Vorremmo ringraziare i nostri collaboratori, Francois Delori, Tomas Burke e Tobias Duncker. Supporto di ricerca: NIH / NEI R01 EY015520 (RTS, JPG), e fondi disponibili da Research per prevenire la cecità (RTB).

Etica Dichiarazione: Tutti i pazienti arruolati in questi studi sono stati fatti così in conformità approvato revisione istituzionale di Vigilanza presso la New York University School of Medicine. 1. selezione dei pazienti e preparazione iniziale per l&#39;imaging Nota: Sono necessari i seguenti materiali: 0.5% soluzione oftalmica tropicamide, 2,5% soluzione oftalmica fenilefrina, cSLO dotato di dominio spettrale tomografia a coerenza ottica (SD-OCT), e il riferimento di fluorescenza interna. <ol><li> Prima di immagini, opportunamente istituito cSLO per l&#39;acquisizione dei dati in base alle istruzioni del produttore. </li><li> Montare un riferimento fluorescente interna nel cSLO. Nota: Il riferimento fluorescente interna, come acquistati dal produttore, è ospitato in un anello di metallo e viene posizionato direttamente dietro l&#39;obiettivo della fotocamera. Se viene utilizzato un cSLO da un altro produttore, ci può essere una configurazione diversa da quella che è descritta inquesto protocollo. <ol><li> Per inserire il riferimento nella cSLO, ruotare la lente per rimuoverla, svitare ghiera della macchina, e sostituirlo con il nuovo anello metallico contenente il riferimento. Nota: il riferimento fluorescente interno è essenziale alla tecnica QaF, in quanto consente la correzione per variazione di potenza del laser e rivelatore di sensibilità / guadagno. </li></ol></li><li> Hanno pazienti reclutati per l&#39;imaging sottoposti ad un esame di routine occhio dilatato e ottenere informazioni di base sulla storia passata e oculare condizioni mediche di base che possono manifestarsi con i risultati oculari. </li><li> Dilatare gli alunni con lo 0,5% e il 2,5% tropicamide fenilefrina. PUNTO CRITICO: Dilata alunni di almeno 6 mm. Nota: Ciò è essenziale per passaggio continuo di luce, e quindi per la visualizzazione ottimale e la misurazione del fondo. </li><li> Prima di immagini, posizionare il paziente correttamente sul cSLO, con il mento appoggiato sul mentoniera, la fronte posta contro la forehead riposo, e angoli palpebrali laterali correttamente allineati con gli indicatori. </li></ol> 2. Baseline Imaging del fondo oculare <ol><li> In primo luogo, l&#39;immagine del fondo oculare con riflessione della luce infrarossa (IR), vicino (lunghezza d&#39;onda di 820 nm) al fine di centralizzare la fotocamera sopra la macula e ottenere messa a fuoco approssimativa. <ol><li> Con il paziente posizionato correttamente, attivare l&#39;impostazione hardware sul pannello di controllo per la modalità di imaging IR, macchina fotografica posizionare manualmente fino a quando il fondo è in pieno centro, e prendere una immagine </li><li> Regolare l&#39;impostazione sul pannello di controllo per &quot;IR-OCT&quot;, che utilizza spettrale dominio tomografia a coerenza ottica (SD-OCT), in combinato disposto con l&#39;imaging a infrarossi per valutare la macula per malattia di base. </li><li> Utilizzare le guide presenti nella finestra di imaging per orientare correttamente l&#39;Office per l&#39;immagine IR del fondo. Per ottenere ottimale SD-OCT qualità, posizionare la telecamera in modo tale che l&#39;immagine PTOM nel terzo superiore della finestra di imaging. Acquisire almeno una sc linea orizzontaleuna attraverso la fovea e attraversa l&#39;intero campo di ripresa. </li></ol></li></ol> 3. Impostazione di Qaf Imaging <ol><li> Utilizzare acquisizione di immagini &quot;ad alta velocità&quot;. Nota: Questa impostazione consente per l&#39;acquisizione delle immagini più veloce, che riduce il rischio di perdita del segnale a causa del movimento del paziente e conseguente blocco della luce da parte dell&#39;iride o le palpebre. </li><li> Utilizzare &quot;Mean di 9&quot; frames. Nota: Questa impostazione consente la rapida, cattura sequenziale di 9 fotogrammi di immagini, che possono essere successivamente &quot;media&quot; per ridurre il rumore e artefatti (vedi sotto). </li><li> Utilizzare campo &quot;30 x 30 gradi&quot;. Nota: Questo si riferisce ai gradi di zona della retina catturati durante l&#39;acquisizione dell&#39;immagine. </li><li> Prima di imaging, avvertire paziente circa la luce blu, in quanto questo può essere allarmante in un primo momento. </li><li> Attivare la modalità AF e allineare l&#39;asse della telecamera in modo che lo schermo è al massimo &quot;riempito&quot; con fundus AF (oscuramento minima dei lati e gli angoli dell&#39;immagine). <ol><li> Se i pazienti have difficoltà a tollerare la luce blu brillante, avviare l&#39;imaging con la telecamera più lontano dall&#39;occhio e quindi portare la fotocamera lentamente verso il paziente fino a quando il fondo è in vista. PUNTO CRITICO: Se la luce di entrare in o uscire dall&#39;occhio è ostruito, è diminuito il segnale risulterà. diminuzione localizzata è visibile come oscuramento asimmetrica di un lato un&#39;immagine o un angolo. perdita generalizzata di segnale è visto quando i movimenti degli occhi solo ostruiscono il passaggio della luce. </li></ol></li><li> Allineate la telecamera in modo tale che il segnale AF è al livello più alto in tutto il campo. Obiettivo per il segnale massima anziché immagine più nitida, tuttavia essi più o meno correlati. Regolare la messa a fuoco spostando il cSLO per riposizionare la fotocamera manualmente o con il joystick oftalmoscopio. </li><li> Regolare la sensibilità / guadagno tale da fondo AF è facilmente visibile, ma evitare un eccesso di saturazione. Durante l&#39;acquisizione delle immagini, pixel colorati visibili sia il riferimento interno (situato nella parte superiore dellaimmagine) o fundus indicano sovrasaturazione e quindi perdita di segnale. </li></ol> 4. Acquisizione di immagini Nota: PUNTO CRITICO: L&#39;obiettivo in acquisizione delle immagini deve essere quello di ottenere 2 qualità 9-cornice dell&#39;immagine pile alte per sessione per controllare la variabilità tra le immagini all&#39;interno di una sessione. Dopo il riposizionamento del paziente e la macchina fotografica, di ottenere una seconda sessione di due immagini per valutare e controllo per la variabilità. Tutte le immagini saranno in ultima analisi, essere calibrati per il riferimento interno (descritto di seguito). <ol><li> Acquisire immagini solo dopo almeno 20 secondi di &quot;sbianca&quot; (piena esposizione della retina alla luce AF) per ridurre al minimo l&#39;assorbimento della luce da parte rodopsina nella retina sensitiva 9. <ol><li> Utilizzare questo periodo per ottimizzare l&#39;allineamento della fotocamera, messa a fuoco e sensibilità. </li></ol></li><li> Avere i soggetti lampeggiare prima di ogni acquisizione di immagini come un film lacrimale fresca migliora la qualità del segnale. </li><li> Evitare le palpebre nel piano di acquisizione. Nota: Può essere utile manualmente le palpebre aperte per i pazienti più impegnativi. Gli autori raccomandano che un assistente svolge questo compito. </li><li> Ottimizzare l&#39;allineamento prima di ogni acquisizione delle immagini per assicurare che la luce non sia ostruita da l&#39;iride con conseguente diminuzione del segnale. Nota: Come almeno minore movimento è molto comune, gli autori raccomandano bene riallineamento, se necessario, prima di ogni acquisizione delle immagini. Guidare e incoraggiare il paziente, mentre l&#39;imaging aiuta il movimento diminuzione. Gli autori raccomandano anche tramite pedale della macchina come il &quot;tasto di acquisizione&quot; in modo da ridurre al minimo dell&#39;operatore distrazione. </li><li> Eseguire l&#39;elaborazione post-immagine calcolando il &quot;medio&quot; della pila 9-frame per aumentare il rapporto segnale-rumore. Calcolare la media di una pila usando il software cSLO selezionando l&#39;opzione per calcolare la media. Nota: Ci possono essere pile in cui alcuni fotogrammi non sono di qualità ottimale (cioè, hanno localizzata o generalizzata diminuzione SIsegnal rispetto ai telai ottimali), quindi ispezionare accuratamente ogni pila e deselezionare telai subottimali prima calcolo della media. Nota: le immagini medie con rapporti accettabili segnale-rumore possono essere trattati da almeno 3 fotogrammi. E &#39;normale per i lati e gli angoli di ogni immagine di avere segnale inferiori ai 20 gradi centrali a causa di limitazioni all&#39;interno del cSLO stesso. <ol><li> Se il software chiede se l&#39;operatore vorrebbe normalizzare i livelli di grigio (vale a dire, allungare l&#39;istogramma) tra 0 e 255, selezionare &quot;No&quot;. Questo mantiene inalterati livelli di grigio per l&#39;analisi. </li></ol></li></ol> Analisi 5. Immagine <ol><li> Analizzare le immagini AF come descritto in precedenza utilizzando il software di analisi delle immagini sviluppato per la tecnica QAF (IGOR; 9). Una breve descrizione di una tipica analisi delle immagini utilizzando questo software è riportato qui di seguito. <ol><li> Caricare il programma Qaf in IGOR e importare le immagini (in formato .bmp) esportati dallasoftware cSLO con proporzioni pixel 768 x 768 (parametro di uscita di default). </li><li> Selezionare l&#39;immagine nel menu a discesa e di avviare l&#39;analisi. </li><li> Riposizionare indicatori di calibrazione sull&#39;immagine in modo tale che il &quot;mirino&quot; si sovrappongono fovea e della &quot;staffa&quot; confina con la disco ottico (questi indicatori sono utilizzati per scalare e posizionare i ROI). Una volta posizionato correttamente, il software utilizzare i prompt quindi popolare l&#39;immagine con ROI circolari che circondano la fovea (vedi figure 1, 2). </li><li> Selezionare l&#39;opzione in IGOR per calibrare i livelli di grigio complessivi di ciascuna immagine a quei livelli presenti nel riferimento fluorescente interna. Nota: Questa fase consente di calibrare fattori correlati alla macchina, compreso il livello elettronico zero ogni immagine e il fattore di calibrazione di riferimento interno di ogni macchina, così come i fattori correlati al paziente, quali l&#39;età, rifrazione e curvatura corneale. Nota: Il software di analisi mostra poi il r fissoegioni sull&#39;immagine risultante e un valore di Qaf è dimostrata all&#39;interno di ogni regione. I valori Qaf vengono anche inseriti automaticamente in un formato foglio di calcolo in una finestra separata. &quot; </li><li> Generate &quot;mappe di calore&quot; Qaf selezionando l&#39;opzione entro i prompt dei comandi. Tutte le immagini e dati possono essere esportati dal software IGOR in un foglio di calcolo Excel selezionando le opzioni appropriate. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Strauss, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinal+pigment+epithelium+in+visual+function.">The retinal pigment epithelium in visual function.</a> Physiological reviews. 85, 845-881 (2005).</li><li>Ach, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+autofluorescence+and+cell+density+maps+of+the+human+retinal+pigment+epithelium.">Quantitative autofluorescence and cell density maps of the human retinal pigment epithelium.</a> Investigative ophthalmology &amp; visual science. 55, 4832-4841 (2014).</li><li>Ach, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipofuscin+redistribution+and+loss+accompanied+by+cytoskeletal+stress+in+retinal+pigment+epithelium+of+eyes+with+age-related+macular+degeneration.">Lipofuscin redistribution and loss accompanied by cytoskeletal stress in retinal pigment epithelium of eyes with age-related macular degeneration.</a> Investigative ophthalmology &amp; visual science. 56, 3242-3252 (2015).</li><li>Schmitz-Valckenberg, S., Jorzik, J., Unnebrink, K., Holz, F. G., Group, F. A. M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+digital+scanning+laser+ophthalmoscopy+fundus+autofluorescence+images+of+geographic+atrophy+in+advanced+age-related+macular+degeneration.">Analysis of digital scanning laser ophthalmoscopy fundus autofluorescence images of geographic atrophy in advanced age-related macular degeneration.</a> Graefe's archive for clinical and experimental ophthalmology = Albrecht von Graefes Archiv fur klinische und experimentelle Ophthalmologie. 240, 73-78 (2002).</li><li>Weng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+function+of+Rim+protein+in+photoreceptors+and+etiology+of+Stargardt's+disease+from+the+phenotype+in+abcr+knockout+mice.">Insights into the function of Rim protein in photoreceptors and etiology of Stargardt's disease from the phenotype in abcr knockout mice.</a> Cell. 98, 13-23 (1999).</li><li>Holz, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+lysosomal+degradative+functions+in+RPE+cells+by+a+retinoid+component+of+lipofuscin.">Inhibition of lysosomal degradative functions in RPE cells by a retinoid component of lipofuscin.</a> Investigative ophthalmology &amp; visual science. 40, 737-743 (1999).</li><li>Sparrow, J. R., Nakanishi, K., Parish, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lipofuscin+fluorophore+A2E+mediates+blue+light-induced+damage+to+retinal+pigmented+epithelial+cells.">The lipofuscin fluorophore A2E mediates blue light-induced damage to retinal pigmented epithelial cells.</a> Investigative ophthalmology &amp; visual science. 41, 1981-1989 (2000).</li><li>Smith, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipofuscin+and+autofluorescence+metrics+in+progressive+STGD.">Lipofuscin and autofluorescence metrics in progressive STGD.</a> Investigative ophthalmology &amp; visual science. 50, 3907-3914 (2009).</li><li>Delori, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+measurements+of+autofluorescence+with+the+scanning+laser+ophthalmoscope.">Quantitative measurements of autofluorescence with the scanning laser ophthalmoscope.</a> Investigative ophthalmology &amp; visual science. 52, 9379-9390 (2011).</li><li>Burke, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+fundus+autofluorescence+in+recessive+Stargardt+disease.">Quantitative fundus autofluorescence in recessive Stargardt disease.</a> Investigative ophthalmology &amp; visual science. 55, 2841-2852 (2014).</li><li>Duncker, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+fundus+autofluorescence+and+optical+coherence+tomography+in+best+vitelliform+macular+dystrophy.">Quantitative fundus autofluorescence and optical coherence tomography in best vitelliform macular dystrophy.</a> Investigative ophthalmology &amp; visual science. 55, 1471-1482 (2014).</li><li>Duncker, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+fundus+autofluorescence+distinguishes+ABCA4-associated+and+non-ABCA4-associated+bull's-eye+maculopathy.">Quantitative fundus autofluorescence distinguishes ABCA4-associated and non-ABCA4-associated bull's-eye maculopathy.</a> Ophthalmology. 122, 345-355 (2015).</li><li>Greenberg, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+fundus+autofluorescence+in+healthy+eyes.">Quantitative fundus autofluorescence in healthy eyes.</a> Investigative ophthalmology &amp; visual science. 54, 5684-5693 (2013).</li><li>Delori, F. C., Goger, D. G., Dorey, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+accumulation+and+spatial+distribution+of+lipofuscin+in+RPE+of+normal+subjects.">Age-related accumulation and spatial distribution of lipofuscin in RPE of normal subjects.</a> Investigative ophthalmology &amp; visual science. 42, 1855-1866 (2001).</li><li>Sparrow, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+fundus+autofluorescence+in+mice:+correlation+with+HPLC+quantitation+of+RPE+lipofuscin+and+measurement+of+retina+outer+nuclear+layer+thickness.">Quantitative fundus autofluorescence in mice: correlation with HPLC quantitation of RPE lipofuscin and measurement of retina outer nuclear layer thickness.</a> Investigative ophthalmology &amp; visual science. 54, 2812-2820 (2013).</li><li>Delori, F. C., Webb, R. H., Sliney, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maximum+permissible+exposures+for+ocular+safety+(ANSI+2000),+with+emphasis+on+ophthalmic+devices.">Maximum permissible exposures for ocular safety (ANSI 2000), with emphasis on ophthalmic devices.</a> Journal of the Optical Society of America. A, Optics, image science, and vision. 24, 1250-1265 (2007).</li></ol>

STA: no disclosures, JPG: no disclosures, RTS: consultant, Ocata Therapeutics.

Anormale distribuzione lipofuscina RPE, sia aumentato o diminuito, è un marcatore sensibile della malattia retinica ed è generalmente associata a perdita di funzione retina sensitiva. Qui, descriviamo l&#39;applicazione di Qaf per la valutazione dei RPE lipofuscina. Costituzione di un riferimento fluorescente interna per correggere per la variabile potenza del laser e rilevatore di sensibilità 9 a fianco della nostra tecnica di imaging standardizzata consente una quantificazione affidabile dei livelli di A...

L&#39;epitelio pigmentato retinico (RPE) supporta la funzione della retina sensoriale attraverso numerosi processi 1. Età degenerazione maculare (AMD) è la causa più importante di cecità incurabile nei paesi industrializzati ed è caratterizzata da cambiamenti nella RPE, tra cui la perdita di pigmento, perdita della funzione e atrofia. In AMD ed in normale invecchiamento, l&#39;RPE accumula fluorescenti, organelli lisosomi-derivati ​​contenenti frammenti di fotorecettori fagocitati, di cui come granuli di lipofuscina. L&#39;accumulo di RPE lipofuscina è stato pensato per indicare ossidativo disfunzioni 1, ma recenti studi hanno dimostrato che la morfologia RPE rimane normale negli occhi età con elevati livelli di lipofuscina 2. Marcatori Tuttavia, i modelli anormali di distribuzione lipofuscina, in particolare la perdita di lipofuscina, sono documentate per la progressione di AMD e AMD, sia istologicamente e clinicamente 3,4 proces difettosicantare di RPE lipofuscina è stato dimostrato anche che si verifichi in certe degenerazioni retiniche ereditarie. I pazienti affetti da malattia di Stargardt (STGD) si accumulano lipofuscina nel RPE in giovane età, alla fine lo sviluppo di perdita della vista simile a quello visto in AMD 5. Questi risultati hanno suggerito che l&#39;accumulo di lipofuscina stessa può essere tossico e guidare RPE disfunzioni 6,7. Tuttavia, uno studio di imaging dettagliata di soggetti con STGD nel corso del tempo non ha confermato che l&#39;accumulo di lipofuscina focale ha portato alla conseguente perdita RPE 8. Quindi, anche se le anomalie lipofuscina sono marcatori per degenerazioni retiniche, un ruolo per tossicità diretta di lipofuscina ancora da dimostrare. La RPE è la più strato di cellule posteriore della retina, ma genera la maggior parte del segnale fluorescente dal fondo oculare. Generazione e rilevamento di autofluorescenza (AF) derivato dal RPE possono essere eseguite utilizzando ophthalmoscopy scansione laser confocale (cSLO), che consente visualization della distribuzione spaziale di AF fondo. Alcune degenerazioni retiniche mostrano modelli distintivi del fondo oculare AF, e aiuti di imaging AF nella diagnosi e nel monitoraggio di queste condizioni. Sebbene l&#39;imaging standard di AF è clinicamente importante, AF quantitativa (Qaf) è diventato un importante mezzo per valutare la salute RPE. Noi e altri hanno sviluppato un approccio standardizzato che può determinare in modo affidabile i livelli di Qaf a specifiche posizioni della retina 9. Qaf ha potenziali applicazioni nella diagnosi e nel monitoraggio delle condizioni della retina, e può anche avere utilità nella prognosi e stratificazione del rischio. Inoltre, la capacità diagnostica di Qaf sono anche stati descritti per certi disturbi della retina 10-12. Qui, forniamo dettagli graduale per eseguire la nostra tecnica accompagnata da una dimostrazione visiva della sua applicazione nella valutazione di occhi sani e malati.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="671">
	<tbody>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:243px;">Spectralis HRA + OCT</td>
			<td style="width:143px;">Heidelberg Engineering</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">0.5% tropicamide ophthalmic solution</td>
			<td style="width:143px;">n/a</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">2.5% phenylephrine ophthalmic solution</td>
			<td style="width:143px;">n/a</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:243px;">Internal fluorescent reference</td>
			<td style="width:143px;">Heidelberg Engineering</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">IGOR Pro software</td>
			<td style="width:143px;">WaveMetrics</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative fundus autofluorescence for the evaluation of retinal diseases

The retinal pigment epithelium (RPE) is juxtaposed to the overlying sensory retina, and supports the function of the visual system. Among the tasks performed by the RPE are phagocytosis and processing of outer photoreceptor segments through lysosome-derived organelles. These degradation products, stored and referred to as lipofuscin granules, are composed partially of bisretinoids, which have broad fluorescence absorption and emission spectra that can be detected clinically as fundus autofluorescence with confocal scanning laser ophthalmoscopy (cSLO). Lipofuscin accumulation is associated with increasing age, but is also found in various patterns in both acquired and inherited degenerative diseases of the retina. Thus, studying its pattern of accumulation and correlating such patterns with changes in the overlying sensory retina are essential to understanding the pathophysiology and progression of retinal disease. Here, we describe a technique employed by our lab and others that uses cSLO in order to quantify the level of RPE lipofuscin in both healthy and diseased eyes.

Questa tecnica è stata utilizzata per studiare QaF in entrambi i sani e 13 di malattia stati 10-12. In occhi sani (Figura 1), AF emessa dal RPE è distribuito in modo relativamente uniforme in tutto il fondo (Figura 1A). intensità ridotta è visto nella regione maculare centrale dovuto al blocco della luce da pigmento maculare, e ai lati ed angoli dell&#39;immagine dovuto l&#39;ottica dell&#39;occhio e fotocamera. Vasi appaiono sc...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Fundus Autofluorescence for the Evaluation of Retinal Diseases at JoVE.com

Quantitative Fundus Autofluorescence for the Evaluation of Retinal Diseases

Quantitative Fundus autofluorescenza per la valutazione delle patologie retiniche

The retinal pigment epithelium (RPE) supports the sensory retina through recycling visual cycle byproducts, which accumulate as lipofuscin. These products are autofluorescent and can be qualitatively imaged in vivo. Here, we describe a method to quantitatively image RPE lipofuscin using confocal scanning laser ophthalmoscopy.

The retinal pigment epithelium (RPE) is juxtaposed to the overlying sensory retina, and supports the function of the visual system. Among the tasks ...

quantitative-fundus-autofluorescence-for-evaluation-retinal

Research

JoVE Journal

Medicine

11.3K Views.  NYU School of Medicine. The retinal pigment epithelium (RPE) supports the sensory retina through recycling visual cycle byproducts, which accumulate as lipofuscin. These products are autofluorescent and can be qualitatively imaged in vivo. Here, we describe a method to quantitatively image RPE lipofuscin using confocal scanning laser ophthalmoscopy. 

Video: Quantitative Fundus Autofluorescence for the Evaluation of Retinal Diseases

The Use of Primary Human Fibroblasts for Monitoring Mitochondrial Phenotypes in the Field of Parkinson's Disease

Parkinson's disease (PD) is the second most common movement disorder and affects 1% of people over the age of 60 1. Because ageing is the most important risk factor, cases of PD will increase during the next decades 2. Next to pathological protein folding and impaired protein degradation pathways, alterations of mitochondrial function and morphology were pointed out as further hallmark of neurodegeneration in PD 3-11.
After years of research in murine and human cancer cells as in vitro models to dissect molecular pathways of Parkinsonism, the use of human fibroblasts from patients and appropriate controls as ex vivo models has become a valuable research tool, if potential caveats are considered. Other than immortalized, rather artificial cell models, primary fibroblasts from patients carrying disease-associated mutations apparently reflect important pathological features of the human disease.
Here we delineate the procedure of taking skin biopsies, culturing human fibroblasts and using detailed protocols for essential microscopic techniques to define mitochondrial phenotypes. These were used to investigate different features associated with PD that are relevant to mitochondrial function and dynamics. Ex vivo, mitochondria can be analyzed in terms of their function, morphology, colocalization with lysosomes (the organelles degrading dysfunctional mitochondria) and degradation via the lysosomal pathway. These phenotypes are highly relevant for the identification of early signs of PD and may precede clinical motor symptoms in human disease-gene carriers. Hence, the assays presented here can be utilized as valuable tools to identify pathological features of neurodegeneration and help to define new therapeutic strategies in PD.

Fibroblasts from patients carrying mutations in Parkinson's disease-causing genes represent an easily accessible ex vivo model to study disease-associated phenotypes. Live cell imaging gives the opportunity to study morphological and functional parameters in living cells. Here we describe the preparation of human fibroblasts and subsequent monitoring of mitochondrial phenotypes.

L&#39;uso di fibroblasti umani primari per il monitoraggio fenotipi mitocondriali nel campo della malattia di Parkinson

Parkinson's disease (PD) is the second most  common movement disorder and affects 1% of people over the age of 60 1. Because ageing is  the most important ...

Ricerca

Medicina

Techniques for Processing Eyes Implanted with a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis: Part 2 Epiretinal Implants with Retinal Tacks

Retinal prostheses for the treatment of certain forms of blindness are gaining traction in clinical trials around the world with commercial devices currently entering the market. In order to evaluate the safety of these devices, in preclinical studies, reliable techniques are needed. However, the hard metal components utilised in some retinal implants are not compatible with traditional histological processes, particularly in consideration for the delicate nature of the surrounding tissue. Here we describe techniques for assessing the health of the eye directly adjacent to a retinal implant secured epiretinally with a metal tack.
Retinal prostheses feature electrode arrays in contact with eye tissue. The most commonly used location for implantation is the epiretinal location (posterior chamber of the eye), where the implant is secured to the retina with a metal tack that penetrates all the layers of the eye. Previous methods have not been able to assess the proximal ocular tissue with the tack in situ, due to the inability of traditional histological techniques to cut metal objects. Consequently, it has been difficult to assess localized damage, if present, caused by tack insertion.
Therefore, we developed a technique for visualizing the tissue around a retinal tack and implant. We have modified an established technique, used for processing and visualizing hard bony tissue around a cochlear implant, for the soft delicate tissues of the eye. We orientated and embedded the fixed eye tissue, including the implant and retinal tack, in epoxy resin, to stabilise and protect the structure of the sample. Embedded samples were then ground, polished, stained, and imaged under various magnifications at incremental depths through the sample. This technique allowed the reliable assessment of eye tissue integrity and cytoarchitecture adjacent to the metal tack.

Here we describe histological techniques for visualising ocular tissue directly adjacent to a metal epiretinal tack and retinal prosthesis.

Tecniche di lavorazione occhi impiantati con una retina Protesi per Localized istopatologico Analysis: Part 2 epiretinica impianti con retina aderenze

Retinal prostheses for the treatment of certain forms of blindness are gaining traction in clinical trials around the world with commercial devices ...

Automated Radiochemical Synthesis of [18F]3F4AP: A Novel PET Tracer for Imaging Demyelinating Diseases

3-[18F]fluoro-4-aminopyridine, [18F]3F4AP, is a radiofluorinated analog of the FDA-approved drug for multiple sclerosis 4-aminopyridine (4AP). This compound is currently under investigation as a PET tracer for demyelination. We recently described a novel chemical reaction to produce metafluorinated pyridines consisting of direct fluorination of a pyridine N-oxide and the utilization of this reaction for the radiochemical synthesis of [18F]3F4AP. In this article, we demonstrate how to produce this tracer using an automated synthesizer and an in-house made flow hydrogenation reactor. We also show the standard quality control procedures performed before releasing the radiotracer for preclinical animal imaging studies. This semi-automated procedure may serve as the basis for future production of [18F]3F4AP for clinical studies.

Automated Radiochemical Synthesis of [18F]3F4AP: A Novel PET Tracer for Imaging Demyelinating Diseases

We demonstrate the semi-automated radiochemical synthesis of [18F]3F4AP and quality control procedures.

Sintesi radiochimica automatizzata di [<sup&gt; 18</sup&gt; F] 3F4AP: un nuovo tracciante PET per le malattie Demyelinating di imaging

3-[18F]fluoro-4-aminopyridine, [18F]3F4AP, is a radiofluorinated analog of the FDA-approved drug for multiple sclerosis 4-aminopyridine (4AP). This ...

Smartphone Fundus Photography

Smartphone fundus photography is a simple technique to obtain ocular fundus pictures using a smartphone camera and a conventional handheld indirect ophthalmoscopy lens. This technique is indispensable when picture documentation of optic nerve, retina, and retinal vessels is necessary but a fundus camera is not available. The main advantage of this technique is the widespread&#160;availability of smartphones that allows documentation of macula and optic nerve changes in many settings that was not previously possible. Following the well-defined steps detailed here, such as proper alignment of the phone camera, handheld lens, and the patient&#39;s pupil, is the key for obtaining a clear retina picture with no interfering light reflections and aberrations. In this paper, the optical principles of indirect ophthalmoscopy and fundus photography will be reviewed first. Then, the step-by-step method to record a good quality retinal image using a smartphone will be explained.

Fundus photography normally requires specialized fundus cameras that are not always available in all clinical settings.&#160;Here, a simple method to record ocular fundus images using a smartphone camera and a conventional high-plus handheld indirect ophthalmoscopy lens is described.

Smartphone Fundus Fotografia

Smartphone fundus photography is a simple technique to obtain ocular fundus pictures using a smartphone camera and a conventional handheld indirect ...

Using Retinal Imaging to Study Dementia

The retina offers a unique &#8220;window&#8221; to study pathophysiological processes of dementia in the brain, as it is an extension of the central nervous system (CNS) and shares prominent similarities with the brain in terms of embryological origin, anatomical features and physiological properties.&#160; The vascular and neuronal structure in the retina can now be visualized easily and non-invasively using retinal imaging techniques, including fundus photography and optical coherence tomography (OCT), and quantified semi-automatically using computer-assisted analysis programs. Studying the associations between vascular and neuronal changes in the retina and dementia could improve our understanding of dementia and, potentially, aid in diagnosis and risk assessment.&#160; This protocol aims to describe a method of quantifying and analyzing retinal vasculature and neuronal structure, which are potentially associated with dementia. This protocol also provides examples of retinal changes in subjects with dementia, and discusses technical issues and current limitations of retinal imaging.

The retina shares prominent similarities with the brain and thus represents a unique window to study vasculature and neuronal structure in the brain non-invasively. This protocol describes a method to study dementia using retinal imaging techniques. This method can potentially aid in diagnosis and risk assessment of dementia.

Usando la formazione immagine retinica per studiare la demenza

The retina offers a unique &#8220;window&#8221; to study pathophysiological processes of dementia in the brain, as it is an extension of the central ...

Invasive Hemodynamic Assessment for the Right Ventricular System and Hypoxia-Induced Pulmonary Arterial Hypertension in Mice

Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a chronic and severe cardiopulmonary disorder. Mice are a popular animal model used to mimic this disease. However, the evaluation of right ventricular pressure (RVP) and pulmonary artery pressure (PAP) remains technically challenging in mice. RVP and PAP are more difficult to measure than left ventricular pressure because of the anatomical differences between the left and right heart systems. In this paper, we describe a stable right heart hemodynamic measurement method and its validation using healthy and PAH mice. This method is based on open-chest surgery and mechanical ventilation support. It is a complicated procedure compared to closed chest procedures. While a well-trained surgeon is required for this surgery, the advantage of this procedure is that it can generate both RVP and PAP parameters at the same time, so it is a preferable procedure for the evaluation of PAH models.

Here, we present a protocol to perform an invasive hemodynamic assessment of the right ventricle and pulmonary artery in mice using an open-chest surgery approach.

Valutazione emodinamica invasiva per il sistema ventricolare destro e l'ipertensione arteriosa polmonare indotta dall'ipossia nei topi

Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a chronic and severe cardiopulmonary disorder. Mice are a popular animal model used to mimic this disease. ...

Oxygen-Induced Retinopathy Model for Ischemic Retinal Diseases in Rodents

One of the commonly used models for ischemic retinopathies is the oxygen-induced retinopathy (OIR) model. Here we describe detailed protocols for the OIR model induction and its readouts in both mice and rats. Retinal neovascularization is induced in OIR by exposing rodent pups either to hyperoxia (mice) or alternating levels of hyperoxia and hypoxia (rats). The primary readouts of these models are the size of neovascular (NV) and avascular (AVA) areas in the retina. This preclinical in vivo model can be used to evaluate the efficacy of potential anti-angiogenic drugs or to address the role of specific genes in the retinal angiogenesis by using genetically manipulated animals. The model has some strain and vendor specific variation in the OIR induction which should be taken into consideration when designing the experiments.

Oxygen-induced retinopathy (OIR) can be used to model ischemic retinal diseases such as retinopathy of prematurity and proliferative diabetic retinopathy and to serve as a model for proof-of-concept studies in evaluating antiangiogenic drugs for neovascular diseases. OIR induces robust and reproducible neovascularization in the retina that can be quantified.

Modello di retinopatia indotta dall'ossigeno per le malattie retiniche ischemiche nei roditori

One of the commonly used models for ischemic retinopathies is the oxygen-induced retinopathy (OIR) model. Here we describe detailed protocols for the OIR ...

Retinal Pigment Epithelium Transplantation in a Non-human Primate Model for Degenerative Retinal Diseases

Retinal pigment epithelial (RPE) transplantation holds great promise for the treatment of inherited and acquired retinal degenerative diseases. These conditions include retinitis pigmentosa (RP) and advanced forms of age-related macular degeneration (AMD), such as geographic atrophy (GA). Together, these disorders represent a significant proportion of currently untreatable blindness globally. These unmet medical needs have generated heightened academic interest in developing methods of RPE replacement. Among the animal models commonly utilized for preclinical testing of therapeutics, the non-human primate (NHP) is the only animal model that has a macula. As it shares this anatomical similarity with the human eye, the NHP eye is an important and appropriate preclinical animal model for the development of advanced therapy medicinal products (ATMPs) such as RPE cell therapy.
This manuscript describes a method for the submacular transplantation of an RPE monolayer, cultured on a polyethylene terephthalate (PET) cell carrier, underneath the macula onto a surgically created RPE wound in immunosuppressed NHPs. The fovea-the central avascular portion of the macula-is the site of the greatest mechanical weakness during the transplantation. Foveal trauma will occur if the initial subretinal fluid injection generates an excessive force on the retina. Hence, slow injection under perfluorocarbon liquid (PFCL) vitreous tamponade is recommended with a dual-bore subretinal injection cannula at low intraocular pressure (IOP) settings to create a retinal bleb. 
Pretreatment with an intravitreal plasminogen injection to release parafoveal RPE-photoreceptor adhesions is also advised. These combined strategies can reduce the likelihood of foveal tears when compared to conventional techniques. The NHP is a key animal model in the preclinical phase of RPE cell therapy development. This protocol addresses the technical challenges associated with the delivery of RPE cellular therapy in the NHP eye.

The non-human primate (NHP) is an ideal model for studying human retinal cellular therapeutics due to the anatomical and genetic similarities. This manuscript describes a method for submacular transplantation of retinal pigment epithelial cells in the NHP eye and strategies to prevent intraoperative complications associated with macular manipulation.

Trapianto di epitelio pigmentato retinico in un modello di primati non umani per malattie degenerative della retina

Retinal pigment epithelial (RPE) transplantation holds great promise for the treatment of inherited and acquired retinal degenerative diseases. These ...

Retinal Pathophysiological Evaluation in a Rat Model

A posterior segment eye disease like diabetic retinopathy alters the physiology of the retina. Diabetic retinopathy is characterized by a retinal detachment, breakdown of the blood-retinal barrier (BRB), and retinal angiogenesis. An in vivo rat model is a valuable experimental tool to examine the changes in the structure and function of the retina. We propose three different experimental techniques in the rat model to identify morphological changes of retinal cells, retinal vasculature, and compromised BRB. Retinal histology is used to study the morphology of various retinal cells. Also, quantitative measurement is performed by retinal cell count and thickness measurement of different retinal layers. A BRB breakdown assay is used to determine the leakage of extraocular proteins from the plasma to vitreous tissue due to the breakdown of BRB. Fluorescence angiography is used to study angiogenesis and leakage of blood vessels by visualizing retinal vasculature using FITC-dextran dye.

Diabetic retinopathy is one of the leading causes of blindness. Histology, blood-retinal barrier breakdown assay, and fluorescence angiography are valuable techniques to understand the pathophysiology of the retina, which could further enhance the efficient drug screening against diabetic retinopathy.

Valutazione fisiopatologica retinica in un modello di ratto

A posterior segment eye disease like diabetic retinopathy alters the physiology of the retina. Diabetic retinopathy is characterized by a retinal ...

Repetitive Blood Sampling from the Subclavian Vein of Conscious Rat

Rats are widely used in pharmacokinetics (PK) and toxicokinetic (TK) studies that need to collect a certain amount of blood at specific time points to detect drug exposure. The rat blood sampling method determines the quality of the plasma and further affects the precision of the test results. The subclavian vein blood collection method described in this protocol collects blood samples repeatedly in the conscious state of animals to meet the needs of PK and TK tests. The skills of restraint handling and appropriate procedure of needle incision ensure the success rate of blood collection. It is easy to operate while ensuring the quality of plasma and at the same time catering to animal welfare. However, this method requires skilled operation, and an improper one may cause animal weakness, pain, lameness, and even mortality. The current method has been used in the testing facility for a 4-week oral toxicity study in Sprague Dawley (SD) rats with TK. The maximum amount of blood collected within 24 h did not exceed 20% of the animal's total blood. The animals' body weight was more than 200 g for males and females. The data showed that the animals' bodyweight increased steadily every week, and the clinical observation was normal after repetitive sample collection.

The present protocol describes a simple and efficient method for collecting blood from the subclavian vein in rats. It enables rapid, timely, and easily identifiable sampling without anesthesia and obtains high-quality blood through repetitive sample collection.

Campionamento ripetitivo di sangue dalla vena succlavia del ratto cosciente

Rats are widely used in pharmacokinetics (PK) and toxicokinetic (TK) studies that need to collect a certain amount of blood at specific time points to ...