partir de 10 minutos após a primeira verificação de indução à anestesia de sinais de excitação pelo reflexo de retirada da pata. Em caso de movimentos, aplicação de doses de manutenção de uretano (0,66 mg / kg) e buprenorfina (0,05 mg / g), diluída em 0,9% de solução de NaCl estéril (sem xilazina). Verifique novamente o reflexo de retirada da pata e prosseguir somente se o reflexo é ausente. </li></ol></li><li> Raspar com cuidado a área retroauricular na preparação da incisão. Use um retroauricularaproximar-se para chegar a bula (cavidade do ouvido médio contendo ar). <ol><li> Com um micro fórceps dissecar cuidadosamente e / ou remover parte dos músculos do pescoço, por exemplo, platisma, esternocleidomastoideo, e scalenes. </li><li> Localizar e expor a bula (Figura 1A). Identificar a bula como uma estrutura óssea com uma forma esférica com uma característica do anel sobre a superfície da bula indica que a inserção da membrana timpânica (Figura 1A). Fazer um buraco com a ponta de uma agulha de insulina logo abaixo deste anel. Começar por aí, remover o osso que cobre a bula, com um fino Rongeur (gnawer) ou micropinças de tal maneira que o Promontorium da cóclea é exposto (Figura 1B). </li></ol></li><li> Para o cocleostomias, raspar delicadamente fora da cápsula óssea para abrir uma pequena janela (cocleostomias: ~ 500-800 mm), tendo o cuidado de deixar intacto o labirinto membranoso (Figura 1B). Realize o cocleostomias no segundo cocleartransformar, pois é longe o suficiente da artéria estapediana e do ápice. Abrindo as ápice poderia produzir ruptura da cóclea, incluindo uma fratura do modiolus. </li><li> Para uma janela de inserção rodada de uma fibra óptica ou μLED-implante para timpânica, ampliar cuidadosamente o nicho da janela redonda riscando o nicho ósseo com a ponta de um bisturi afiado (a lâmina número 11 é uma boa opção). Utilize sempre uma nova lâmina ou bisturi. Tenha muito cuidado, pois a artéria estapediana corre muito perto da janela redonda (Figura 1B). </li></ol> 3. Optical Estimulação utilizando duas abordagens <ol><li> Para a estimulação transcoclear, uso μLEDs ou um laser de fibra acoplada. <ol><li> Monte o capilar levando o μLED em um manipulador mecânico e cuidadosamente posicionar o μLED na cocleostomias. Utilização oABR, provocada por estimulação 3-10 ms de comprimento a partir de uma fonte de corrente (tipicamente 5-40 mA a 2,7 V) a 1-5 Hz, como um meio para optimizar a posição e ouientation do μLED. </li><li> Para a estimulação de laser, utilizar um laser de onda contínua nm 473 e 250 um uma fibra óptica (ver Materiais). Casal da fibra óptica a uma fonte de laser azul que, idealmente, oferece controle analógico rápido de alimentação (então usar um dispositivo acústico-ótico ou um obturador rápido para definir o estímulo óptico). Usando um micromanipulador, localize a ponta da fibra diretamente na cocleostomias e corrigi-o usando o cimento dental (estimulação transcoclear). </li></ol></li><li> Para a estimulação intracoclear, inserir a fibra através da janela redonda na escala timpânica. Em seguida, use 3-10 pulsos de laser ms de 10-30 mW (potência de saída de fibra) em 1-5 Hz para obter oABR. A grande amplitude de oABR permite que o experimentador observar oABR desencadeada por estímulos individuais no osciloscópio para optimizar a posição e orientação do emissor (μLED ou fibra), utilizando amplitude oABR como um limite ler. </li><li> Uma vez que boa oABR foram alcançados, fixar a fibra com cyanoacrcola ylate ou cimento dental e esperar até que a cola é sólido. NOTA: É normal observar um pouco de líquido que sai da cóclea. No entanto, para evitar problemas com a polimerização do cimento, é aconselhável para secar a região utilizando mechas de algodão finas. </li></ol> 4. Gravações de oABR <ol><li> Insira eletrodos de agulha debaixo do pavilhão auricular, no vértice e na parte de trás, perto das pernas e conectá-los ao amplificador. </li><li> Amplificar a diferença de potencial entre o vértice ea mastóide agulhas subcutâneos. Amostra a uma taxa de 50 kHz e um filtro (1-10.000 Hz). Visualize a diferença de potencial em um osciloscópio de preferência perto da configuração de gravação para otimizar a posição do estimulador óptico. Use média de sinal (50-1,000x) e armazenar os dados em um computador para análise off-line. </li></ol> 5. Gravações de potenciais evocados de campo local opticamente <ol><li> Colocar o animal em um quadro estereotáxico. Utilizando uma pinça centorali puxar a pele que cobre o crânio e realizar uma incisão mediana com uma tesoura que se estende desde aproximadamente entre os olhos para o ponto onde os músculos do pescoço para anexar o crânio. <ol><li> Refletir a pele lateralmente. Corte o periósteo longitudinalmente ao longo da sutura sagital e removê-lo para um lado, esfregando suavemente o osso craniano exposto com um cotonete. </li></ol></li><li> A posição de uma placa de metal feita sob encomenda para a cabeça exposta deixando aproximadamente 1 mm de espaço entre a extremidade caudal da placa e lambda. Com um diâmetro de 0,7 milímetros fure cuidadosamente faça um furo no osso parietal. </li><li> Gentilmente parafuso em um parafuso de diâmetro 0,85 milímetros - para servir de referência para os potenciais gravados a partir do colículo inferior (CI) - segurando o parafuso com uma pinça, enquanto o parafuso não está bem presa. Garantir um bom contato entre o parafuso e dura, sem penetrar no cérebro. Cole o parafuso e a chapa de metal sobre o crânio com cola de cianoacrilato. </li><li> Solte o nmúsculos Eck suavemente do crânio. Puxe os músculos do pescoço caudal de cerca de 1-2 mm. Identifique a intersecção do seio sagital superior, (SSS) e do seio transverso (TS). Se necessário, aumentar a transparência do crânio umedecendo o osso com uma solução de NaCl fisiológica. <ol><li> Identificar o IC em camundongos como mentir diretamente caudal para o cruzamento SSS e TS. Após a identificação da localização da IC lentamente e cuidadosamente realizar uma trepanação ca. estendendo 0,5 milímetros rostralmente a 1,5 mm caudal ao TS e cerca de 3 mm para os lados. </li><li> Evite qualquer prejuízo para a SSS e TS como estes impediria uma experiência bem sucedida. Aqui, testar se o osso trepanned tornou-se solto por suavemente empurrando-o. Utilizando uma pinça lentamente levantar o osso. </li></ol></li><li> Com um adaptador apropriado fixar um conjunto de canais múltiplos e headstage num micromanipulador. Para evitar a destruição da matriz de gravação multicanal durante a inserção no IC, retire cuidadosamente a duracom uma ponta curvada de uma pequena agulha hipodérmica começando perto de uma extremidade de osso. <ol><li> Retirar o animal do quadro estereotáxico. Fixar a placa de metal em um bar para permanecer fixação estereotáxico. Posicione a sonda de gravação sobre o IC e inseri-lo sob controle microscópico de modo que o mais alto do canal é apenas visível na superfície. </li></ol></li><li> Amplificar a diferença de potencial entre os canais individuais da matriz de gravação e o parafuso de referência no osso parietal, a uma taxa de amostra de 32 kHz, o filtro passa-baixo (300 Hz) e armazenar em um computador para análise off-line. </li><li> Todos os animais devem ser humanamente eutanasiados ao final do procedimento antes da recuperação anestésica de acordo com as diretrizes da eutanásia relevantes. Os métodos adequados de eutanásia pode incluir o deslocamento cervical ou inalação de CO 2. </li></ol>

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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+stimulation+of+the+auditory+pathway.">Optogenetic stimulation of the auditory pathway.</a> The Journal of clinical investigation. 124 (3), 1114-1129 (2014).</li><li>Madisen, L., Mao, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+toolbox+of+Cre-dependent+optogenetic+transgenic+mice+for+light-induced+activation+and+silencing.">A toolbox of Cre-dependent optogenetic transgenic mice for light-induced activation and silencing.</a> Nature Neuroscience. 15 (5), 793-802 (2012).</li><li>Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics+in+neural+systems.">Optogenetics in neural systems.</a> Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).</li><li>Hernandez, V. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+stimulation+of+the+auditory+pathway.">Optogenetic stimulation of the auditory pathway.</a> The Journal of clinical investigation. 124 (3), 1114-1129 (2014).</li><li>Gunaydin, L. A., Yizhar, O., Berndt, A., Sohal, V. S., Deisseroth, K., Hegemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+optogenetic+control.">Ultrafast optogenetic control.</a> Nature neuroscience. 13 (3), 387-392 (2010).</li><li>Klapoetke, N. C., Murata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+optical+excitation+of+distinct+neural+populations.">Independent optical excitation of distinct neural populations.</a> Nature methods. 11 (3), 338-346 (2014).</li></ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

As experiências descritas demonstram a estimulação optogenetic dos SGNs, e pode, em princípio, também ser utilizado para estimular as células ciliadas internas e / ou externas, desde que a expressão de opsinas. Esses experimentos exigem muita paciência e carinho. Como mencionado antes, as etapas mais críticas são uma boa cocleostomias / janela redonda de inserção, bem como uma posição adequada e orientação da fonte de luz. Há limitações com estimulação optogenética ao u...

Segundo a Organização Mundial de Saúde, 360 milhões de pessoas no mundo sofrem de perda auditiva. Em indivíduos surdos, estimulação elétrica direta de SGNs por CIs permitir a compreensão da fala aberta na maioria deles 1,2,4,5. Apesar de CIs foram implantados em mais de 200.000 pessoas, sendo portanto o neuroprosthesis maior sucesso, codificação de som impulsionado pelos atuais implantes cocleares é limitado. IC são baseados na estimulação eléctrica através de um certo número de eléctrodos, em que cada um de uma região activa tonotópico do nervo auditivo, saltando, assim, o órgão de Corti disfuncional sensorial da cóclea. Ouvintes com audição normal podem discriminar mais de 2.000 freqüências, porém CIs de hoje usam somente até 12-22 canais de freqüência 4. Isto é devido ao fluxo de corrente generalizada de cada eletrodo estimulante 7,9, a ativação de um grande número de SGNs que representam muitas frequências sonoras diferentes 8,15. Estelimitação pode ser melhorado utilizando a estimulação multipolar, mas à custa de um maior consumo de energia 16,17. Sua gama dinâmica de saída para a intensidade do som também é limitado, tipicamente abaixo de 6-20 dB 4,18. Por estas razões, melhorando frequência ea resolução intensidade são objectivos importantes para aumentar o desempenho do CI para melhorar o reconhecimento de fala em ambientes ruidosos, compreensão prosódia e percepção musical. Uma opção diferente para estimular o nervo auditivo é a estimulação óptica. A luz pode ser convenientemente focado para atingir uma população pequena SGN, prometendo melhor confinamento espacial, aumentando a resolução de freqüência e também ampliando a gama dinâmica, resultando em uma melhor resolução intensidade. De fato, a estimulação coclear com luz infravermelha mostrou resolução de freqüência excelente em modelos animais 10,11,19. Uma desvantagem deste tipo de estimulação é que ele requer energias mais elevadas do que a estimulação eléctrica <sup&gt; 10,11. Além disso, as preocupações sobre a capacidade do método para estimular diretamente os neurônios auditivos têm sido levantadas 12,20. Como uma alternativa para a estimulação de infravermelhos, que empregam Optogenetics para tornar SGNs sensível à luz. Optogenética é uma nova abordagem que combina técnicas genéticas e ópticas de forma não invasiva e, especificamente, controlar células com alta precisão temporal (Comentários de 21 a 23). A modalidade actualmente mais frequentemente utilizada emprega a expressão do channelrodopsina 2 (ChR2) gene microbiano de Chlamydomonas reinhardtii, e variantes destes, que codifica um canal de luz fechado catião 24. ChR2 é uma proteína transmembranar-7-hélice que, quando traduzidas em neurónios e activado pela luz azul, age como canal de catião não-selectivos, assim despolarização das células 24 e 27. ChR2 foi bem caracterizada 24,28- 31 e muitas variantes têm sido desenvolvidas para modificar actioespectro n, gating e propriedades de permeabilidade 32,33. O objetivo do nosso trabalho é estabelecer optogenética coclear para a ativação da via auditiva. Notamos que a abordagem optogenetic para estimular o nervo auditivo requer manipulação genética do gânglio espiral para a expressão de channelrodopsina. Trabalhando com ratos e ratazanas permite a utilização de animais transgénicos, disponíveis 13,34,35, que proporcionam a expressão de channelrodopsina com pouca variabilidade ao longo do eixo e através tonotópico 36 animais. Combinando alelos condicionais 37 com Cre-linhas apropriadas proporciona a expressão específica de célula. A transferência de genes para o gânglio da espiral de outros animais requer a utilização de vírus, tais como vírus adeno-associado que é um método padrão para Optogenetics 38 e que mostrou funcionar bem em ratos 36. A manipulação genética e expressão de transgenes que codificam proteínas estranhas riscos de ursos para efeitos adversos, como imunorespostas e / ou proliferação ne, condição comprometida ou até mesmo a morte de células geneticamente manipuladas. Para os fins desta demonstração usamos camundongos transgênicos expressando ChR2 em neurônios do gânglio espiral sob a Thy-1 promotor 13 para estimular opticamente da via auditiva. Observamos que outras variantes channelrodopsina podem ser usados ​​para o mesmo propósito que nós demonstramos usando a transferência mediada por vírus da captura variante 14 em SGNs 39. Enquanto optogenética coclear requer a manipulação genética, oferece afinação molecular para a estimulação SGN otimizado e melhorado promessas frequência e resolução de intensidade quando comparada à estimulação elétrica. Estimulação optogenética da via auditiva é altamente relevante para a pesquisa de audição. Por exemplo, ele promete avanços em estudos sobre o refinamento de tonotopia dependente de atividade durante o desenvolvimento, na análise da exigência de integração espectral em localizat somion e da extensão da interação entre projeções aferentes específicas de frequência no sistema auditivo central.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="769">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Urethane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>U2500-100G</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine HCl</td>
			<td>RXV</td>
			<td></td>
			<td>Sedative and analgesic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>Reckitt Benckiser</td>
			<td></td>
			<td>Analgesic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-10</td>
			<td>It is used to hold hard tissue, e.g. bone or materials. Never use them to hold soft delicated tissue&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 - Fine Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td>Only to be used to hold soft tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors - Sharp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14060-09</td>
			<td>To open the skin and help with the muscle dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lempert Rongeurs&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>16004-16</td>
			<td>They are very useful to easily remove the bone from the bulla</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>473-nm laser&#160;</td>
			<td>Changchun New Industries</td>
			<td>MLL-III473</td>
			<td>100 mW solid state 473 nm laser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser driver&#160;</td>
			<td>Changchun New Industries</td>
			<td>DPSSL MLL 100 mW</td>
			<td>TTL operated laser driver</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 &#181;m optical fiber</td>
			<td>Any comercial ; e.g. Thorlabs</td>
			<td>M42L05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acousto-optical modulator</td>
			<td>Crystal Technology, Inc.</td>
			<td>PCAOM VIS</td>
			<td>Control the amount of light coupled into the fiber from the laser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Controller for Acousto-optical modulator</td>
			<td>Crystal Technology, Inc.</td>
			<td>160T1-8SAR-24-0.8</td>
			<td>Control the acousto-optic modulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solo2 laser power &#38; energy meter</td>
			<td>Gentec-EO</td>
			<td></td>
			<td>Used to measure light intensity of the LED and the fiber coupled laser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue &#181;LED</td>
			<td>Cree</td>
			<td>C470UT200</td>
			<td>It is necessary to build several &#956;LED devices because easily get damaged or the isolation is not good enough</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TDT System&#160;</td>
			<td>Tucker-Davis Technologies</td>
			<td>RZ6-A-P1</td>
			<td>It can be used any system for stimulus generation&#160; presentation and data acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-shank, 16-channel silicon probe</td>
			<td>Neuronexus</td>
			<td>a1x16-5mm-100-177-CM16LP&#160;</td>
			<td>These are fragile devises, must be handled carefully and cleaned after use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnidrill</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>503598</td>
			<td>Perform craniotomy for IC recordings and reference screw implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Drill Steel Burrs</td>
			<td>any commercial; e.g. Fine Science Tools</td>
			<td>19007-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Self tapping bone screw</td>
			<td>any commercial; e.g. Fine Science Tools</td>
			<td>19010-10</td>
			<td>Reference screw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>any commercial; e.g. Luigs+NeumannInVivo Unit Junior 4 axis</td>
			<td></td>
			<td>Positioning of recording probe</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optogenetic stimulation of the auditory nerve

Estimulação elétrica direta de neurônios do gânglio espiral (SGNs) por implantes cocleares (IC) permite a compreensão da fala aberta na maioria dos surdos implantados 1 e 6. No entanto, o som de codificação com CIs atuais tem baixa freqüência e resolução de intensidade devido a ampla propagação atual de cada contato do eletrodo de ativar um grande número de SGNs ao longo do eixo tonotópico da cóclea 7 a 9. Estimulação óptica é proposto como uma alternativa à estimulação elétrica que promete espacialmente mais confinado a ativação de SGNs e, portanto, a resolução de frequência mais elevada de codificação. Nos últimos anos, a iluminação infravermelha directa da cóclea foi utilizado para evocar respostas do nervo auditivo 10. No entanto, exige energias mais elevadas do que a estimulação elétrica 10,11 e incerteza quanto ao mecanismo subjacente 12. Aqui nós descrevemos um método baseado na optogenética para estimular SGNscom luz azul de baixa intensidade, utilizando camundongos transgênicos com expressão neuronal de channelrodopsina 2 (ChR2) 13 ou expressão mediada pelo vírus da captura ChR2 variante 14. Foram utilizados micro-díodos emissores de luz (μLEDs) e lasers de fibra acoplado para estimular ChR2 expressam SGNs através de uma pequena abertura artificial (cocleostomias) ou da janela redonda. Analisamos as respostas por gravações couro cabeludo dos potenciais evocados de luz (optogenetic auditivo de tronco cerebral de resposta: oABR) ou por gravações microeletrodos da via auditiva e os comparou com estimulação acústica e elétrica.

<html> Um cocleostomias ideal é crítica e aumenta a probabilidade de uma experiência de sucesso. Isto significa que a janela é regular, pequena, e não há prejuízo das estruturas internas da cóclea. Por exemplo, sangramento indica lesão da estria vascular. Um bom exemplo é apresentado na Figura 1B. Usando ratinhos transgénicos ChR2, ChR2 é expresso nas SGNs dentro da cóclea (Figura 1C). Iluminação azul claro, seja por μLED ou l...

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Optogenetic Stimulation of the Auditory Nerve

O implante coclear (IC) permitem ouvir pela estimulação elétrica direta do nervo auditivo. No entanto, a má frequência e intensidade resolução limita a qualidade de ouvir com CIs. Aqui descrevemos estimulação optogenética do nervo auditivo em ratos como uma estratégia alternativa para a investigação auditiva e desenvolvimento de futuros ICs.

A estimulação optogenética do nervo auditivo

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted ...

optogenetic-stimulation-of-the-auditory-nerve

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.5K visualizações.  University Medical Center Goettingen.  O implante coclear (IC) permitem ouvir pela estimulação elétrica direta do nervo auditivo. No entanto, a má frequência e intensidade resolução limita a qualidade de ouvir com CIs. Aqui descrevemos estimulação optogenética do nervo auditivo em ratos como uma estratégia alternativa para a investigação auditiva e desenvolvimento de futuros ICs. 

Vídeo: Optogenetic Stimulation of the Auditory Nerve

TMS: Using the Theta-Burst Protocol to Explore Mechanism of Plasticity in Individuals with Fragile X Syndrome and Autism

Fragile X Syndrome (FXS), also known as Martin-Bell Syndrome, is a genetic abnormality found on the X chromosome.1,2 Individuals suffering from FXS display abnormalities in the expression of FMR1 - a protein required for typical, healthy neural development.3 Recent data has suggested that the loss of this protein can cause the cortex to be hyperexcitable thereby affecting overall patterns of neural plasticity.4,5
In addition, Fragile X shows a strong comorbidity with autism: in fact, 30% of children with FXS are diagnosed with autism, and 2 - 5% of autistic children suffer from FXS.6
Transcranial Magnetic Stimulation (a non-invasive neurostimulatory and neuromodulatory technique that can transiently or lastingly modulate cortical excitability via the application of localized magnetic field pulses 7,8) represents a unique method of exploring plasticity and the manifestations of FXS within affected individuals. More specifically, Theta-Burst Stimulation (TBS), a specific stimulatory protocol shown to modulate cortical plasticity for a duration up to 30 minutes after stimulation cessation in healthy populations, has already proven an efficacious tool in the exploration of abnormal plasticity.9,10 
Recent studies have shown the effects of TBS last considerably longer in individuals on the autistic spectrum - up to 90 minutes.11 This extended effect-duration suggests an underlying abnormality in the brain's natural plasticity state in autistic individuals - similar to the hyperexcitability induced by Fragile X Syndrome.
In this experiment, utilizing single-pulse motor-evoked potentials (MEPs) as our benchmark, we will explore the effects of both intermittent and continuous TBS on cortical plasticity in individuals suffering from FXS and individuals on the Autistic Spectrum.

In this article, we examine the effects of Theta-Burst TMS stimulation on cortical plasticity in individuals suffering from Fragile X syndrome and individuals on the autistic spectrum.

TMS: Usando o protocolo Theta-Burst para Explorar Mechasnism de Plasticidade em Indivíduos com Síndrome do X Frágil e Autismo

Fragile X Syndrome (FXS), also known as Martin-Bell Syndrome, is a genetic abnormality found on the X chromosome.1,2 Individuals suffering from FXS ...

Neurociência

The NeuroStar TMS Device: Conducting the FDA Approved Protocol for Treatment of Depression

The Neuronetics NeuroStar Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) System is a class II medical device that produces brief duration, pulsed magnetic fields. These rapidly alternating fields induce electrical currents within localized, targeted regions of the cortex which are associated with various physiological and functional brain changes.1,2,3
In 2007, O'Reardon et al., utilizing the NeuroStar device, published the results of an industry-sponsored, multisite, randomized, sham-stimulation controlled clinical trial in which 301 patients with major depression, who had previously failed to respond to at least one adequate antidepressant treatment trial, underwent either active or sham TMS over the left dorsolateral prefrontal cortex (DLPFC). The patients, who were medication-free at the time of the study, received TMS five times per week over 4-6 weeks.4
The results demonstrated that a sub-population of patients (those who were relatively less resistant to medication, having failed not more than two good pharmacologic trials) showed a statistically significant improvement on the Montgomery-Asberg Depression Scale (MADRS), the Hamilton Depression Rating Scale (HAMD), and various other outcome measures. In October 2008, supported by these and other similar results5,6,7, Neuronetics obtained the first and only Food and Drug Administration (FDA) approval for the clinical treatment of a specific form of medication-refractory depression using a TMS Therapy device (FDA approval K061053).
In this paper, we will explore the specified FDA approved NeuroStar depression treatment protocol (to be administered only under prescription and by a licensed medical profession in either an in- or outpatient setting).

In this article, we examine the methodology and considerations relevant to the FDA approved depression treatment protocol using the Neuronetics NeuroStar TMS device.

O dispositivo NeuroStar TMS: Conduzindo a FDA Aprovado protocolo para o tratamento da depressão

The Neuronetics NeuroStar Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) System is a class II medical device that produces brief duration, pulsed magnetic ...

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells in the walls of the lateral ventricle give rise to neuroblasts that migrate for several millimeters along the rostral migratory stream (RMS) to reach and incorporate into the olfactory bulb. To study the different steps and the impact of adult-born neuron integration into preexisting olfactory circuits, it is necessary to selectively label and manipulate the activity of this specific population of neurons. The recent development of optogenetic technologies offers the opportunity to use light to precisely activate this specific cohort of neurons without affecting surrounding neurons4,5. Here, we present a series of procedures to virally express Channelrhodopsin2(ChR2)-YFP in a temporally restricted cohort of neuroblasts in the RMS before they reach the olfactory bulb and become adult-born neurons. In addition, we show how to implant and calibrate a miniature LED for chronic in vivo stimulation of ChR2-expressing neurons.

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Adult-born neurons of the olfactory bulb can be optogenetically controlled using Channelrhodopsin2-expressing lentiviral injection in the rostral migratory stream and chronic photostimulation with an implanted miniature LED.

Transdução Viral seletiva de Adultos-nascido neurônios olfativos de crônica In vivo Estímulo Optogenetic

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

Fiber-optic Implantation for Chronic Optogenetic Stimulation of Brain Tissue

Elucidating patterns of neuronal connectivity has been a challenge for both clinical and basic neuroscience. Electrophysiology has been the gold standard for analyzing patterns of synaptic connectivity, but paired electrophysiological recordings can be both cumbersome and experimentally limiting. The development of optogenetics has introduced an elegant method to stimulate neurons and circuits, both in vitro1 and in vivo2,3. By exploiting cell-type specific promoter activity to drive opsin expression in discrete neuronal populations, one can precisely stimulate genetically defined neuronal subtypes in distinct circuits4-6. Well described methods to stimulate neurons, including electrical stimulation and/or pharmacological manipulations, are often cell-type indiscriminate, invasive, and can damage surrounding tissues. These limitations could alter normal synaptic function and/or circuit behavior. In addition, due to the nature of the manipulation, the current methods are often acute and terminal. Optogenetics affords the ability to stimulate neurons in a relatively innocuous manner, and in genetically targeted neurons. The majority of studies involving in vivo optogenetics currently use a optical fiber guided through an implanted cannula6,7; however, limitations of this method include damaged brain tissue with repeated insertion of an optical fiber, and potential breakage of the fiber inside the cannula. Given the burgeoning field of optogenetics, a more reliable method of chronic stimulation is necessary to facilitate long-term studies with minimal collateral tissue damage. Here we provide our modified protocol as a video article to complement the method effectively and elegantly described in Sparta et al.8 for the fabrication of a fiber optic implant and its permanent fixation onto the cranium of anesthetized mice, as well as the assembly of the fiber optic coupler connecting the implant to a light source. The implant, connected with optical fibers to a solid-state laser, allows for an efficient method to chronically photostimulate functional neuronal circuitry with less tissue damage9 using small, detachable, tethers. Permanent fixation of the fiber optic implants provides consistent, long-term in vivo optogenetic studies of neuronal circuits in awake, behaving mice10 with minimal tissue damage.

The development of optogenetics now provides the means to precisely stimulate genetically defined neurons and circuits, both in vitro and in vivo. Here we describe the assembly and implantation of a fiber optic for chronic photostimulation of brain tissue.

Implantação de fibra óptica para Estimulação Crônica optogenética do Tecido Cerebral

Elucidating patterns of neuronal connectivity has been a challenge for both clinical and basic neuroscience. Electrophysiology has been the gold standard ...

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

A growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive manipulation of the neural activity of specific neurons in Drosophila melanogaster1. Chief among these are optogenetic tools, which enable the activation or silencing of specific neurons in the intact and freely moving animal using bright light. Channelrhodopsin (ChR2) is a light-activated cation channel that, when activated by blue light, causes depolarization of neurons that express it. ChR2 has been effective for identifying neurons critical for specific behaviors, such as CO2 avoidance, proboscis extension and giant-fiber mediated startle response2-4. However, as the intense light sources used to stimulate ChR2 also stimulate photoreceptors, these optogenetic techniques have not previously been used in the visual system. Here, we combine an optogenetic approach with a mutation that impairs phototransduction to demonstrate that activation of a cluster of loom-sensitive neurons in the fly's optic lobe, Foma-1 neurons, can drive an escape behavior used to avoid collision. We used a null allele of a critical component of the phototransduction cascade, phospholipase C-&beta;, encoded by the norpA gene, to render the flies blind and also use the Gal4-UAS transcriptional activator system to drive expression of ChR2 in the Foma-1 neurons. Individual flies are placed on a small platform surrounded by blue LEDs. When the LEDs are illuminated, the flies quickly take-off into flight, in a manner similar to visually driven loom-escape behavior. We believe that this technique can be easily adapted to examine other behaviors in freely moving flies.

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Genetically encoded optogenetic tools enable noninvasive manipulation of specific neurons in the Drosophila brain. Such tools can identify neurons whose activation is sufficient to elicit or suppress particular behaviors. Here we present a method for activating Channelrhodopsin2 that is expressed in targeted neurons in freely walking flies.

Optogenética estimulação do comportamento de fuga em<em&gt; Drosophila melanogaster</em

A  growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive  manipulation of the neural activity of specific neurons in ...

Selective Tracing of Auditory Fibers in the Avian Embryonic Vestibulocochlear Nerve

The embryonic chick is a widely used model for the study of peripheral and central ganglion cell projections. In the auditory system, selective labeling of auditory axons within the VIIIth cranial nerve would enhance the study of central auditory circuit development. This approach is challenging because multiple sensory organs of the inner ear contribute to the VIIIth nerve 1. Moreover, markers that reliably distinguish auditory versus vestibular groups of axons within the avian VIIIth nerve have yet to be identified. Auditory and vestibular pathways cannot be distinguished functionally in early embryos, as sensory-evoked responses are not present before the circuits are formed. Centrally projecting VIIIth nerve axons have been traced in some studies, but auditory axon labeling was accompanied by labeling from other VIIIth nerve components 2,3. Here, we describe a method for anterograde tracing from the acoustic ganglion to selectively label auditory axons within the developing VIIIth nerve. First, after partial dissection of the anterior cephalic region of an 8-day chick embryo immersed in oxygenated artificial cerebrospinal fluid, the cochlear duct is identified by anatomical landmarks. Next, a fine pulled glass micropipette is positioned to inject a small amount of rhodamine dextran amine into the duct and adjacent deep region where the acoustic ganglion cells are located. Within thirty minutes following the injection, auditory axons are traced centrally into the hindbrain and can later be visualized following histologic preparation. This method provides a useful tool for developmental studies of peripheral to central auditory circuit formation.

Here we describe a microdissection technique followed by fluorescent dye injection into the acoustic ganglion of early chick embryos for selective tracing of auditory axon fibers in the nerve and hindbrain.

Rastreamento seletiva de fibras no nervo auditivo embrionário aviária Vestibulococlear

The embryonic chick is a widely used model for the study of peripheral and central ganglion cell projections. In the auditory system, selective labeling ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

In vivo Optogenetic estimulação do sistema nervoso central de roedores

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Direct Visualization of the Murine Dorsal Cochlear Nucleus for Optogenetic Stimulation of the Auditory Pathway

Investigation into the use of virus-mediated gene transfer to arrest or reverse hearing loss has largely been relegated to the peripheral auditory system. Few studies have examined gene transfer to the central auditory system. The dorsal cochlear nucleus (DCN) of the brainstem, which contains second order neurons of the auditory pathway, is a potential site for gene transfer. In this protocol, a technique for direct and maximal exposure of the murine DCN via a posterior fossa approach is demonstrated. This approach allows for either acute or survival surgery. Following direct visualization of the DCN, a host of experiments are possible, including injection of opsins into the cochlear nucleus and subsequent stimulation by an optical fiber coupled to a blue light laser.&#160;Other neurophysiology experiments, such as electrical stimulation and neural injector tracings are also feasible.&#160;The level of visualization and the duration of stimulation achievable make this approach applicable to a wide range of experiments.

The goal of this protocol is to outline a surgical approach to provide direct access to the dorsal cochlear nucleus in a murine model.

Visualização direta do Murino Dorsal Coclear Nucleus para Optogenetic Estimulação da via auditiva

Investigation into the use of virus-mediated gene transfer to arrest or reverse hearing loss has largely been relegated to the peripheral auditory system. ...

Assessment of Neuromuscular Function Using Percutaneous Electrical Nerve Stimulation

Percutaneous electrical nerve stimulation is a non-invasive method commonly used to evaluate neuromuscular function from brain to muscle (supra-spinal, spinal and peripheral levels). The present protocol describes how this method can be used to stimulate the posterior tibial nerve that activates plantar flexor muscles. Percutaneous electrical nerve stimulation consists of inducing an electrical stimulus to a motor nerve to evoke a muscular response. Direct (M-wave) and/or indirect (H-reflex) electrophysiological responses can be recorded at rest using surface electromyography. Mechanical (twitch torque) responses can be quantified with a force/torque ergometer. M-wave and twitch torque reflect neuromuscular transmission and excitation-contraction coupling, whereas H-reflex provides an index of spinal excitability. EMG activity and mechanical (superimposed twitch) responses can also be recorded during maximal voluntary contractions to evaluate voluntary activation level. Percutaneous nerve stimulation provides an assessment of neuromuscular function in humans, and is highly beneficial especially for studies evaluating neuromuscular plasticity following acute (fatigue) or chronic (training/detraining) exercise.

We present a protocol to assess changes in neuromuscular function. Percutaneous electrical nerve stimulation is a non-invasive method that evokes muscular responses. Electrophysiological and mechanical properties of these responses permit the evaluation of neuromuscular function from brain to muscle (supra-spinal, spinal and peripheral levels).

Avaliação da função neuromuscular Usando percutânea Estimulação Elétrica Nervosa

Percutaneous electrical nerve stimulation is a non-invasive method commonly used to evaluate neuromuscular function from brain to muscle (supra-spinal, ...

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

The ability of insects to navigate toward odor sources is based on the activities of their first-order olfactory receptor neurons (ORNs). While a considerable amount of information has been generated regarding ORN responses to odorants, the role of specific ORNs in driving behavioral responses remains poorly understood. Complications in behavior analyses arise due to different volatilities of odorants that activate individual ORNs, multiple ORNs activated by single odorants, and the difficulty in replicating naturally observed temporal variations in olfactory stimuli using conventional odor-delivery methods in the laboratory. Here, we describe a protocol that analyzes Drosophila larval behavior in response to simultaneous optogenetic stimulation of its ORNs. The optogenetic technology used here allows for specificity of ORN activation and precise control of temporal patterns of ORN activation. Corresponding larval movement is tracked, digitally recorded, and analyzed using custom written software. By replacing odor stimuli with light stimuli, this method allows for a more precise control of individual ORN activation in order to study its impact on larval behavior. Our method could be further extended to study the impact of second-order projection neurons (PNs) as well as local neurons (LNs) on larval behavior. This method will thus enable a comprehensive dissection of olfactory circuit function and complement studies on how olfactory neuron activities translate in to behavior responses.

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

This protocol analyzes navigational behavior of Drosophila larva in response to simultaneous optogenetic stimulation of its olfactory neurons. Light of 630 nm wavelength is used to activate individual olfactory neurons expressing a red-shifted channel rhodopsin. Larval movement is simultaneously tracked, digitally recorded, and analyzed using custom-written software.