Gostaríamos de agradecer aos nossos colaboradores, Francois Delori, Tomas Burke, e Tobias Duncker. Apoio à Pesquisa: NIH / NEI R01 EY015520 (RTS, JPG), e os fundos irrestritas de Investigação para Prevenir Cegueira (RTB).

Declaração de Ética: Todos os pacientes incluídos nestes estudos foram feitos lo de acordo com aprovado revisão institucional de supervisão bordo no New York University School of Medicine. 1. Seleção de Pacientes e preparação inicial para criação de imagens Nota: Os seguintes materiais são necessários: 0,5% solução oftálmica tropicamida, 2,5% solução oftálmica fenilefrina, cSLO equipado com espectral de tomografia de coerência óptica (SD-OCT), e referência interna de fluorescência. <ol><li> Antes de imagiologia, adequadamente configurado cSLO para aquisição de dados de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Montar uma referência interna fluorescente no cSLO. Nota: A referência fluorescente interno, comprado ao fabricante, está alojado em um anel de metal e é colocado diretamente atrás da lente da câmera. Se um cSLO de outro fabricante, é usado, pode haver uma configuração diferente do que aquele que está descrito emeste protocolo. <ol><li> A fim de inserir a referência no cSLO, torcer a lente para removê-lo, retire anel de metal da máquina, e substituí-lo com o novo anel de metal que contém a referência. Nota: a referência fluorescente interna é essencial para a técnica QAF, uma vez que permite a correção para a variação na potência do laser e um detector de sensibilidade / ganho. </li></ol></li><li> Tenha pacientes recrutados para imagens submeter a um exame de rotina olho dilatado e obter informações básicas sobre a história ocular passado e condições médicas subjacentes que podem se manifestar com achados oculares. </li><li> Dilatar os alunos com tropicamida 0,5% e 2,5% de fenilefrina. Passo crítico: Dilatar alunos a pelo menos 6 mm. Nota: Isto é essencial para a passagem ininterrupta de luz, e, portanto, para a visualização ideal e medição do fundo. </li><li> Antes da imagem, posicione o paciente adequadamente no cSLO, com o queixo apoiado na chinrest, testa colocado contra a forehead descanso, e ângulo ocular lateral, devidamente alinhados com os indicadores. </li></ol> 2. Base de imagem de fundo de olho <ol><li> Em primeiro lugar, a imagem do fundo com luz reflectância de infravermelho (IR) próximo (comprimento de onda de 820 nm), a fim de centralizar a câmera sobre a mácula e obter o foco áspero. <ol><li> Com o paciente posicionado corretamente, mude a configuração de hardware no painel de controle para o modo de imagem IR, câmera posição manualmente até o fundo está em foco completo, e ter uma imagem </li><li> Ajuste a configuração no painel de controle para &quot;IR-OCT&quot;, que usa espectral-domain tomografia de coerência óptica (SD-OCT) em conjunto com imagem IR para avaliar a mácula para a doença subjacente. </li><li> Use as guias presentes na janela de imagem para orientar corretamente a OCT para a imagem IR do fundo. Para obter ótimos SD-OCT qualidade, posicionar a câmera de modo que a imagem OCT é no terço superior da sua janela de imagem. Adquirir pelo menos uma sc linha horizontalum através da fóvea e que mede o campo de imagem inteira. </li></ol></li></ol> 3. Criação de Imagem QAF <ol><li> Use aquisição de imagem &quot;alta velocidade&quot;. Nota: Esta configuração permite a aquisição de imagem mais rápido, o que diminui o risco de perda de sinal devido ao movimento do paciente e resultando bloqueio da luz pela íris ou pálpebras. </li><li> Use &quot;A média de 9&quot; frames. Nota: Esta configuração permite a rápida captura, sequencial de 9 quadros de imagem, que podem ser posteriormente &quot;média&quot; para reduzir o ruído e artefacto (veja abaixo). </li><li> Use campo &quot;30 x 30 graus&quot;. Nota: Isto se refere aos graus de área da retina capturado durante a aquisição de imagem. </li><li> Antes de imagiologia, alertam paciente sobre a luz azul, pois isso pode ser alarmante em primeiro lugar. </li><li> Ligue o modo AF e alinhar eixo da câmara de tal modo que a tela é maximamente &quot;preenchido&quot; com AF fundo de olho (escurecimento mínima dos lados e cantos da imagem). <ol><li> Se os pacientes hdificuldade av tolerar a luz azul brilhante, começar de imagem com a câmera mais longe do olho e, em seguida, levar a câmera lentamente na direção do paciente até o fundo do útero está totalmente à vista. Passo crítico: Se a luz que entrem ou deixem a partir do olho é obstruída, diminuição do sinal irá resultar. diminuição localizada é visível como escurecimento assimétrica de um lado imagem ou canto. perda generalizada de sinal é visto quando os movimentos dos olhos sozinho obstruir a passagem de luz. </li></ol></li><li> Alinhe a câmera de modo que o sinal AF está em seu nível mais alto em todo o campo. Apontar para sinal máximo em vez de imagem mais nítida, no entanto, cerca de correlacionar. Ajuste o foco da câmera movendo o cSLO para reposicionar a câmera manualmente ou com o joystick oftalmoscópio. </li><li> Ajustar a sensibilidade / ganho de tal forma que fundus AF é facilmente visível, mas evitar o excesso de saturação. Durante a aquisição de imagem, pixels coloridos visíveis tanto na referência interna (localizado na parte superior doimagem) ou do fundo indicam excesso de saturação e, portanto, perda de sinal. </li></ol> 4. Aquisição de Imagem Nota: passo crítico: O objetivo da aquisição de imagem deve ser a obtenção de 2 qualidade 9-quadro pilhas altas imagem por sessão para controlar a variabilidade entre as imagens dentro de uma sessão. Depois de reposicionar o paciente e câmera, obter uma segunda sessão de duas imagens para avaliar e controle para variabilidade. Todas as imagens estarão em última análise, ser calibrado para a referência interna (descrito abaixo). <ol><li> Adquirir imagens só depois de pelo menos 20 segundos de &quot;branqueamento&quot; (exposição cheia de retina à luz AF) para minimizar a absorção de luz por rodopsina na retina sensorial 9. <ol><li> Utilizar este período para otimizar o alinhamento da câmera, foco e sensibilidade. </li></ol></li><li> Têm os assuntos piscar antes de cada aquisição de imagem como um filme lacrimal fresco melhora a qualidade do sinal. </li><li> Evitar pálpebras no plano de aquisição. Nota: Pode ser útil para manualmente as pálpebras abertas para pacientes mais difíceis. Os autores recomendam que um assistente executa esta tarefa. </li><li> Otimizar o alinhamento antes de cada aquisição de imagem para garantir que a luz não é obstruída pela íris, resultando em sinal de diminuição. Nota: Como pelo menos uma pequena deslocação é muito comum, os autores recomendam realinhamento bem como necessário antes de cada aquisição de imagem. Orientar e incentivar o paciente enquanto imaging ajuda movimento diminuição. Os autores também recomendo o uso do pé-pedal da máquina como o botão &quot;aquisição&quot; de modo a minimizar a distração do operador. </li><li> Executar o processamento pós-imagem, calculando a &quot;média&quot; da pilha de 9-quadro para aumentar a relação sinal-ruído. Calcula-se a média de uma pilha usando o software cSLO, seleccionando a opção para calcular a média. Nota: Pode haver pilhas onde alguns quadros não são de ótima qualidade (ou seja, ter localizada ou generalizada diminuiu sinal em relação aos quadros óptimas), portanto verifique cuidadosamente cada pilha e desmarque quadros sub-óptimos antes de cálculo da média. Nota: imagens médias com índices aceitáveis ​​de sinal-para-ruído pode ser processado a partir de, pelo menos, 3 quadros. É normal para os lados e cantos de cada imagem para ter sinal de menor do que os centrais 20 graus, devido a limitações dentro do próprio cSLO. <ol><li> Se o software pergunta se o operador gostaria de normalizar os níveis de cinza (ou seja, alongar o histograma) entre 0 e 255, selecione &quot;Não&quot;. Isso mantém níveis de cinza inalterados para análise. </li></ol></li></ol> Análise 5. Imagem <ol><li> Analisar imagens AF como descrito anteriormente usando o software de análise de imagem desenvolvido para a técnica QAF (IGOR; 9). Uma breve descrição de uma análise de imagem típica usando este software está incluído abaixo. <ol><li> Carregar o programa QAF em IGOR e importar imagens (em formato .bmp) exportados dasoftware cSLO com proporção de pixel 768 x 768 (parâmetro de saída padrão). </li><li> Selecione a imagem no menu drop-down e iniciar a análise. </li><li> Reposicionar indicadores de calibração na imagem de modo a que os &quot;mira&quot; sobrepor a fóvea e do &quot;suporte&quot; confina com o disco óptico (estes indicadores são usados ​​para dimensionar e posicionar os ROIs). Quando devidamente posicionado, software uso prompts em seguida, preencher a imagem com ROIs circunferenciais em torno da fóvea (ver Figuras 1, 2). </li><li> Selecionar a opção no IGOR para calibrar os níveis de cinza globais de cada imagem para esses níveis presentes na referência fluorescente interno. Nota: Esta etapa permite a calibração dos factores relacionados com a máquina, incluindo o nível eletrônico de zero de cada imagem e o fator de calibração de referência interna de cada máquina, bem como fatores relacionados aos pacientes, incluindo idade, refração e curvatura corneana. Nota: O software de análise, em seguida, exibe o r fixoegiões sobre a imagem resultante e um valor Qaf é demonstrada no interior de cada região. valores QAF também são inseridos automaticamente em um formato de planilha em uma janela separada &quot;. </li><li> Gerar QAF &quot;mapas de calor&quot;, selecionando a opção dentro dos prompts de comando. Todas as imagens e os dados podem ser exportados a partir do software IGOR em uma planilha do Excel, selecionando as opções apropriadas. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Strauss, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinal+pigment+epithelium+in+visual+function.">The retinal pigment epithelium in visual function.</a> Physiological reviews. 85, 845-881 (2005).</li><li>Ach, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+autofluorescence+and+cell+density+maps+of+the+human+retinal+pigment+epithelium.">Quantitative autofluorescence and cell density maps of the human retinal pigment epithelium.</a> Investigative ophthalmology &amp; visual science. 55, 4832-4841 (2014).</li><li>Ach, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipofuscin+redistribution+and+loss+accompanied+by+cytoskeletal+stress+in+retinal+pigment+epithelium+of+eyes+with+age-related+macular+degeneration.">Lipofuscin redistribution and loss accompanied by cytoskeletal stress in retinal pigment epithelium of eyes with age-related macular degeneration.</a> Investigative ophthalmology &amp; visual science. 56, 3242-3252 (2015).</li><li>Schmitz-Valckenberg, S., Jorzik, J., Unnebrink, K., Holz, F. G., Group, F. A. M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+digital+scanning+laser+ophthalmoscopy+fundus+autofluorescence+images+of+geographic+atrophy+in+advanced+age-related+macular+degeneration.">Analysis of digital scanning laser ophthalmoscopy fundus autofluorescence images of geographic atrophy in advanced age-related macular degeneration.</a> Graefe's archive for clinical and experimental ophthalmology = Albrecht von Graefes Archiv fur klinische und experimentelle Ophthalmologie. 240, 73-78 (2002).</li><li>Weng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+function+of+Rim+protein+in+photoreceptors+and+etiology+of+Stargardt's+disease+from+the+phenotype+in+abcr+knockout+mice.">Insights into the function of Rim protein in photoreceptors and etiology of Stargardt's disease from the phenotype in abcr knockout mice.</a> Cell. 98, 13-23 (1999).</li><li>Holz, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+lysosomal+degradative+functions+in+RPE+cells+by+a+retinoid+component+of+lipofuscin.">Inhibition of lysosomal degradative functions in RPE cells by a retinoid component of lipofuscin.</a> Investigative ophthalmology &amp; visual science. 40, 737-743 (1999).</li><li>Sparrow, J. R., Nakanishi, K., Parish, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lipofuscin+fluorophore+A2E+mediates+blue+light-induced+damage+to+retinal+pigmented+epithelial+cells.">The lipofuscin fluorophore A2E mediates blue light-induced damage to retinal pigmented epithelial cells.</a> Investigative ophthalmology &amp; visual science. 41, 1981-1989 (2000).</li><li>Smith, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipofuscin+and+autofluorescence+metrics+in+progressive+STGD.">Lipofuscin and autofluorescence metrics in progressive STGD.</a> Investigative ophthalmology &amp; visual science. 50, 3907-3914 (2009).</li><li>Delori, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+measurements+of+autofluorescence+with+the+scanning+laser+ophthalmoscope.">Quantitative measurements of autofluorescence with the scanning laser ophthalmoscope.</a> Investigative ophthalmology &amp; visual science. 52, 9379-9390 (2011).</li><li>Burke, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+fundus+autofluorescence+in+recessive+Stargardt+disease.">Quantitative fundus autofluorescence in recessive Stargardt disease.</a> Investigative ophthalmology &amp; visual science. 55, 2841-2852 (2014).</li><li>Duncker, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+fundus+autofluorescence+and+optical+coherence+tomography+in+best+vitelliform+macular+dystrophy.">Quantitative fundus autofluorescence and optical coherence tomography in best vitelliform macular dystrophy.</a> Investigative ophthalmology &amp; visual science. 55, 1471-1482 (2014).</li><li>Duncker, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+fundus+autofluorescence+distinguishes+ABCA4-associated+and+non-ABCA4-associated+bull's-eye+maculopathy.">Quantitative fundus autofluorescence distinguishes ABCA4-associated and non-ABCA4-associated bull's-eye maculopathy.</a> Ophthalmology. 122, 345-355 (2015).</li><li>Greenberg, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+fundus+autofluorescence+in+healthy+eyes.">Quantitative fundus autofluorescence in healthy eyes.</a> Investigative ophthalmology &amp; visual science. 54, 5684-5693 (2013).</li><li>Delori, F. C., Goger, D. G., Dorey, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+accumulation+and+spatial+distribution+of+lipofuscin+in+RPE+of+normal+subjects.">Age-related accumulation and spatial distribution of lipofuscin in RPE of normal subjects.</a> Investigative ophthalmology &amp; visual science. 42, 1855-1866 (2001).</li><li>Sparrow, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+fundus+autofluorescence+in+mice:+correlation+with+HPLC+quantitation+of+RPE+lipofuscin+and+measurement+of+retina+outer+nuclear+layer+thickness.">Quantitative fundus autofluorescence in mice: correlation with HPLC quantitation of RPE lipofuscin and measurement of retina outer nuclear layer thickness.</a> Investigative ophthalmology &amp; visual science. 54, 2812-2820 (2013).</li><li>Delori, F. C., Webb, R. H., Sliney, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maximum+permissible+exposures+for+ocular+safety+(ANSI+2000),+with+emphasis+on+ophthalmic+devices.">Maximum permissible exposures for ocular safety (ANSI 2000), with emphasis on ophthalmic devices.</a> Journal of the Optical Society of America. A, Optics, image science, and vision. 24, 1250-1265 (2007).</li></ol>

STA: no disclosures, JPG: no disclosures, RTS: consultant, Ocata Therapeutics.

distribuição de lipofuscina EPR anormal, quer aumentada ou diminuída, é um marcador sensível da doença da retina e é geralmente associada com a perda da função retina sensorial. Aqui, nós descrevemos a aplicação de Qaf para a avaliação de lipofuscina EPR. Incorporação de uma referência fluorescente interna para corrigir a variável de potência do laser e um detector de sensibilidade 9 juntamente com a nossa técnica de imagem padronizada permite a quantificação confiável dos níveis de AF...

O epitélio do pigmento da retina (EPR) suporta a função da retina sensorial através de numerosos processos 1. degeneração macular relacionada com a idade (AMD) é a causa mais importante de cegueira intratável em países industrializados e é caracterizada por alterações na EPR, incluindo perda de pigmento, perda de função e atrofia. Em AMD e no envelhecimento normal, o RPE acumula organelas fluorescentes, derivadas do lisossoma contendo fragmentos fotorreceptoras fagocitado, referidos como grânulos de lipofuscina. A acumulação de lipofuscina EPR foi pensado para indicar disfunção oxidativo 1, mas estudos recentes têm demonstrado que a morfologia do EPR ​​permanece normal em olhos idade com altos níveis de lipofuscina 2. Marcadores No entanto, padrões anormais de distribuição de lipofuscina, nomeadamente a perda de lipofuscina, estão documentados para a progressão AMD e AMD, tanto histologicamente e clinicamente 3,4 proces defeituososcante de lipofuscina EPR foi também demonstrado que ocorrem em certos degenerações retinais hereditárias. Pacientes que sofrem de doença de Stargardt (STGD) acumulam lipofuscina no RPE em uma idade jovem, eventualmente, desenvolver perda de visão semelhante ao visto em AMD 5. Estes achados sugerem que o acúmulo de lipofuscina pode ser ele próprio tóxico e conduzir RPE disfunção 6,7. No entanto, um estudo de imagem detalhada de indivíduos com STGD ao longo do tempo não confirmam que o acúmulo de lipofuscina focal levou a subsequente perda de RPE 8. Por isso, embora anormalidades lipofuscina são marcadores para degenerações da retina, um papel para a toxicidade direta de lipofuscina ainda não foi provado. O EPR é a camada mais posterior da célula da retina, mas gera a maior parte do sinal fluorescente a partir do fundo ocular. Geração e detecção de autofluorescência (AF) derivado do EPR pode ser realizada utilizando oftalmoscopia de laser confocal de varredura (cSLO), que permite a VIsualização da distribuição espacial da FA fundus. Certos degenerações retinianas demonstram padrões distintos de fundo de olho AF, e auxiliares de imagem AF do diagnóstico e acompanhamento dessas condições. Apesar de imagem AF padrão é clinicamente importante, AF quantitativa (QAF) tornou-se um importante meio de avaliar a saúde RPE. Nós e outros desenvolveram uma abordagem padronizada que podem determinar com confiança níveis QAF em locais específicos da retina 9. QAF tem aplicações potenciais no diagnóstico e monitoramento das condições da retina, e também pode ter utilidade no prognóstico e estratificação de risco. Além disso, as capacidades de diagnóstico de Qaf também foram descritas para certos distúrbios da retina 10-12. Aqui, nós fornecemos detalhes passo a passo para a realização de nossa técnica acompanhada por uma demonstração visual da sua aplicação na avaliação de olhos saudáveis ​​e doentes.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="671">
	<tbody>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:243px;">Spectralis HRA + OCT</td>
			<td style="width:143px;">Heidelberg Engineering</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">0.5% tropicamide ophthalmic solution</td>
			<td style="width:143px;">n/a</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">2.5% phenylephrine ophthalmic solution</td>
			<td style="width:143px;">n/a</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:243px;">Internal fluorescent reference</td>
			<td style="width:143px;">Heidelberg Engineering</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">IGOR Pro software</td>
			<td style="width:143px;">WaveMetrics</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative fundus autofluorescence for the evaluation of retinal diseases

The retinal pigment epithelium (RPE) is juxtaposed to the overlying sensory retina, and supports the function of the visual system. Among the tasks performed by the RPE are phagocytosis and processing of outer photoreceptor segments through lysosome-derived organelles. These degradation products, stored and referred to as lipofuscin granules, are composed partially of bisretinoids, which have broad fluorescence absorption and emission spectra that can be detected clinically as fundus autofluorescence with confocal scanning laser ophthalmoscopy (cSLO). Lipofuscin accumulation is associated with increasing age, but is also found in various patterns in both acquired and inherited degenerative diseases of the retina. Thus, studying its pattern of accumulation and correlating such patterns with changes in the overlying sensory retina are essential to understanding the pathophysiology and progression of retinal disease. Here, we describe a technique employed by our lab and others that uses cSLO in order to quantify the level of RPE lipofuscin in both healthy and diseased eyes.

Esta técnica foi utilizada para estudar QAF em ambos os saudáveis ​​13 e doença estados 10-12. Em olhos saudáveis ​​(Figura 1), AF emitida a partir da EPR é distribuído relativamente uniforme por todo o fundo (Figura 1A). intensidade reduzida é visto na região macular central devido ao bloqueio da luz pelo pigmento macular, e para os lados e cantos da imagem devido a óptica do olho e câmera. Vasos aparecem escuras ...

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Quantitative Fundus Autofluorescence for the Evaluation of Retinal Diseases

Quantitativa de autofluorescência de Avaliação de Doenças da retina

The retinal pigment epithelium (RPE) supports the sensory retina through recycling visual cycle byproducts, which accumulate as lipofuscin. These products are autofluorescent and can be qualitatively imaged in vivo. Here, we describe a method to quantitatively image RPE lipofuscin using confocal scanning laser ophthalmoscopy.

The retinal pigment epithelium (RPE) is juxtaposed to the overlying sensory retina, and supports the function of the visual system. Among the tasks ...

quantitative-fundus-autofluorescence-for-evaluation-retinal

Research

JoVE Journal

Medicine

11.3K visualizações.  NYU School of Medicine. The retinal pigment epithelium (RPE) supports the sensory retina through recycling visual cycle byproducts, which accumulate as lipofuscin. These products are autofluorescent and can be qualitatively imaged in vivo. Here, we describe a method to quantitatively image RPE lipofuscin using confocal scanning laser ophthalmoscopy. 

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The Use of Primary Human Fibroblasts for Monitoring Mitochondrial Phenotypes in the Field of Parkinson's Disease

Parkinson's disease (PD) is the second most common movement disorder and affects 1% of people over the age of 60 1. Because ageing is the most important risk factor, cases of PD will increase during the next decades 2. Next to pathological protein folding and impaired protein degradation pathways, alterations of mitochondrial function and morphology were pointed out as further hallmark of neurodegeneration in PD 3-11.
After years of research in murine and human cancer cells as in vitro models to dissect molecular pathways of Parkinsonism, the use of human fibroblasts from patients and appropriate controls as ex vivo models has become a valuable research tool, if potential caveats are considered. Other than immortalized, rather artificial cell models, primary fibroblasts from patients carrying disease-associated mutations apparently reflect important pathological features of the human disease.
Here we delineate the procedure of taking skin biopsies, culturing human fibroblasts and using detailed protocols for essential microscopic techniques to define mitochondrial phenotypes. These were used to investigate different features associated with PD that are relevant to mitochondrial function and dynamics. Ex vivo, mitochondria can be analyzed in terms of their function, morphology, colocalization with lysosomes (the organelles degrading dysfunctional mitochondria) and degradation via the lysosomal pathway. These phenotypes are highly relevant for the identification of early signs of PD and may precede clinical motor symptoms in human disease-gene carriers. Hence, the assays presented here can be utilized as valuable tools to identify pathological features of neurodegeneration and help to define new therapeutic strategies in PD.

Fibroblasts from patients carrying mutations in Parkinson's disease-causing genes represent an easily accessible ex vivo model to study disease-associated phenotypes. Live cell imaging gives the opportunity to study morphological and functional parameters in living cells. Here we describe the preparation of human fibroblasts and subsequent monitoring of mitochondrial phenotypes.

A utilização de recursos primários fibroblastos humanos de Monitoramento Fenótipos mitocondriais no Campo da Doença de Parkinson

Parkinson's disease (PD) is the second most  common movement disorder and affects 1% of people over the age of 60 1. Because ageing is  the most important ...

Medicina

Techniques for Processing Eyes Implanted with a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis: Part 2 Epiretinal Implants with Retinal Tacks

Retinal prostheses for the treatment of certain forms of blindness are gaining traction in clinical trials around the world with commercial devices currently entering the market. In order to evaluate the safety of these devices, in preclinical studies, reliable techniques are needed. However, the hard metal components utilised in some retinal implants are not compatible with traditional histological processes, particularly in consideration for the delicate nature of the surrounding tissue. Here we describe techniques for assessing the health of the eye directly adjacent to a retinal implant secured epiretinally with a metal tack.
Retinal prostheses feature electrode arrays in contact with eye tissue. The most commonly used location for implantation is the epiretinal location (posterior chamber of the eye), where the implant is secured to the retina with a metal tack that penetrates all the layers of the eye. Previous methods have not been able to assess the proximal ocular tissue with the tack in situ, due to the inability of traditional histological techniques to cut metal objects. Consequently, it has been difficult to assess localized damage, if present, caused by tack insertion.
Therefore, we developed a technique for visualizing the tissue around a retinal tack and implant. We have modified an established technique, used for processing and visualizing hard bony tissue around a cochlear implant, for the soft delicate tissues of the eye. We orientated and embedded the fixed eye tissue, including the implant and retinal tack, in epoxy resin, to stabilise and protect the structure of the sample. Embedded samples were then ground, polished, stained, and imaged under various magnifications at incremental depths through the sample. This technique allowed the reliable assessment of eye tissue integrity and cytoarchitecture adjacent to the metal tack.

Here we describe histological techniques for visualising ocular tissue directly adjacent to a metal epiretinal tack and retinal prosthesis.

Técnicas de processamento Olhos implantados com uma Retinal Prosthesis para localizada análise histopatológica: Parte 2 Epirretiniana implantes com tachas da retina

Retinal prostheses for the treatment of certain forms of blindness are gaining traction in clinical trials around the world with commercial devices ...

Automated Radiochemical Synthesis of [18F]3F4AP: A Novel PET Tracer for Imaging Demyelinating Diseases

3-[18F]fluoro-4-aminopyridine, [18F]3F4AP, is a radiofluorinated analog of the FDA-approved drug for multiple sclerosis 4-aminopyridine (4AP). This compound is currently under investigation as a PET tracer for demyelination. We recently described a novel chemical reaction to produce metafluorinated pyridines consisting of direct fluorination of a pyridine N-oxide and the utilization of this reaction for the radiochemical synthesis of [18F]3F4AP. In this article, we demonstrate how to produce this tracer using an automated synthesizer and an in-house made flow hydrogenation reactor. We also show the standard quality control procedures performed before releasing the radiotracer for preclinical animal imaging studies. This semi-automated procedure may serve as the basis for future production of [18F]3F4AP for clinical studies.

Automated Radiochemical Synthesis of [18F]3F4AP: A Novel PET Tracer for Imaging Demyelinating Diseases

We demonstrate the semi-automated radiochemical synthesis of [18F]3F4AP and quality control procedures.

Automotive Radiochemical Synthesis of [<sup&gt; 18</sup&gt; F] 3F4AP: Um novo marcador de PET para imagens de doenças desmielinizantes

3-[18F]fluoro-4-aminopyridine, [18F]3F4AP, is a radiofluorinated analog of the FDA-approved drug for multiple sclerosis 4-aminopyridine (4AP). This ...

Smartphone Fundus Photography

Smartphone fundus photography is a simple technique to obtain ocular fundus pictures using a smartphone camera and a conventional handheld indirect ophthalmoscopy lens. This technique is indispensable when picture documentation of optic nerve, retina, and retinal vessels is necessary but a fundus camera is not available. The main advantage of this technique is the widespread&#160;availability of smartphones that allows documentation of macula and optic nerve changes in many settings that was not previously possible. Following the well-defined steps detailed here, such as proper alignment of the phone camera, handheld lens, and the patient&#39;s pupil, is the key for obtaining a clear retina picture with no interfering light reflections and aberrations. In this paper, the optical principles of indirect ophthalmoscopy and fundus photography will be reviewed first. Then, the step-by-step method to record a good quality retinal image using a smartphone will be explained.

Fundus photography normally requires specialized fundus cameras that are not always available in all clinical settings.&#160;Here, a simple method to record ocular fundus images using a smartphone camera and a conventional high-plus handheld indirect ophthalmoscopy lens is described.

Smartphone fundus photography is a simple technique to obtain ocular fundus pictures using a smartphone camera and a conventional handheld indirect ...

Using Retinal Imaging to Study Dementia

The retina offers a unique &#8220;window&#8221; to study pathophysiological processes of dementia in the brain, as it is an extension of the central nervous system (CNS) and shares prominent similarities with the brain in terms of embryological origin, anatomical features and physiological properties.&#160; The vascular and neuronal structure in the retina can now be visualized easily and non-invasively using retinal imaging techniques, including fundus photography and optical coherence tomography (OCT), and quantified semi-automatically using computer-assisted analysis programs. Studying the associations between vascular and neuronal changes in the retina and dementia could improve our understanding of dementia and, potentially, aid in diagnosis and risk assessment.&#160; This protocol aims to describe a method of quantifying and analyzing retinal vasculature and neuronal structure, which are potentially associated with dementia. This protocol also provides examples of retinal changes in subjects with dementia, and discusses technical issues and current limitations of retinal imaging.

The retina shares prominent similarities with the brain and thus represents a unique window to study vasculature and neuronal structure in the brain non-invasively. This protocol describes a method to study dementia using retinal imaging techniques. This method can potentially aid in diagnosis and risk assessment of dementia.

Utilizando imagens da retina para estudar a demência

The retina offers a unique &#8220;window&#8221; to study pathophysiological processes of dementia in the brain, as it is an extension of the central ...

Invasive Hemodynamic Assessment for the Right Ventricular System and Hypoxia-Induced Pulmonary Arterial Hypertension in Mice

Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a chronic and severe cardiopulmonary disorder. Mice are a popular animal model used to mimic this disease. However, the evaluation of right ventricular pressure (RVP) and pulmonary artery pressure (PAP) remains technically challenging in mice. RVP and PAP are more difficult to measure than left ventricular pressure because of the anatomical differences between the left and right heart systems. In this paper, we describe a stable right heart hemodynamic measurement method and its validation using healthy and PAH mice. This method is based on open-chest surgery and mechanical ventilation support. It is a complicated procedure compared to closed chest procedures. While a well-trained surgeon is required for this surgery, the advantage of this procedure is that it can generate both RVP and PAP parameters at the same time, so it is a preferable procedure for the evaluation of PAH models.

Here, we present a protocol to perform an invasive hemodynamic assessment of the right ventricle and pulmonary artery in mice using an open-chest surgery approach.

Avaliação Hemodinâmica Invasiva para o Sistema Ventricular Direito e hipertensão arterial pulmonar induzida por hipóxia em camundongos

Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a chronic and severe cardiopulmonary disorder. Mice are a popular animal model used to mimic this disease. ...

Oxygen-Induced Retinopathy Model for Ischemic Retinal Diseases in Rodents

One of the commonly used models for ischemic retinopathies is the oxygen-induced retinopathy (OIR) model. Here we describe detailed protocols for the OIR model induction and its readouts in both mice and rats. Retinal neovascularization is induced in OIR by exposing rodent pups either to hyperoxia (mice) or alternating levels of hyperoxia and hypoxia (rats). The primary readouts of these models are the size of neovascular (NV) and avascular (AVA) areas in the retina. This preclinical in vivo model can be used to evaluate the efficacy of potential anti-angiogenic drugs or to address the role of specific genes in the retinal angiogenesis by using genetically manipulated animals. The model has some strain and vendor specific variation in the OIR induction which should be taken into consideration when designing the experiments.

Oxygen-induced retinopathy (OIR) can be used to model ischemic retinal diseases such as retinopathy of prematurity and proliferative diabetic retinopathy and to serve as a model for proof-of-concept studies in evaluating antiangiogenic drugs for neovascular diseases. OIR induces robust and reproducible neovascularization in the retina that can be quantified.

Modelo de Retinopatia Induzida por Oxigênio para Doenças Isquêmicas da Retina em Roedores

One of the commonly used models for ischemic retinopathies is the oxygen-induced retinopathy (OIR) model. Here we describe detailed protocols for the OIR ...

Retinal Pigment Epithelium Transplantation in a Non-human Primate Model for Degenerative Retinal Diseases

Retinal pigment epithelial (RPE) transplantation holds great promise for the treatment of inherited and acquired retinal degenerative diseases. These conditions include retinitis pigmentosa (RP) and advanced forms of age-related macular degeneration (AMD), such as geographic atrophy (GA). Together, these disorders represent a significant proportion of currently untreatable blindness globally. These unmet medical needs have generated heightened academic interest in developing methods of RPE replacement. Among the animal models commonly utilized for preclinical testing of therapeutics, the non-human primate (NHP) is the only animal model that has a macula. As it shares this anatomical similarity with the human eye, the NHP eye is an important and appropriate preclinical animal model for the development of advanced therapy medicinal products (ATMPs) such as RPE cell therapy.
This manuscript describes a method for the submacular transplantation of an RPE monolayer, cultured on a polyethylene terephthalate (PET) cell carrier, underneath the macula onto a surgically created RPE wound in immunosuppressed NHPs. The fovea-the central avascular portion of the macula-is the site of the greatest mechanical weakness during the transplantation. Foveal trauma will occur if the initial subretinal fluid injection generates an excessive force on the retina. Hence, slow injection under perfluorocarbon liquid (PFCL) vitreous tamponade is recommended with a dual-bore subretinal injection cannula at low intraocular pressure (IOP) settings to create a retinal bleb. 
Pretreatment with an intravitreal plasminogen injection to release parafoveal RPE-photoreceptor adhesions is also advised. These combined strategies can reduce the likelihood of foveal tears when compared to conventional techniques. The NHP is a key animal model in the preclinical phase of RPE cell therapy development. This protocol addresses the technical challenges associated with the delivery of RPE cellular therapy in the NHP eye.

The non-human primate (NHP) is an ideal model for studying human retinal cellular therapeutics due to the anatomical and genetic similarities. This manuscript describes a method for submacular transplantation of retinal pigment epithelial cells in the NHP eye and strategies to prevent intraoperative complications associated with macular manipulation.

Transplante de Epitélio de Pigmento De Retina em um modelo de primata não humano para doenças degenerativas da retina

Retinal pigment epithelial (RPE) transplantation holds great promise for the treatment of inherited and acquired retinal degenerative diseases. These ...

Retinal Pathophysiological Evaluation in a Rat Model

A posterior segment eye disease like diabetic retinopathy alters the physiology of the retina. Diabetic retinopathy is characterized by a retinal detachment, breakdown of the blood-retinal barrier (BRB), and retinal angiogenesis. An in vivo rat model is a valuable experimental tool to examine the changes in the structure and function of the retina. We propose three different experimental techniques in the rat model to identify morphological changes of retinal cells, retinal vasculature, and compromised BRB. Retinal histology is used to study the morphology of various retinal cells. Also, quantitative measurement is performed by retinal cell count and thickness measurement of different retinal layers. A BRB breakdown assay is used to determine the leakage of extraocular proteins from the plasma to vitreous tissue due to the breakdown of BRB. Fluorescence angiography is used to study angiogenesis and leakage of blood vessels by visualizing retinal vasculature using FITC-dextran dye.

Diabetic retinopathy is one of the leading causes of blindness. Histology, blood-retinal barrier breakdown assay, and fluorescence angiography are valuable techniques to understand the pathophysiology of the retina, which could further enhance the efficient drug screening against diabetic retinopathy.

Avaliação fisiofisiológica da retina em um modelo de rato

A posterior segment eye disease like diabetic retinopathy alters the physiology of the retina. Diabetic retinopathy is characterized by a retinal ...

Repetitive Blood Sampling from the Subclavian Vein of Conscious Rat

Rats are widely used in pharmacokinetics (PK) and toxicokinetic (TK) studies that need to collect a certain amount of blood at specific time points to detect drug exposure. The rat blood sampling method determines the quality of the plasma and further affects the precision of the test results. The subclavian vein blood collection method described in this protocol collects blood samples repeatedly in the conscious state of animals to meet the needs of PK and TK tests. The skills of restraint handling and appropriate procedure of needle incision ensure the success rate of blood collection. It is easy to operate while ensuring the quality of plasma and at the same time catering to animal welfare. However, this method requires skilled operation, and an improper one may cause animal weakness, pain, lameness, and even mortality. The current method has been used in the testing facility for a 4-week oral toxicity study in Sprague Dawley (SD) rats with TK. The maximum amount of blood collected within 24 h did not exceed 20% of the animal's total blood. The animals' body weight was more than 200 g for males and females. The data showed that the animals' bodyweight increased steadily every week, and the clinical observation was normal after repetitive sample collection.

The present protocol describes a simple and efficient method for collecting blood from the subclavian vein in rats. It enables rapid, timely, and easily identifiable sampling without anesthesia and obtains high-quality blood through repetitive sample collection.

Amostragem Repetitiva de Sangue da Veia Subclávia de Rato Consciente

Rats are widely used in pharmacokinetics (PK) and toxicokinetic (TK) studies that need to collect a certain amount of blood at specific time points to ...