Name: isolation of sertoli cells and peritubular cells from rat testes
Uploaded: 2016-02-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Sertoli Cells and Peritubular Cells from Rat Testes at JoVE.com

Yazarlar Giessen Meinhardt laboratuvarda birincil Sertoli hücrelerinin izolasyonu kurulması son derece yararlı Guido Verhoeven ve Ludo Deboel, Leuven, teşekkür etmek istiyorum. Monika Fijak, Gießen, şekil 1A ve tavsiye ona yardım için kabul edilmektedir. Çalışmalar Uluslararası Araştırma Lisansüstü Koleji JLU Giessen (Almanya) / Monash Üniversitesi (Melbourne, Avustralya) GRK 1871 (SB) hibe BH 93 / 1-1 (SB) ve finansman yoluyla Deutsche Forschungsgemeinschaft tarafından desteklendi. Destek de &quot;Männliche Infertilität bei Infektion &amp; Entzündung&quot; (MIBIE) adlı programda &quot;Landes-Ofansif zur Entwicklung Wissenschaftlich-ökonomischer Exzellenz&quot; (LOEWE) bünyesinde Hessen Eyaleti hibe elde edildi.

1. Hayvan Etik Beyanı Burada anlatılan deneyler, yerel otorite olarak, Regierungspräsidium Giessen, Almanya kurallarına göre yapılır ve Deneysel Amaçlı Hayvanların Bakım ve Kullanım Uygulama Alman Kanunu (İzin yok onaylamak edildi. GI 20/23 sayılı A 31 / 2012). Medya, Enzim Çözümleri ve Hayvanların 2. Hazırlık <ol><li> 100 mi etanol içinde iyot, 1 g çözülmesiyle% 1 iyot alkol hazırlayın. </li><li> 2x 500 mi Dulbecco&#39;s fosfat tamponlu tuzlu su 7.5 mi, D-glükoz (100 g / L) ve 5 ml 100X Penisilin / Streptomisin stok çözeltisi (15 mg / ml D, her takviye Ca olmayan (PBS) + 2 ve Mg + 2 hazırlamak -glükoz, 50 U / ml penisilin ve 50 | ig / ml streptomisin nihai). </li><li> 500 mi Roswell Park Memorial Institute (RPMI), 5 mL 100X Penisilin / Streptomisin stok çözeltisi (50 U / ml penisilin ve 50 | ig / ml streptomisin yüzgeç 1640 ortamında 1 x Ekal). </li><li> tripsin DNaz I solüsyonu hazırlayın (2.5 mg / tripsin ve 10 ug / ml DNase I mi), 25 mg tripsin ve 0.1 ml DNAz ekleyerek ortaya 9.9 mL PBS (1 mg / ml DNase I). </li><li> Bir çözeltisi (10 mg / ml) tripsin önleyicisi 5 ml PBS içinde 50 mg tripsin inhibitörü içinde çözülür. Tripsin inhibitörü B çözeltisi 10 ml PBS (2.5 mg / ml) içinde 25 mg tripsin inhibitörü içinde çözülür. </li><li> Bir Kollajenaz-Hiyaluronidaz Deoksiribonükleaz I (DNase I) çözeltisi (1 mg / ml nihai), 10 mg Kollajenaz A, 10 mg Hiyaluronidaz (1 mg / ml nihai) ve 0.1 mi DNaz çözülür I (1 mg / ml DNase I () 10 ug 10 mi, PBS içinde) son / ml olmuştur. </li><li> 9.9 ml PBS, 10 mg Hiyaluronidaz (1 mg / ml nihai) ve 0.1 mi DNaz I çözeltisi (1 mg / ml) (10 ug son / ml) ilave edilerek, bir Hiyaluronidaz DNaz I çözelti hazırlayın. </li><li> Onlar Sertoli hücre izolasyonu gününde 19 gün eski böylece zamanında Wistar sıçan sipariş edin. Not: Açıklanan protokol 10 sıçanlar için tasarlanmıştır, ancak en az 5, 20 sıçan en fazla modifiye edilebilir.Tüm çözeltilerin miktarları buna göre ayarlanması gerekir. </li><li> 100 mi izopropanol içinde 0.35 g Yağ Kırmızı O çözülmesiyle, Yağ Kırmızı O stok çözelti hazırlayın. Stir O / N, en fazla bir yıl süreyle oda sıcaklığında 0,2 um ve mağaza üzerinden filtre. </li><li> 4 ml su ile 6 mi, Yağ Kırmızı O stok solüsyonu karıştırılarak yağ kırmızısı çözelti hazırlayın (3: 2). 0.2 mikron ile 10-20 dk süzdükten sonra. Bir sonraki 2 saat içinde kullanın. </li><li> % 4 Hazırlama yavaşça karıştırılırken 1x PBS 80 ml ila 4 g paraformaldehit tozu (PFA) ekleyerek havalandırılmış başlığı içinde formaldehit çözeltisi (w / v). Isı ~ 60 ° C, 1 M NaOH ile 1 ml ilave edilir ve paraformaldehit çözünene kadar karıştırma devam etmektedir. Çözelti, oda sıcaklığına kadar soğumaya 1 M HCI ile 7.4 pH&#39;a ve 1 x PBS, 100 ml hacim ayarlama olsun. çözeltisi (0.45 um) filtreden geçirilir ve birkaç ay boyunca -20 ° C &#39;de parçalar halinde taze veya deposu kullanımı. Not: polimerize formaldehit (PFA) su içinde monomerik formaldehite depolimerize eder. Bu süreçorta derecede ısıtma ve hafif baz pH ile katalize. taze tüm enzim çözümleri hazırlayın ve filtre kullanımı gününde (0.2 uM) sterilize. Bir enzim için farklı bir üretici (Malzeme / Ekipman Tablosu) Eğer dikkatlice konsantrasyonu / aktivitesini ayarlamak kullanılır. Aşağıdaki protokolde bir &quot;pipet&quot; bir serolojik pipet anlamına gelir. </li></ol> Seminifer tübül 3. hazırlanması <ol><li> CO2 kullanarak bir desikatör ve dakikada odacık hacminin en az% 20 oranında değiştiren bir akış oranında, 10 erkek Wistar sıçanları tek tek anestezisi. Bir ayak pedi sıkarak nefes duruncaya kadar test anestezi bekleyin ve varsa hiçbir tepki servikal dislokasyon her sıçan euthanize. akan su altında juguler ven ve karotis arter (vajina carotica) kesit ile kan akıtmak. % 70 etanol ile silerek karın dezenfekte edin. </li><li> Forseps karın mus cildi kaldırınkartılması sternum (Şekil 2A) için pubis eklemi uzanan bir oval şekilli cilt lob kesip ve göğüs üzerine yukarı doğru flap. Sonraki, karın kasları kapmak ve sternum pubis eklemi bir medial kesi yapmak. <ol><li> yukarı aşağı pelvis dışına testis itmek için pelvis gelen başparmak ile karın sıkın. Ayrıca testis yukarı çekmek için forseps ile epididimal yağ yastığı (Şekil 2B) seçin. Tunika albugineada zedelemeden, sperm kablosu (Şekil 2B) kesin ve 50 ml konik bir tüp (Şekil 2C) 20 ml PBS içinde testis toplar. </li></ol></li><li> testis topladıktan sonra, etanol içinde iyot (ağ / hac)% 1 eşit hacimde (20 mi) ilave edilerek dezenfekte. İki kez tüp ters çevirin ve hemen süpernatant süzün. Hızlı bir şekilde 25 ml PBS, her (Şekil 2D) ile iki kez testisler yıkayın. </li><li> ihtiva Bir Petri kabı testisler aktarın15 mi ing PBS (Şekil 2e). , Bir ucunda forseps ile sıkıca her testis kavramak ters sonunda tunika albugineada içine küçük bir kesi yapmak ve bir kazıma aracı olarak kapalı makas bıçakları kullanarak tübüller sıkmak. Not: tübül hala sadece bir kaç tübüller homojen enzimatik sindirim (Şekil 2F) sağlamak amacıyla çözelti içine uzanan ile kompakt bir testis şeklindeki paket oluşturmalıdır. </li><li> 10 ml tripsin-DNase I çözeltisi ihtiva eden 100 ml&#39;lik bir vida kapaklı şişeye de-kapsüllü testisler aktarın. 32 ° C (120 salınım / dakika) bir çalkalama su banyosu içinde sindirim gerçekleştirin. 4 saat sonra en az tübül dispersiyon için çıplak gözle tübülleri değerlendirir. tübüller solüsyon içine dağıtmak başladığınızda, hemen sindirim durdurun. Gerekirse, en fazla 2 dakika boyunca inkübasyona devam edin. </li><li> aşağı 3-4 defa iyice yukarı pipetleme çözüm karıştırmak tripsin inhibitörü çözüm A. 5 ml ekleyerek tripsin sindirim durdurun ve10 ml&#39;lik pipet kullanarak ve bir 50 ml konik tüp transfer s. </li><li> inkübasyon 5 dakika sonra tübül dikkatlice adım 3.6 10 ml pipet kullanarak süpernatant kaldırmak ve tam tripsin sindirim durdurmak için tripsin inhibitörü B çözeltisi 10 ml ekleyin, birim yerçekimi tarafından yerleşmek gözlemlemek. aşağı 2-3 kez yukarı ve aşağı pipetleme tübülleri tekrar süspansiyon. </li><li> kirlenmesine neden kaldırmak için geçiş hücreleri 25 ml PBS her biri tübülleri 9 kez yıkayın. 25 ml&#39;lik bir pipet kullanarak her yıkama tübülleri tekrar süspansiyon ve onları 10 dakika boyunca birim yerçekimi tarafından yerleşmek için izin verir. Her zaman PBS, tabanda ve süpernatant kaldırılmasını pipetle için aynı 25 ml pipet kullanın. </li></ol> Peritubular Hücreleri 4. Sökme / İzolasyon (PTCs) <ol><li> 100 ml&#39;lik bir vida kapaklı şişeye Tüm tübüller aktarın ve kollajenaz-Hiyaluronidaz DNaz I çözeltisi (Şekil 3A) ekleyin. (120 titreşimler / dakika) 32 ° C&#39;de çalkalanan bir su banyosu içinde 10 dakika için sindirim gerçekleştirme. </li><li> Pipetleyin cam slayt süspansiyon bir damla ve hızlı bir şekilde 100x büyütmede rutin hücre kültürü için bir ters ışık mikroskobu altında tübülleri kontrol edin. sindirim gelişmiş değilse yeterli (mikroskobik kontrolü için gereken zamanı saymazsak) Ek 2 dakika süreyle inkübasyon devam ediyor. Not: Bu adım sırasında tüm tübüller (Şekil 3B ve C) kaba haline gelmelidir uzunluk ve tübül kenarlarında kısaltılmış olsun. Kaba kenarları peritübüler hücrelerin serbest bırakılması için göstergesidir. </li><li> Adım 3.8 25 ml pipet kullanarak 50 ml konik tüp sindirilir tübüllerden ile süspansiyon aktarın. 10 ml PBS ile 100 ml&#39;lik şişe yıkayın ve konik tüp tübüllerden ekleyin. Yine 25 ml pipet kullanarak, PTCs içeren, sindirilmiş tübüller süpernatant 10 dakika boyunca birim çekimi ile yerleşmek ve dikkatlice aspire izin verin ve yeni bir konik tüp transfer. Son birkaç mililitre aspirasyon orde 5 ml&#39;lik bir pipet kullanınr tübüller herhangi carry-over önlemek için. </li><li> Toplanmış, tübül süpernatanları 20 ml RPMI,% 10 ısı ile inaktive edilmiş fetal büyükbaş hayvan serumu (FBS) ile desteklenmiş 1640 ortamı ekleme ara kullanmadan oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 x g&#39;de karıştırılır ve santrifüjlenir. </li><li> Süpernatantı dikkatlice süzün ve 16 mi ortamı, her biri beş T75 balonlarına on RPMI, 20 ml içinde% 10 ısı ile inaktive edilmiş FBS ile takviye 1640 ortamında yıkandı ve tohum 4 mL pelet PTCs tekrar süspansiyon. CO2 atmosferinde (Şekil 4A),% 5 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Kültür 3. gününde PTCs trypsinize ve onları 1 bölünmüş:% 10 ısı ile inaktive edilmiş FBS ile takviye 16 ml RPMI 1640 ortamı içeren T75 balonlarına 2 her biri (verim 10 şişeler tamamen) (Şekil 4B). CO2 atmosferinde% 5, 37 ° C &#39;de inkübasyon devam edin. </li><li> Kültür 5. gün tekrar PTCs trypsinize ve deneye bağlı olarak 6 oyuklu veya 24 oyuklu plakalar üzerine bunları plaka(Plaka başına bir T75 şişesi). Deneyler 6. günde gerçekleştirilebilir. </li></ol> Sertoli hücrelerinin 5. İzolasyon (SC&#39;ler) <ol><li> 25 ml&#39;lik bir pipet ile iyice PBS, 25 ml adım 4.3 yerleşmiş tübüller yeniden süspanse edin ve bunları 12 dakika için birim yerçekimi ile oturmasına izin verin. Pipetleme PBS tübüller ve yüzer uzaklaştırılması yeniden süspanse edilmesi için, aynı 25 mi pipet kullanın. 3 kez yıka (toplam 4 yıkama) tekrarlayın. </li><li> Son yıkama başka bir 100 ml sindirilmiş tübüller aktardıktan sonra Hyaluronidase-DNaz I çözüm içeren şişe-cap vida. 32 ° C (120 salınım / dakika) bir çalkalama su banyosu içinde sindirim gerçekleştirin. </li><li> Adım 4.2 anlatıldığı gibi 5 dakika sonra 100X büyütmede ışık mikroskobu inceleme ile tekrar tübüller kontrol edin. Not: Kısa tübüller, borulu agrega ve serbest hücreleri (Şekil 3D) görünür olmalıdır. <ol><li> boru şeklindeki agrega 10 dakika yerleşmek izin ve bizi süpernatant aspire25 ml&#39;lik bir pipet ing. Yıkama 25 ml PBS ve her yıkama aşaması (Şekil 3E) 10 dakikalık bir sedimantasyon süresi kullanılarak 4 defa toplanır. </li></ol></li><li> RPMI 1640 ortamı 20 ml ilave edilir ve 20 ml&#39;lik bir şırınga üzerine monte edilmiş bir 18 G iğne ile süspansiyon 10 kez geçer. hava kabarcıkları kaçının. Not: ve iğne tek geçişte olarak kabul edilir aracılığıyla süspansiyon çekerek. hidrodinamik kesme hücrelerin bozulması ve homojenleştirme topaklaşma eğilimi hücrelerin hazırlanması için standart bir yöntemdir. Küçük bir iç çapa sahip olan bir hipodermik iğne ile hücrelerin geçici 25. Şekil 5C ve D&#39;nin kültürün gün 4 saflaştınldı Sertoli hücreleri normal ultrastrüktürel gösteren fonksiyonel özellikleri üzerinde bir etkisi olması beklenmemektedir. <ol><li> Pipetleyin AGG eğer 10X büyütmede rutin hücre kültürü için bir ters ışık mikroskobu altında tübülleri kontrol hızla bir bardak slayt ve süspansiyon bir damlaRegates Tüm (Şekil 3F) dağıtılır. Filtrattaki saf tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için bir 70 mikron hücre süzgecinden hücre süspansiyonu filtre. </li></ol></li><li> ara kullanmadan oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 200 x g&#39;de adım 5.4 süzüntü santrifüjleyin. Dikkatle 40 Sertoli hücreleri 25 ml&#39;lik bir pipet kullanılarak süpernatan aspire ve tekrar süspansiyon mi RPMI 1640 ortamı (serumsuz). </li><li> Tripan mavi rengin 100 ul ile 100 ul hücre süspansiyonu karıştırın ve bir Neubauer Geliştirilmiş bölmesi ile hücre sayımı. Sayma sonucuna göre 3 x 10 6 hücre / ml hücre yoğunluğu ayarlayın. Tohum 6-çukurlu bir tablaya (= Gün 1) üzerinde oyuk başına 1 mi. Bir Oil Red O boyama (adım 6) planlanıyorsa birine bir kapak kayma koymak ya da Sertoli hücreleri ekim önce birkaç kuyu. Not: tüp kısaca bir hücre kısım pipet ile çekilmeden önce her zaman sarsılmış gerektiğini, böylece süspansiyon içinde Sertoli hücreleri hızlı bir şekilde çözmek. 4. günde onlar sıkıca att kadaralt tabakası, ACH. </li><li> 4. günde, yüzen veya yapışmış germ hücreleri çıkarmak için (Şekil 4C) izole sertoli hücreleri PBS (Şekil 4D) (aşama 5.6) kaplama için kullanılan 6 oyuklu plakaların her bir yıkama. , Orta aspire her iyi PBS 1-2 ml ekleyin ve şiddetle bir tablo ama PBS dökmeden yatay 6-kuyucuğu sallayın. Yıkandıkları 3 kez tekrarlayın ve günde 5 ve 6 (Şekil 4E) aynı yıkama işlemi gerçekleştirin. Gün 4 Sertoli hücreleri sıkıca bağlı olan Açık ve ters ışık mikroskobu (Şekil 4C) altında desen gibi bir arnavut gösterir Not:. Deneyler 7. günden itibaren gerçekleştirilebilir. <ol><li> Yapışkan germ hücreleri 6-yuvalı plakalar üzerinde tohumlama 3 gün sonra, bir hipotonik şoku yerine yüzen ve çıkarılması için (adım 5.7 için alternatif). orta kaldırmak ve buzdolabı üzerinden doğrudan alınan 20 mM Tris pH 7.5 1 ml ekleyin. 90 sn 120 değil sonra Tris tamponu aspireDaha sonra. PBS ile iki kez hücreleri yıkanır ve RPMI 1640 ortamı (serumsuz) 2 ilave edin. İsteğe bağlı olarak, bir sonraki gün deneyleri. Not: Hipotonik şok daha uzun süre daha germ hücreleri kaldırılabilir ancak daha Sertoli hücreleri de kaybolur. İlk PBS yıkama herhangi Sertoli hücreleri yerinden etmemek için hızlı ama dikkatli yapılmalıdır. Doğrudan farklı boyutlarda hipotonik muameleye sayıda vakuollerin faz kontrast mikroskopisi ile sitoplazma içerisinde gözlenebilir sonra. Vakuoller hipotonik tedavi sonrası birkaç saat içinde kaybolur. </li></ol></li></ol> 6. Yağ Kırmızı O boyamasıyla <ol><li> Oda sıcaklığında tüm adımları uygulayın. gününde 7 yıkama Sertoli hücreleri PBS ile iki kez bir kapak kayma (adım 5.6) yetiştirilen ve PBS içinde% 10 formalin ile bunları düzeltmek. 10 dakika sonra taze solüsyon ile formalin yerine, başka bir 60 dakika tespiti devam ediyor. Not: Bütün çözeltiler, bir kayar kapak ile birlikte (S) içerisine ilave edildi ve bir sonraki aşamada daha önce aspire edilir. </li&gt; <li> Aspire formalin, su ile hücreler iki kez yıkama ve% 60 izopropanol ilave edin. 5 dakika sonra, bir kaç dakika için havayla kurumaya hücreleri sağlar. </li><li> oyuk başına 1 mi, Yağ Kırmızı O boya solüsyonu eklenir ve 10 dakika süre ile inkübe edilir. çözelti aspire ve su ile hücreler hemen 4 kez yıkayın ve montaj kapağı gliserol PBS fişleri (9: 1). Rutin ışık mikroskobu (Şekil 4F) ile parlak bir alan görüntüleri çekmek. </li></ol> 7. İmmünofloresan Boyama <ol><li> ya da iki kez PBS ile bir kapak slip üzerinde büyümüş (aşama 5.5) sertoli hücreleri (adım 4.5 arasında) PTCs yıkayın ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca% 4 PFA sabitleyin. </li><li> Oda sıcaklığında 1 saat boyunca PBS içerisinde% 5 BSA ile inkübe edin. BSA-PBS çözüm atın ve taze BSA-PBS (PTCs için) aktin (düz kas) içeren çözelti veya vimentin (Sertoli hücreleri) primer antikor (seyreltme 1: 100, her iki antikor için) ekleyin ve 4 ° CO / N inkübe. Not: Primer antikorun spesifik olmayan bağlanma BSA blokları ile inkube edildi. </li><li> Yıkama kapağı PBS% 0.1 Tween 20 içinde 5 dakika için 3 kez kayar ve yeşil flüoresan boya konjuge keçi anti-fare ikincil antikoru (seyreltme 1: 1.000) ile birlikte inkübe karanlıkta, 1 saat boyunca oda sıcaklığında karıştırıldı. </li><li> Yıkama kapağı PBS% 0.1 Tween 20 içinde 5 dakika için 3 kez kayar ve DAPI montaj ortamı içine monte edilir. </li></ol> 8. ultrastrüktürel Analizi <ol><li> PBS ile 6 cm hücre kültürü plakasının üzerinde büyümüş (aşama 5.6) yıkama sertoli hücreleri ve (67 mM kakodilat tampon maddesi içinde% 2.5 glutaraldehit,% 2.5 paraformaldehid ve% 0.05 pikrik asit karışımı içinde, 4 ° C&#39;de 2 saat boyunca, onları gidermek Ito ve Karnovsky 26 uygun pH 7.4). </li><li> 50 mM maleat tamponu (pH 5) içinde çözülmüş% 0.3 uranil asetat içinde bir O / N inkübasyon takip% 1 ozmiyum tetroksit sonrası tespit gerçekleştirin. Standart prosedürlere göre ortamı gömme yerleştirme örnekleri. Ince bölümleri kesmek kurşun sitrat ile kontrast ve elektron mikroskobu ile incelenmesi. </li></ol>

<ol>
	<li>Nieschlag, E., Behre, H., Nieschlag, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Andrology. Male Reproductive Health and Dysfunction. , (2010).</li><li>Esaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#220;ber+Kulturen+des+Hodengewebes+der+S&#228;ugetiere+und+&#252;ber+die+Natur+des+interstitiellen+Hodengewebes+und+der+Zwischenzellen.">&#220;ber Kulturen des Hodengewebes der S&#228;ugetiere und &#252;ber die Natur des interstitiellen Hodengewebes und der Zwischenzellen.</a> Z. Mikrosk. Anat. Forsch. 15, 368-404 (1928).</li><li>Hall, P. F., Irby, D. C., De Kretser, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+cholesterol+to+androgens+by+rat+testes:+comparison+of+interstitial+cells+and+seminiferous+tubules.">Conversion of cholesterol to androgens by rat testes: comparison of interstitial cells and seminiferous tubules.</a> Endocrinology. 84, 488-496 (1969).</li><li>Welsh, M. J., Wiebe, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+sertoli+cells:+a+rapid+method+for+obtaining+viable+cells.">Rat sertoli cells: a rapid method for obtaining viable cells.</a> Endocrinology. 96, 618-624 (1975).</li><li>Vitale, R., Fawcett, D. W., Dym, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+normal+development+of+the+blood-testis+barrier+and+the+effects+of+clomiphene+and+estrogen+treatment.">The normal development of the blood-testis barrier and the effects of clomiphene and estrogen treatment.</a> Anat. Rec. 176, 331-344 (1973).</li><li>Dorrington, J. H., Roller, N. F., Fritz, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+follicle-stimulating+hormone+on+cultures+of+Sertoli+cell+preparations.">Effects of follicle-stimulating hormone on cultures of Sertoli cell preparations.</a> Mol. Cell. Endocrinol. 3, 57-70 (1975).</li><li>Tung, P. S., Skinner, M. K., Fritz, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+synthesis+is+a+marker+for+peritubular+cell+contaminants+in+Sertoli+cell-enriched+cultures.">Fibronectin synthesis is a marker for peritubular cell contaminants in Sertoli cell-enriched cultures.</a> Biol. Reprod. 30, 199-211 (1984).</li><li>Verhoeven, G., Cailleau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testicular+peritubular+cells+secrete+a+protein+under+androgen+control+that+inhibits+induction+of+aromatase+activity+in+Sertoli+cells.">Testicular peritubular cells secrete a protein under androgen control that inhibits induction of aromatase activity in Sertoli cells.</a> Endocrinology. 123, 2100-2110 (1988).</li><li>Tung, P. S., Dorrington, J. H., Fritz, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+changes+induced+by+follicle-stimulating+hormone+or+dibutyryl+cyclic+AMP+on+presumptive+Sertoli+cells+in+culture.">Structural changes induced by follicle-stimulating hormone or dibutyryl cyclic AMP on presumptive Sertoli cells in culture.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 72, 1838-1842 (1975).</li><li>Teng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+adult+Sertoli+cells+and+their+effects+on+the+function+of+co-cultured+allogeneic+islets+in+vitro.">Isolation and culture of adult Sertoli cells and their effects on the function of co-cultured allogeneic islets in vitro.</a> Chin. Med. J. (Engl.). 118, 1857-1862 (2005).</li><li>Kohno, S., Ziparo, E., Marek, L. F., Tung, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+Sertoli+cells:+major+histocompatibility+antigens+and+glycoconjugates.">Murine Sertoli cells: major histocompatibility antigens and glycoconjugates.</a> J. Reprod. Immunol. 5, 339-350 (1983).</li><li>Dufour, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sertoli+cell+line+lacks+the+immunoprotective+properties+associated+with+primary+Sertoli+cells.">Sertoli cell line lacks the immunoprotective properties associated with primary Sertoli cells.</a> Cell Transplant. 17, 525-534 (2008).</li><li>Majumdar, S. S., Tsuruta, J., Griswold, M. D., Bartke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+Sertoli+cells+from+the+testes+of+adult+Siberian+hamsters:+analysis+of+proteins+synthesized+and+secreted+by+Sertoli+cells+cultured+from+hamsters+raised+in+a+long+or+a+short+photoperiod.">Isolation and culture of Sertoli cells from the testes of adult Siberian hamsters: analysis of proteins synthesized and secreted by Sertoli cells cultured from hamsters raised in a long or a short photoperiod.</a> Biol. Reprod. 52, 658-666 (1995).</li><li>Zhang, H., Liu, B., Qiu, Y., Fan, J., Yu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pure+cultures+and+characterization+of+yak+Sertoli+cells.">Pure cultures and characterization of yak Sertoli cells.</a> Tissue Cell. 45, 414-420 (2013).</li><li>Ziparo, E., Geremia, R., Russo, M. A., Stefanini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+interaction+in+vitro+between+Sertoli+cells+and+germ+cells+at+different+stages+of+spermatogenesis.">Surface interaction in vitro between Sertoli cells and germ cells at different stages of spermatogenesis.</a> Am. J. Anat. 159, 385-388 (1980).</li><li>Anway, M. D., Folmer, J., Wright, W. W., Zirkin, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Sertoli+cells+from+adult+rat+testes:+an+approach+to+ex+vivo+studies+of+Sertoli+cell+function.">Isolation of Sertoli cells from adult rat testes: an approach to ex vivo studies of Sertoli cell function.</a> Biol. Reprod. 68, 996-1002 (2003).</li><li>Scarpino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+of+Sertoli+cell+isolation+by+DSA+lectin,+allowing+mitotic+analyses.">A rapid method of Sertoli cell isolation by DSA lectin, allowing mitotic analyses.</a> Mol. Cell. Endocrinol. 146, 121-127 (1998).</li><li>Mather, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+two+distinct+mouse+testicular+epithelial+cell+lines.">Establishment and characterization of two distinct mouse testicular epithelial cell lines.</a> Biol. Reprod. 23, 243-252 (1980).</li><li>Korbutt, G. S., Elliott, J. F., Rajotte, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cotransplantation+of+allogeneic+islets+with+allogeneic+testicular+cell+aggregates+allows+long-term+graft+survival+without+systemic+immunosuppression.">Cotransplantation of allogeneic islets with allogeneic testicular cell aggregates allows long-term graft survival without systemic immunosuppression.</a> Diabetes. 46, 317-322 (1997).</li><li>Fritz, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+cell-germ+cell+relationships+in+mammalian+testes+during+development+and+spermatogenesis.">Somatic cell-germ cell relationships in mammalian testes during development and spermatogenesis.</a> Ciba Found. Symp. 182, 271-281 (1994).</li><li>Whaley, P. D., Chaudhary, J., Cupp, A., Skinner, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+specific+response+elements+of+the+c-fos+promoter+and+involvement+of+intermediate+transcription+factor(s)+in+the+induction+of+Sertoli+cell+differentiation+(transferrin+promoter+activation)+by+the+testicular+paracrine+factor+PModS.">Role of specific response elements of the c-fos promoter and involvement of intermediate transcription factor(s) in the induction of Sertoli cell differentiation (transferrin promoter activation) by the testicular paracrine factor PModS.</a> Endocrinology. 136, 3046-3053 (1995).</li><li>Bhushan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uropathogenic+Escherichia+coli+block+MyD88-dependent+and+activate+MyD88-independent+signaling+pathways+in+rat+testicular+cells.">Uropathogenic Escherichia coli block MyD88-dependent and activate MyD88-independent signaling pathways in rat testicular cells.</a> J. Immunol. 180, 5537-5547 (2008).</li><li>Meinhardt, A., Hedger, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological,+paracrine+and+endocrine+aspects+of+testicular+immune+privilege.">Immunological, paracrine and endocrine aspects of testicular immune privilege.</a> Mol. Cell. Endocrinol. 335, 60-68 (2011).</li><li>Fijak, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+Testosterone+on+Inflammatory+Response+in+Testicular+Cells+and+Expression+of+Transcription+Factor+Foxp3+in+T+Cells.">Influence of Testosterone on Inflammatory Response in Testicular Cells and Expression of Transcription Factor Foxp3 in T Cells.</a> Am. J. Reprod. Immunol. , 12-25 (2015).</li><li>Mamidi, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+passing+mesenchymal+stem+cells+through+smaller+bore+size+needles+for+subsequent+use+in+patients+for+clinical+or+cosmetic+indications.">Impact of passing mesenchymal stem cells through smaller bore size needles for subsequent use in patients for clinical or cosmetic indications.</a> J. Transl. Med. 10, 229 (2012).</li><li>Ito, S., Karnovsky, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formaldehyde-glutaraldehyde+fixatives+containing+trinitro+compounds.">Formaldehyde-glutaraldehyde fixatives containing trinitro compounds.</a> J. Cell. Biol. 39, 168-169 (1968).</li><li>Galdieri, M., Ziparo, E., Palombi, F., Russo, M. A., Stefanini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pure+Sertoli+cell+cultures:+a+new+model+for+the+study+of+somatic-germ+cell+interactions.">Pure Sertoli cell cultures: a new model for the study of somatic-germ cell interactions.</a> J. Androl. 5, 249-254 (1981).</li><li>Fijak, M., Meinhardt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+testis+in+immune+privilege.">The testis in immune privilege.</a> Immunol. Rev. 213, 66-81 (2006).</li><li>Jegou, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sertoli+cell+in+vivo+and+in+vitro.">The Sertoli cell in vivo and in vitro.</a> Cell Biol. Toxicol. 8, 49-54 (1992).</li><li>Pineau, C., Le Magueresse, B., Courtens, J. L., Jegou, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+in+vitro+the+phagocytic+function+of+Sertoli+cells+in+the+rat.">Study in vitro the phagocytic function of Sertoli cells in the rat.</a> Cell Tissue Res. 264, 589-598 (1991).</li><li>Ren, Y., Savill, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis:+the+importance+of+being+eaten.">Apoptosis: the importance of being eaten.</a> Cell Death Differ. 5, 563-568 (1998).</li><li>Ducray, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+mouse+Sertoli+cell+line+producing+rat+androgen-binding+protein+(ABP).">Establishment of a mouse Sertoli cell line producing rat androgen-binding protein (ABP).</a> Steroids. 63, 285-287 (1998).</li><li>Konrad, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+Sertoli+cells+express+epithelial+but+also+mesenchymal+genes+after+immortalization+with+SV40.">Rat Sertoli cells express epithelial but also mesenchymal genes after immortalization with SV40.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1722, 6-14 (2005).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

The seminiferous tubules are bounded by a circular layer of peritubular cells and a basal lamina on the luminal side. Sertoli cells are resting on the basal lamina, establish the blood testis barrier through formation of occluding junctions between adjacent cells and provide the structural framework for the organisation of the seminiferous epithelium. Sertoli cells and adjacent spermatogenic cells maintain intimate contacts throughout germ cell development providing physical contact and communication alike. Therefore, wh...

Testisler, androjenler yani erkek gamet ve cinsel hormonları üretir. Organ iki bölmeden oluşmaktadır. Interstisyel bölmesindeki, o steroidogenez Leydig hücreleri içinde yer alır, toplam testis hacmi 1 yaklaşık% 10-12 temsil etmektedir. Boru şeklindeki bölme testis hacmi 1 yaklaşık 60-80% temsil ve germ hücreleri ve somatik hücre iki tür içerir - peritübüler hücreler ve Sertoli hücrelerinin. testis, her 1-3 derece kıvrık seminifer tübüller içeren, 250-300 lobülleri içine bağ dokusu septa bölünür. Bu tübüller bazal membran kollajen tabakası ve peritübüler hücrelerin bir çevresel katman (Şekil 1A) içine alınır. Germinal epitel bazal membran luminal tarafında yer almaktadır. Sertoli hücreleri lümene bazal membran bütün germinal epitel kapsayan geniş uzun hücrelerdir. Onlar güçlü olan attbazal membran ağrıyordu ve interstisyumda gelen germinal epitel tıkar ve kan-testis bariyerini temsil bazolateral organize sıkı kavşaklar sayesinde sürekli hücresel tabaka oluştururlar. Sertoli hücreleri belirgin sitoplazmik çıkıntıları ve germ hücrelerinin bir türe özgü ama sürekli numarası ile sıkı morfolojik ve fonksiyonel temas almak sağlayacak etkileri vardır. Diploid germinal kök hücreleri çoğalır ve spermatogonia farklılaşırlar. mayoz sırasında mayoz II sırasında daha fazla dört haploit spermatidler haline oluşturulan tetraploid spermatositlerde kısa ömürlü. bir hücresel ağ oluştururlar ve böylece tüm germ hücreleri sitoplazmik köprüler ile birbirine bağlanır. spermatidlerin olgunlaşması sırasında ana olay Spermiyogenez denilen bir süreçle, kalıntı organları oluşturan, sitoplazmanın büyük parçaların ekstrüzyon olduğunu. Kalıntı organları Sertoli hücreleri tarafından fagosite edilir. Geç spermatid sonra içine salınırtübüler lümen ve daha olgunlaşması için epididime taşınır. Sertoli hücreleri ve tohum hücreleri karşılıklı topografik ve fonksiyonel spermatogenezi koordine etmek görünür. Küçük testis parçaları ekili ve hücre türleri mikroskopla 2 tarafından tespit edildiğinde bireysel testiküler hücre tiplerinin hazırlanması neredeyse bir asır önce başladı. Ince uçlu forseps kullanarak tunika albuginea&#39;yı açtıktan sonra tübül dikkatli diseksiyon ile tubuler ve interstisyel bölmeleri 3 ayırmak, daha sonra mümkün olmuştur. 1975 yılında Galler ve Wiebe interstisyel doku ve dış peritübüler hücre tabakasının 4 çıkarılması için bir pankreatini tedavi yapışmasını tübülleri boşaltmak için bir kollajenaz tedavi tanıttı. erken genç olgunlaşmamış fareler üzerinde (eski 20 civarında gün) içinde kullanılmaya başlanmış itibaren spermatogenez henüz başlamamış çünkü Sertoli hücreleri tübüler hücre nüfusun büyük bir kısmını oluşturmaktadır. Bu yaş sıçan Sert atoli hücreleri bölünmeye son ve kan-testis bariyeri 5 kurulmuştur, böylece komşu hücreler arasındaki sıkı bağlantılar oluşturur. Welsh ve Wiebe Dorrington ve ark., Bağımsız olarak tripsin bir kombinasyonunu ortaya aynı yıl 6 yayınlanan soybeen tripsin inhibitörü ve kolajenaz bunu takiben deoksiribonükleaz. Her iki grup, aynı zamanda, yaklaşık% 70 sertoli hücreleri içeren kaplama için homojen bir hücre süspansiyonu üretmek için (bir şırınga iğnesi veya, sırasıyla, bir Pasteur pipeti ile tekrar tekrar sindirilmiş boru şekilli parçaların çizilmesi) mekanik kuvvet kullanılır. serumsuz bir ortam kullanılarak kültür içinde 3 gün sonra, sertoli hücreleri yüzdesi, yaklaşık% 90 artar. Bu büyük ölçüde germ hücrelerine kirlenmesine neden ölümü isnat edilebilir. Kalıntı peritübüler hücreleri (PTCs), bununla birlikte, sıkıca hücre dışı matrisin üzerinden bağlı kalır. PTCs ancak Sertoli hücreleri üretmek için bilinmektedirPTCs kontaminasyonun tahmin edilmesi için bir markör proteini olarak hizmet edebilir fibronektin. Bu nedenle, Tung ve ark. Ek hyaluronidaz tedavi Sertoli hücre fraksiyonu 7 saflığını artırmak olabilir gerekçeli. Gerçekten de ek bir tedavi kıyasla serum ihtiva eden bir ortam saflaştırılmıştır sertoli hücreleri yetiştirilmesi için kullanıldığında özellikle belirgindir hale geldiği, yaklaşık 20-kat PTCs kirlenmeyi azaltmak mümkün olduğunu gösterebilir. Bundan sonra Tung ve ark geliştirilmiş prosedürü. hakim protokolü oldu ve yoğun alanda 8 (Şekil 1B) diğer büyük gruplar tarafından kullanılmıştır. kollajenaz muamelesi sırasında PTCs çoğunluğu serbest bırakılır ve sertoli hücreleri paralel olarak izole edilebilir. PTCs şiddetle çoğalır ve folikül stimüle edici hormon (FSH) yanıt vermeyen Oysa, Sertoli hücreleri artık mitoz geçiren ve karakteristik morfolojik değişikliklerin FSH yanıt vermeyenve siklik adenosin monofosfat (cAMP) konsantrasyonda 9 bir artış. Çok benzer bir enzimatik sindirim protokolleri erkek 10, fare 11,12, Sibirya hamsteri 13 veya yak 14 gibi diğer hayvanlardan elde edilen primer Sertoli hücrelerin izolasyonu için de kullanılabilir. Germ hücreleri bir hipotonik şok kirletici büyük miktarlarda çıkarılması için izolasyon prosedürü 15 sonunda kullanılabilir. Yetişkin sıçan 16 testis Bu, sertoli hücreleri etkili izolasyonunu sağlayan. Bir zenginleştirilmiş Sertoli hücre süspansiyonu da dozdaki ile aglutinin 17 kaplı lektin yemekleri süspansiyon kaplama ile germ hücrelerinden ayrılabilir. Sadece Sertoli hücreleri ve birkaç kalıntı PTCs lektin plakalara uygun. Birincil Sertoli hücre kültürleri, özellikle sıçan, fare Sertoli hücre li gibi hücre hatları hormonlara yanıt soruşturma veya kurmak için başlangıçta kullanılmaktadırne TM4 18. Bu hücre hattı bugüne kadar yüzden fazla çalışmalarda araştırılmıştır. Bir translasyon yaklaşımda Sertoli hücreleri sistemik bağışıklığı 19 olmayan ko-kültürlenmiş hücreler ve uzun vadede aşı yaşamda kalması hakkında kseno veya allojenik pankreas adacıklarının eş nakli gibi doku immüno korunması için kullanılmaktadır. Ve somatik-germ hücresi (Sertoli hücreleri - germ hücreleri) 20 etkileşimleri, 21 - İzole Sertoli hücreleri de epitel-mezenkimal (PTCC Sertoli hücreleri) çalışmak için ko-kültür deneylerinde kullanılmıştır. Son zamanlarda birincil Sertoli hücreleri patojenik ve üropatojenik E. ile enfeksiyonu takiben ifadeyi sitokin yol açan Toll benzeri reseptörler ifadesini ve proinflamatuar sitokinlerin salgılanmasını yanı sıra sinyal iletimi kaskadlarını araştırmak için istihdam edilmiştir E. coli 22. Diğer son araştırmalar testis bağışıklık p incelemek için sertoli hücreleri kullanılarak yapıldırivilege 23 ve testosteron ön arıtma LPS ile güdülenmiş ateşli tepkiyi 24 bastırdığını göstermiştir.

<table><tbody><tr><td>Actin (smooth muscle) antibody clone 1A4</td><td>Dako</td><td>M0851</td><td>Monoclonal mouse anti human antibody.&lt;br/&gt; Use 1:100 dilution for immunofluorescence.</td></tr><tr><td>Albumin bovine fraction V&lt;br/&gt; Standard grade, lyophilized</td><td>Serva</td><td>11930.04</td><td>Filter (0.45 &amp;micro;m) BSA solutions used for immunofluorescence.</td></tr><tr><td>Corning Cell Strainers 70&amp;nbsp;&amp;micro;m</td><td>Corning</td><td>431751</td><td>White color</td></tr><tr><td>Collagenase A from&lt;em&gt; Clostridium histolyticum&lt;/em&gt;</td><td>Roche</td><td>10103586001</td><td></td></tr><tr><td>DAPI mountant ProLong Gold Antifade</td><td>Life technologies</td><td>P-36931</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>Sigma</td><td>G8644</td><td>100 g/L</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;acute;s PBS without Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;/Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Electron microscope</td><td>Zeiss</td><td>EM 109S</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence microscope</td><td>Zeiss</td><td>Axioplan 2</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidase from bovine testis</td><td>Sigma</td><td>H3506</td><td></td></tr><tr><td>Inverted light microscope</td><td>Olympus</td><td>CKX41</td><td>Routine cell culture microscope</td></tr><tr><td>Mouse IgG / IgM (H+L) polyclonal&lt;br/&gt; secondary Antibody&amp;nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>A-10684</td><td>Alexa Fluor 488 conjugate</td></tr><tr><td>Oil Red O</td><td>Sigma</td><td>O0625</td><td>Has replaced Sudan III and Sudan IV because of brighter color.</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin (5,000&amp;nbsp;U/ml)/&lt;br/&gt; Streptomycin (5,000 &amp;micro;g/ml)</td><td>Gibco</td><td>15070-063</td><td>100x solution</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco</td><td>21875-034</td><td>Contains 300 mg/L L-glutamine</td></tr><tr><td>Trypsin from porcine pancreas</td><td>Sigma</td><td>T5266</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain (0.4%)</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin inhibitor from soybean</td><td>Sigma</td><td>T6522</td><td>The Sigma product is considerably cheaper than the previously used&lt;br/&gt; BPTI (Aprotinin) from Roche.</td></tr><tr><td>Vimentin antibody (V9)</td><td>Sigma</td><td>V6630</td><td>Monoclonal mouse anti pig vimentin antibody.&amp;nbsp; Use 1:100 dilution for immunofluorescence.</td></tr><tr><td>Wistar WU rats</td><td>Charles River</td><td></td><td>Should be 19 days old on day of experiment.</td></tr></tbody></table>

isolation of sertoli cells and peritubular cells from rat testes

farklılaştırılmış sperm ilk ergenlik dönemindeki görünür, çünkü testis ve özellikle erkek gamet olarak, benzersiz bir şekilde bağışıklık sistemini zorlukları - on yıldan fazla sistemik immün tolerans kuruluşundan sonra. Spermatogenik hücreler bağışıklık sistemi tarafından kendi-olmayan olarak kabul edilebilir bir protein dizi ifade eder. Testis daha sonra, bir yandan, bu neo-antijenlere karşı tolerans oluşturmak ancak diğer yandan enfeksiyon ve tümör gelişimi korunmak mümkün olmalıdır. Bu nedenle testis zararlı inflamatuar immün yanıtı çağrıştıran olmadan yabancı antijenleri tolere vücutta birkaç bağışıklık ayrıcalıklı yerlerden biridir. Sertoli hücreleri testis bu bağışıklık ayrıcalıklı bir ortamda sürdürülmesi için kilit rol oynayacak ve aynı zamanda yabancı bir ortamda cotransplanted hücre yaşam süresini. Bu nedenle birincil Sertoli hücreleri, e olamaz testisin bağışıklık ayrıcalığını eğitim için önemli bir araçtırasily yerleşik hücre hatları veya başka bir hücresel modellerinde ile ikame. ve istenirse peritübüler hücreler - - sıçan testis tek bir gün içinde burada Sertoli hücrelerinin izolasyonu için detaylı ve kapsamlı bir protokol mevcut.

Açıklanan prosedür 10 sıçan testis yaklaşık 12 x 10 7 Sertoli hücrelerinin izolasyonu sağlar. Altı-yedi 6 oyuklu plakalar 7. günde deneyler için uygun olduğu tripsin-DNase I sindirim Sertoli hücre izolasyonu sırasında çok önemli bir adım olan, böylece, 3 x 10 6 hücre 6 oyuklu bir plaka üzerinde oyuk başına yerleştirilir. Bu noktada sindirim çok ilerleyen ise germ hücrelerinin oranı / Sertoli hücreleri orantısız sonuna kadar artacaktır...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Sertoli Cells and Peritubular Cells from Rat Testes at JoVE.com

Isolation of Sertoli Cells and Peritubular Cells from Rat Testes

Birincil Sertoli hücreleri immüno özelliklerinin iltihap ya da enfeksiyon ve yararlanma sırasında testis immün ayrıcalığı, sinyal transdüksiyonunu çalışmak için gereklidir. Burada yüksek derecede saflaştırılmış birincil Sertoli hücreleri ve sıçan testis peritübüler hücrelerin izolasyonu için bir enzim bazlı protokol açıklar.

Sıçan Testislerindeki Sertoli Hücreleri İzolasyon ve peritübüler Hücreler

The testis, and in particular the male gamete, challenges the immune system in a unique way because differentiated sperm first appear at the time of ...

isolation-of-sertoli-cells-and-peritubular-cells-from-rat-testes

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

22.4K Görüntüleme.  Justus-Liebig-Universität Gießen.  Birincil Sertoli hücreleri immüno özelliklerinin iltihap ya da enfeksiyon ve yararlanma sırasında testis immün ayrıcalığı, sinyal transdüksiyonunu çalışmak için gereklidir. Burada yüksek derecede saflaştırılmış birincil Sertoli hücreleri ve sıçan testis peritübüler hücrelerin izolasyonu için bir enzim bazlı protokol açıklar. 

Video: Isolation of Sertoli Cells and Peritubular Cells from Rat Testes

Whole-cell Patch-clamp Recordings of Isolated Primary Epithelial Cells from the Epididymis

The epididymis is an essential organ for sperm maturation and reproductive health. The epididymal epithelium consists of intricately connected cell types that are distinct not only in molecular and morphological features but also in physiological properties. These differences reflect their diverse functions, which together establish the necessary microenvironment for the post-testicular sperm development in the epididymal lumen. The understanding of the biophysical properties of the epididymal epithelial cells is critical for revealing their functions in sperm and reproductive health, under both physiological and pathophysiological conditions. While their functional properties have yet to be fully elucidated, the epididymal epithelial cells can be studied using the patch-clamp technique, a tool for measuring the cellular events and the membrane properties of single cells. Here, we describe the methods of cell isolation and whole-cell patch-clamp recording to measure the electrical properties of primary dissociated epithelial cells from the rat cauda epididymides.

We present a protocol that combines cell isolation and whole-cell patch-clamp recording to measure the electrical properties of the primary dissociated epithelial cells from the rat cauda epididymides. This protocol allows for investigation of the functional properties of primary epididymal epithelial cells to further elucidate the physiological role of the epididymis.

Epididimden İzole Edilmiş Primer Epitelyal Hücrelerin Tüm Hücreli Yama-Kelepçesi Kayıtları

The epididymis is an essential organ for sperm maturation and reproductive health. The epididymal epithelium consists of intricately connected cell types ...

Gelişim Biyolojisi

A Seminiferous Tubule Squash Technique for the Cytological Analysis of Spermatogenesis Using the Mouse Model

Meiotic progression in males is a process that requires the concerted action of a number of highly regulated cellular events. Errors occurring during meiosis can lead to infertility, pregnancy loss or genetic defects. Commencing at the onset of puberty and continuing throughout adulthood, continuous semi-synchronous waves of spermatocytes undergo spermatogenesis and ultimately form haploid sperm. The first wave of mouse spermatocytes undergoing meiotic initiation appear at day 10 post-partum (10 dpp) and are released into the lumen of seminiferous tubules as mature sperm at 35 dpp. Therefore, it is advantageous to utilize mice within this developmental time-window in order to obtain highly enriched populations of interest. Analysis of rare cell stages is more difficult in older mice due to the contribution of successive spermatogenic waves, which increase the diversity of the cellular populations within the tubules. The method described here is an easily implemented technique for the cytological evaluation of the cells found within the seminiferous tubules of mice, including spermatogonia, spermatocytes, and spermatids. The tubule squash technique maintains the integrity of isolated male germ cells and allows examination of cellular structures that are not easily visualized with other techniques. To demonstrate the possible applications of this tubule squash technique, spindle assembly was monitored in spermatocytes progressing through the prophase to metaphase I transition (G2/MI transition). In addition, centrosome duplication, meiotic sex chromosome inactivation (MSCI), and chromosome bouquet formation were assessed as examples of the cytological structures that can be observed using this tubule squash method. This technique can be used to pinpoint specific defects during spermatogenesis that are caused by mutation or exogenous perturbation, and thus, contributes to our molecular understanding of spermatogenesis.

The goal of this tubule squash technique is to rapidly assess cytological features of developing mouse spermatocytes while preserving cellular integrity. This method allows for the study of all stages of spermatogenesis, and can be easily implemented alongside other biochemical and molecular biological approaches for the study of mouse meiosis.

Seminifer tübül Squash tekniği fare modeli kullanarak sperma saytolojik analizi için

Meiotic progression in males is a process that requires the concerted action of a number of highly regulated cellular events. Errors occurring during ...

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by Sertoli cell junctions at the blood-testis barrier (BTB), which is the tightest tissue barrier in the mammalian body and segregates the seminiferous epithelium into two compartments, a basal and an adluminal. The BTB creates a unique microenvironment for germ cells in meiosis I/II and for the development of postmeiotic spermatids into spermatozoa via spermiogenesis. Here, we describe a reliable assay to monitor BTB integrity of mouse testis in vivo. An intact BTB blocks the diffusion of FITC-conjugated inulin from the basal to the apical compartment of the seminiferous tubules. This technique is suitable for studying gene candidates, viruses, or environmental toxicants that may affect BTB function or integrity, with an easy procedure and a minimal requirement of surgical skills compared to alternative methods.

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

Here, we present a protocol to assess the blood-testis barrier integrity by injecting inulin-FITC into testes. This is an efficient in vivo method to study blood-testis barrier integrity that can be compromised by genetic and environmental elements.

Fare kan-Testis bariyeri bütünlük çalışma için In Vivo yöntemi

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by ...

Enrichment of Pachytene Spermatocytes and Spermatids from Mouse Testes Using Standard Laboratory Equipment

To characterize each step of spermatogenesis, researchers must separate different subpopulations of germ cells from testes. However, isolating discrete populations is challenging, because the adult testis contains a complex mix of germ cells from all steps of spermatogenesis along with certain populations of somatic cells. Over the past few decades, different techniques such as centrifugal elutriation, fluorescence-activated cell sorting (FACS), and STA-PUT have been successfully applied to the isolation of germ cells. A drawback is that they all require dedicated devices and specialized training. Following principles underlying the STA-PUT method, a simple protocol has been developed for the isolation of pachytene spermatocytes, round spermatids, and elongating spermatids from mouse testes. After preparing a single cell suspension of testicular cells, specific cell populations are enriched by gravity sedimentation through a discontinuous bovine serum albumin (BSA) density gradient. The cell fractions are then manually collected and microscopically analysed. This modified density gradient for round spermatids (MDR) sedimentation protocol can be widely applied, because it requires only standard laboratory equipment. Furthermore, the protocol requires minimal starting materials, reducing its cost and use of laboratory animals.

Presented here is a protocol for enriching pachytene spermatocytes, round spermatids, and elongating spermatids from adult mouse testes using a discontinuous bovine serum albumin density gradient with standard laboratory equipment.

Standart Laboratuvar Ekipmanları Kullanılarak Fare Testlerinden Pachytene Spermatosit ve Spermatidlerin Zenginleşmesi

To characterize each step of spermatogenesis, researchers must separate different subpopulations of germ cells from testes. However, isolating discrete ...

Extra Cellular Matrix-Based and Extra Cellular Matrix-Free Generation of Murine Testicular Organoids

Testicular organoids provide a tool for studying testicular development, spermatogenesis, and endocrinology in vitro. Several methods have been developed in order to create testicular organoids. Many of these methods rely upon extracellular matrix (ECM) to promote de novo tissue assembly, however, there are differences between methods in terms of biomimetic morphology and function of tissues. Moreover, there are few direct comparisons of published methods. Here, a direct comparison is made by studying differences in organoid generation protocols, with provided outcomes. Four archetypal generation methods: (1) 2D ECM-free, (2) 2D ECM, (3) 3D ECM-free, and (4) 3D ECM culture are described. Three primary benchmarks were used to assess the testicular organoid generation. These are cellular self-assembly, inclusion of major cell types (Sertoli, Leydig, germ, and peritubular cells), and appropriately compartmentalized tissue architecture. Of the four environments tested, 2D ECM and 3D ECM-free cultures generated organoids with internal morphologies most similar to native testes, including the de novo compartmentalization of tubular versus interstitial cell types, the development of tubule-like-structures, and an established long-term endocrine function. All methods studied utilized unsorted, primary murine testicular cell suspensions and used commonly accessible culture resources. These testicular organoid generation techniques provide a highly accessible and reproducible toolkit for research initiatives into testicular organogenesis and physiology in vitro.

Here, four methods for generating testicular organoids from primary neonatal murine testicular cells are described i.e., extracellular matrix (ECM) and ECM-free 2D and 3D culture environments. These techniques have multiple research applications and are especially useful for studying testicular development and physiology in vitro.

Ekstra Hücresel Matris Tabanlı ve Ekstra Hücresel Matrissiz Murine Testiküler Organoidlerin Üretimi

Testicular organoids provide a tool for studying testicular development, spermatogenesis, and endocrinology in vitro. Several methods have been developed ...

Isolation of Murine Spermatogenic Cells using a Violet-Excited Cell-Permeable DNA Binding Dye

Isolation of meiotic spermatocytes is essential to investigate molecular mechanisms underlying meiosis and spermatogenesis. Although there are established cell isolation protocols using Hoechst 33342 staining in combination with fluorescence-activated cell sorting, it requires cell sorters equipped with an ultraviolet laser. Here we describe a cell isolation protocol using the DyeCycle Violet (DCV) stain, a low cytotoxicity DNA binding dye structurally similar to Hoechst 33342. DCV can be excited by both ultraviolet and violet lasers, which improves the flexibility of equipment choice, including a cell sorter not equipped with an ultraviolet laser. Using this protocol, one can isolate three live-cell subpopulations in meiotic prophase I, including leptotene/zygotene, pachytene, and diplotene spermatocytes, as well as post-meiotic round spermatids. We also describe a protocol to prepare single-cell suspension from mouse testes. Overall, the procedure requires a short time to complete (4-5 hours depending on the number of needed cells), which facilitates many downstream applications.

Here we present a simple and efficient method to isolate live meiotic and post-meiotic germ cells from adult mouse testes. Using a low-cytotoxicity, violet-excited DNA binding dye and fluorescence-activated cell sorting, one can isolate highly enriched spermatogenic cell populations for many downstream applications.

Mor-Heyecanlı Hücre-Geçirgen DNA Bağlayıcı Boya Kullanılarak Murine Spermatojenik Hücrelerin İzolasyon

Isolation of meiotic spermatocytes is essential to investigate molecular mechanisms underlying meiosis and spermatogenesis. Although there are established ...

Germ Cell Transplantation and Testis Tissue Xenografting in Mice

Germ cell transplantation was developed by Dr. Ralph Brinster and colleagues at the University of Pennsylvania in 19941,2. These ground-breaking studies showed that microinjection of germ cells from fertile donor mice into the seminiferous tubules of infertile recipient mice results in donor-derived spermatogenesis and sperm production by the recipient animal2. The use of donor males carrying the bacterial &beta;-galactosidase gene allowed identification of donor-derived spermatogenesis and transmission of the donor haplotype to the offspring by recipient animals1. Surprisingly, after transplantation into the lumen of the seminiferous tubules, transplanted germ cells were able to move from the luminal compartment to the basement membrane where spermatogonia are located3. It is generally accepted that only SSCs are able to colonize the niche and re-establish spermatogenesis in the recipient testis. Therefore, germ cell transplantation provides a functional approach to study the stem cell niche in the testis and to characterize putative spermatogonial stem cells. To date, germ cell transplantation is used to elucidate basic stem cell biology, to produce transgenic animals through genetic manipulation of germ cells prior to transplantation4,5, to study Sertoli cell-germ cell interaction6,7, SSC homing and colonization3,8, as well as SSC self-renewal and differentiation9,10.
Germ cell transplantation is also feasible in large species11. In these, the main applications are preservation of fertility, dissemination of elite genetics in animal populations, and generation of transgenic animals as the study of spermatogenesis and SSC biology with this technique is logistically more difficult and expensive than in rodents. Transplantation of germ cells from large species into the seminiferous tubules of mice results in colonization of donor cells and spermatogonial expansion, but not in their full differentiation presumably due to incompatibility of the recipient somatic cell compartment with the germ cells from phylogenetically distant species12. An alternative approach is transplantation of germ cells from large species together with their surrounding somatic compartment. We first reported in 2002, that small fragments of testis tissue from immature males transplanted under the dorsal skin of immunodeficient mice are able to survive and undergo full development with the production of fertilization competent sperm13. Since then testis tissue xenografting has been shown to be successful in many species and emerged as a valuable alternative to study testis development and spermatogenesis of large animals in mice14.

Protocols for germ cell transplantation and testis tissue xenografting are described. Germ cell transplantation results in donor-derived spermatogenesis in recipient testes and represents a functional reconstitution assay for identification of spermatogonial stem cells (SSCs). Testis tissue xenografting reproduces testis development and spermatogenesis of various donor species in recipient mice.

Germ Hücre Nakli ve Testis Dokusu Farelerde Xenografting

Germ cell transplantation was developed by Dr. Ralph Brinster and colleagues at the University of Pennsylvania in 19941,2. These ground-breaking studies ...

Biyoloji

Serial Enrichment of Spermatogonial Stem and Progenitor Cells (SSCs) in Culture for Derivation of Long-term Adult Mouse SSC Lines

Spermatogonial stem and progenitor cells (SSCs) of the testis represent a classic example of adult mammalian stem cells and preserve fertility for nearly the lifetime of the animal. While the precise mechanisms that govern self-renewal and differentiation in vivo are challenging to study, various systems have been developed previously to propagate murine SSCs in vitro using a combination of specialized culture media and feeder cells1-3.
Most in vitro forays into the biology of SSCs have derived cell lines from neonates, possibly due to the difficulty in obtaining adult cell lines4. However, the testis continues to mature up until ~5 weeks of age in most mouse strains. In the early post-natal period, dramatic changes occur in the architecture of the testis and in the biology of both somatic and spermatogenic cells, including alterations in expression levels of numerous stem cell-related genes. Therefore, neonatally-derived SSC lines may not fully recapitulate the biology of adult SSCs that persist after the adult testis has reached a steady state.
Several factors have hindered the production of adult SSC lines historically. First, the proportion of functional stem cells may decrease during adulthood, either due to intrinsic or extrinsic factors5,6. Furthermore, as with other adult stem cells, it has been difficult to enrich SSCs sufficiently from total adult testicular cells without using a combination of immunoselection or other sorting strategies7. Commonly employed strategies include the use of cryptorchid mice as a source of donor cells due to a higher ratio of stem cells to other cell types8. Based on the hypothesis that removal of somatic cells from the initial culture disrupts interactions with the stem cell niche that are essential for SSC survival, we previously developed methods to derive adult lines that do not require immunoselection or cryptorchid donors but rather employ serial enrichment of SSCs in culture, referred to hereafter as SESC2,3.
The method described below entails a simple procedure for deriving adult SSC lines by dissociating adult donor seminiferous tubules, followed by plating of cells on feeders comprised of a testicular stromal cell line (JK1)3. Through serial passaging, strongly adherent, contaminating non-germ cells are depleted from the culture with concomitant enrichment of SSCs. Cultures produced in this manner contain a mixture of spermatogonia at different stages of differentiation, which contain SSCs, based on long-term self renewal capability. The crux of the SESC method is that it enables SSCs to make the difficult transition from self-renewal in vivo to long-term self-renewal in vitro in a radically different microenvironment, produces long-term SSC lines, free of contaminating somatic cells, and thereby enables subsequent experimental manipulation of SSCs.

Serial Enrichment of Spermatogonial Stem and Progenitor Cells SSCs in Culture for Derivation of Long-term Adult Mouse SSC Lines

A simple method to derive and maintain spermatogonial stem and progenitor cell lines from adult mice is presented here. The method utilizes feeder cells originating from the somatic cell compartment of the adult mouse testis. This technique is applicable to common mouse strains, including transgenic, knock-out, and knock-in mice.

Uzun vadeli Yetişkin Fare SSC Hatları türetilmesi için Kültür Spermatogonial Kök ve progenitör hücrelerin Seri Zenginleştirme (DGM)

Spermatogonial stem and progenitor cells (SSCs) of the testis represent a classic example of adult mammalian stem cells and preserve fertility for nearly ...

Simple and Efficient Technique for the Preparation of Testicular Cell Suspensions

Mammalian testes are very complex organs that contain over 30 different cell types, including somatic testicular cells and different stages of germline cells. This heterogeneity is an important drawback concerning the study of the bases of mammalian spermatogenesis, as pure or enriched cell populations in certain stages of sperm development are needed for most molecular analyses1.
 Various strategies such as Staput2,3, centrifugal elutriation1, and flow cytometry (FC)4,5 have been employed to obtain enriched or purified testicular cell populations in order to enable differential gene expression studies. 
It is required that cells are in suspension for most enrichment/ purification approaches. Ideally, the cell suspension will be representative of the original tissue, have a high proportion of viable cells and few multinucleates - which tend to form because of the syncytial nature of the seminiferous epithelium6,7 - and lack cell clumps1 . Previous reports had evidenced that testicular cell suspensions prepared by an exclusively mechanical method clumped more easily than trypsinized ones1 . On the other hand, enzymatic treatments with RNAses and/or disaggregating enzymes like trypsin and collagenase lead to specific macromolecules degradation, which is undesirable for certain downstream applications. The ideal process should be as short as possible and involve minimal manipulation, so as to achieve a good preservation of macromolecules of interest such as mRNAs. Current protocols for the preparation of cell suspensions from solid tissues are usually time-consuming, highly operator-dependent, and may selectively damage certain cell types1,8 . 
	The protocol presented here combines the advantages of a highly reproducible and extremely brief mechanical disaggregation with the absence of enzymatic treatment, leading to good quality cell suspensions that can be used for flow cytometric analysis and sorting4, and ulterior gene expression studies9 .

A novel protocol for the mechanical preparation of testicular cell suspensions from rodent material, avoiding enzymes and detergents, is described. The method is very simple, fast, reproducible, and renders good quality cell suspensions, which are suitable for flow sorting and RNA extraction.

Testis Hücre Cezalı Hazırlanması için basit ve Verimli Tekniği

Mammalian testes are very complex organs that contain over 30 different cell types, including somatic testicular cells and different stages of germline ...

Separation of Spermatogenic Cell Types Using STA-PUT Velocity Sedimentation

Mammalian spermatogenesis is a complex differentiation process that occurs in several stages in the seminiferous tubules of the testes. Currently, there is no reliable cell culture system allowing for spermatogenic differentiation in vitro, and most biological studies of spermatogenic cells require tissue harvest from animal models like the mouse and rat. Because the testis contains numerous cell types - both non-spermatogenic (Leydig, Sertoli, myeloid, and epithelial cells) and spermatogenic (spermatogonia, spermatocytes, round spermatids, condensing spermatids and spermatozoa) - studies of the biological mechanisms involved in spermatogenesis require the isolation and enrichment of these different cell types. The STA-PUT method allows for the separation of a heterogeneous population of cells - in this case, from the testes - through a linear BSA gradient. Individual cell types sediment with different sedimentation velocity according to cell size, and fractions enriched for different cell types can be collected and utilized in further analyses. While the STA-PUT method does not result in highly pure fractions of cell types, e.g. as can be obtained with certain cell sorting methods, it does provide a much higher yield of total cells in each fraction (~1 x 108 cells/spermatogenic cell type from a starting population of 7-8 x 108 cells). This high yield method requires only specialized glassware and can be performed in any cold room or large refrigerator, making it an ideal method for labs that have limited access to specialized equipment like a fluorescence activated cell sorter (FACS) or elutriator.

The STA-PUT method allows for the separation of different populations of spermatogenic cells based on size and density.

STA-PUT Hız Sedimentasyon kullanma spermatogenic Hücre Tiplerinin Ayrılması

Mammalian spermatogenesis is a complex  differentiation process that occurs in several stages in the seminiferous  tubules of the testes. Currently, there ...