私たちは、協力者、フランソワDelori、トーマス・バーク、およびトビアスドゥンカーに感謝したいと思います。 研究サポート： NIH / NEI R01 EY015520（RTS、JPG）、および失明（RTB）を防止するための研究から無制限の資金。

倫理文：これらの研究に登録したすべての患者は、医学のニューヨーク大学ロースクールで承認された施設内倫理委員会の監督に基づいて行ってました。 1.患者の選択およびイメージングのための初期の準備スペクトルドメイン光コヒーレンストモグラフィー（SD-OCT）を搭載した0.5％トロピカミド点眼液、2.5％フェニレフリン点眼液、cSLO、および内部蛍光基準：以下の材料が必要とされています注意してください。 <ol><li>撮影の前には、適切に製造元の指示に従って、データ取得のためcSLOを設定します。 </li><li> cSLO内部蛍光基準をマウントします。注：内部蛍光基準、製造業者から購入し、金属リング内に収容されており、カメラのレンズの後方に直接配置されます。他の製造業者からcSLOが使用される場合、に記載されているものとは異なる構成が存在してもよいですこのプロトコル。 <ol><li> cSLOへの参照を挿入するためには、それを削除し、マシンの金属リングを外し、および参照を含む新しい金属リングでそれを置き換えるために、レンズをねじります。 注：それはレーザーパワーの変動や検出器の感度/ゲインを補正することができるように内部蛍光基準は、QAF技術に不可欠です。 </li></ol></li><li>イメージングのために募集の患者は、日常拡張目の検査を受け、過去の眼の歴史や眼の所見と現れ得る基礎疾患に関する背景情報を取得しています。 </li><li> 0.5％のトロピカミド及び2.5％フェニレフリンと瞳孔を拡張します。重要なステップ：少なくとも6ミリメートルに生徒を膨らませます。注：これは、光の中断のない通過のため、ひいては眼底の最適な可視化および測定のために不可欠です。 </li><li>撮影の前に、あごがchinrestで休んで、cSLO上で適切に患者を配置し、額はforeheaに対して配置しましたdは残り、かつ適切な指標と整合横眼角。 </li></ol>眼底の2ベースラインイメージング<ol><li>まず、黄斑の上にカメラを一元化し、ラフなフォーカスを得るために、近赤外線の反射率（IR）光（820nmの波長）で画像眼底を。 <ol><li>患者が適切に配置して、眼底がフルフォーカスになるまで手で、赤外線撮像モードにコントロールパネル上の位置にカメラをハードウェアの設定を切り替えると、画像を撮ります</li><li> 「IR-OCT」、基礎疾患のための黄斑を評価するために、IRイメージングと併せて、スペクトルドメイン光コヒーレンストモグラフィー（SD-OCT）を使用するには、コントロールパネルの設定を調整します。 </li><li>正しく眼底のIR画像に10月を配向する撮像窓に存在するガイドを使用してください。最適なSD-OCT品質を達成するために、OCT画像が​​撮像窓の上部三分の一になるようにカメラを配置。少なくとも1水平ラインSCを取得中心窩を通る全体イメージング分野にまたがります。 </li></ol></li></ol> 3. QAFイメージングを設定します<ol><li> 「高速」の画像取得を使用してください。注意：この設定が原因患者の動きに信号損失のリスクを減少させ、虹彩や眼瞼による光の遮断を結果としてより高速な画像取得を可能にします。 </li><li>フレーム「9の平均」を使用します。注：この設定は、続いて（下記参照）、ノイズやアーチファクトを低減するために、「平均化」することができます9画像フレームの急速な、シーケンシャル取り込みを可能にします。 </li><li> 「30×30度」フィールドを使用します。注：これは、画像取得中に取り込まれた網膜領域の程度を指します。 </li><li>これが最初で警報することができるように、撮像に先立って、青色光について患者に警告します。 </li><li> AFモードをオンにすると、画面が最大限眼底AF（画像の辺や角の最小限の黒ずみ）で「満たされる」ようなカメラ軸を揃えます。 <ol><li>患者Hの場合明るい青色光を許容aveの難しさは、さらに眼から離れたカメラで撮影を開始し、眼底が丸見えになるまで、患者に向かってゆっくりとカメラを持参します。 重要なステップ：光が遮られているに入るか、目から出た場合は、信号が発生します減少しました。ローカライズされた減少は、像側または角の非対称の黒ずみとして表示されます。目の動きだけでは、光の通路を妨げたときに、信号の一般損失が見られます。 </li></ol></li><li> AF信号がフィールド全体にその最高レベルになるように、カメラの位置を合わせます。しかし、彼らはおおよそ相関し、最大シグナルよりもむしろ最も鮮明な画像を目指します。手動または検眼鏡のジョイスティックでカメラを再配置するcSLOを移動させることで、カメラのフォーカスを調整します。 </li><li>眼底AFが簡単に見えるように感度/ゲインを調整しますが、過飽和を避けます。画像取得時には、内部基準のいずれかで目に見える色の画素は、（の上部にあります画像）や眼底は、信号の飽和オーバー、したがって損失を示しています。 </li></ol> 4.画像取得注意：重​​要なステップを：画像取得における目標は、セッション内の画像間の変動を制御するために、セッションごとに2、高品質の9フレームの画像スタックを取得するためにすべきです。患者とカメラを再配置した後、評価し、変動を制御するために、2つの画像の第二セッションを取得。全ての画像は、最終的には内部基準（後述）に較正されます。 <ol><li>感覚網膜9にロドプシンによる光の吸収を最小限にするためにのみ「漂白」（AF光に対する網膜の完全露出）の少なくとも20秒後に画像を取得します。 <ol><li>カメラのアライメント、フォーカスと感度を最適化するために、この期間を使用します。 </li></ol></li><li>新鮮な涙液膜は、信号品質を向上させるように、各画像取得の前に点滅科目を持っています。 </li><li>買収の面でまぶたを避けてください。 注：これは、より困難な患者のために手動で開くまぶたに役立つかもしれません。著者らは、アシスタントは、このタスクを実行することをお勧めします。 </li><li>その光が減少した信号が得られる虹彩によって妨害されていないことを確認するために、各画像取得の前にアライメントを最適化します。 注：として、少なくともマイナーな動きが非常に一般的であり、著者は各画像取得の前に、必要に応じて細かな再調整をお勧めします。イメージングは​​減少の動きを助けるながら患者を案内し、奨励。オペレータの気晴らしを最小にするように著者はまた、「取得ボタン」として、マシンのフットペダルを使用することをお勧めします。 </li><li>信号対雑音比を増加させるために9フレームスタックの「平均値」を計算することによって、後の画像処理を行います。平均値を計算するためのオプションを選択してcSLOソフトウェアを使用して、スタックの平均を計算します。 注：いくつかのフレームは、最適な品質のものではないスタックがあるかもしれない（ すなわち 、ローカライズや一般SIが低下しています最適なフレームにgnal相対的）、したがって、慎重に各スタックを検査し、平均値の計算の前に、次善のフレームの選択を解除します。 注：許容可能な信号対雑音比の平均画像は、少なくとも3つのフレームから処理することができます。各画像の辺と角がcSLO自体の内部制限のために、中央の20度よりも低い信号を有することは正常です。 <ol><li>ソフトウェアは、オペレータがグレーレベルを正常化したいかどうかを尋ねられた場合は、「いいえ」を選択し、0〜255の間（ すなわち 、ヒストグラムを伸ばします）。これは、分析のための不変のグレーレベルを維持しています。 </li></ol></li></ol> 5.画像解析<ol><li>以前QAF技術のために開発された画像解析ソフトウェアを用いて説明したようにAFの画像を分析（IGORを; 9）。このソフトウェアを使用する典型的な画像解析の簡単な説明は以下に含まれています。 <ol><li> IGORとインポート画像でQAFプログラムをロードします（.bmpの形式で）からエクスポートピクセル縦横比768×768（デフォルトの出力パラメータ）とcSLOソフトウェア。 </li><li>ドロップダウンメニューで画像を選択し、分析を開始します。 </li><li> 「十字線」は、中心窩と「ブラケット」視神経乳頭を（これらの指標は、関心領域を拡張し、配置するために使用されている）に当接し上に重なるように、画像上の校正指標を再配置します。適切に配置すると、利用ソフトウェアは、（ 図1、図2を参照）中心窩の周囲の円周のROIで画像を取り込むように求められます。 </li><li>内部蛍光基準に存在するもののレベルに各画像の全体的なグレーレベルを較正するためにIGORでオプションを選択します。注：このステップは、各画像の電子ゼロレベルと各マシンの内部基準校正係数、ならびに年齢、屈折と角膜曲率を含む患者関連因子、を含む機械関連因子のキャリブレーションを可能にします。 注：解析ソフトウェアは、次に固定Rが表示され結果画像とQAF値にegionsは、各領域内で実証されています。 QAF値も自動的に別のウィンドウでスプレッドシート形式に入力されます。」 </li><li>コマンドプロンプト内でオプションを選択することにより、QAF「ヒートマップ」を生成します。すべての画像およびデータは、適切なオプションを選択することにより、ExcelスプレッドシートにIGORソフトからエクスポートすることができます。 </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Strauss, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinal+pigment+epithelium+in+visual+function.">The retinal pigment epithelium in visual function.</a> Physiological reviews. 85, 845-881 (2005).</li><li>Ach, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+autofluorescence+and+cell+density+maps+of+the+human+retinal+pigment+epithelium.">Quantitative autofluorescence and cell density maps of the human retinal pigment epithelium.</a> Investigative ophthalmology &amp; visual science. 55, 4832-4841 (2014).</li><li>Ach, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipofuscin+redistribution+and+loss+accompanied+by+cytoskeletal+stress+in+retinal+pigment+epithelium+of+eyes+with+age-related+macular+degeneration.">Lipofuscin redistribution and loss accompanied by cytoskeletal stress in retinal pigment epithelium of eyes with age-related macular degeneration.</a> Investigative ophthalmology &amp; visual science. 56, 3242-3252 (2015).</li><li>Schmitz-Valckenberg, S., Jorzik, J., Unnebrink, K., Holz, F. G., Group, F. A. M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+digital+scanning+laser+ophthalmoscopy+fundus+autofluorescence+images+of+geographic+atrophy+in+advanced+age-related+macular+degeneration.">Analysis of digital scanning laser ophthalmoscopy fundus autofluorescence images of geographic atrophy in advanced age-related macular degeneration.</a> Graefe's archive for clinical and experimental ophthalmology = Albrecht von Graefes Archiv fur klinische und experimentelle Ophthalmologie. 240, 73-78 (2002).</li><li>Weng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+function+of+Rim+protein+in+photoreceptors+and+etiology+of+Stargardt's+disease+from+the+phenotype+in+abcr+knockout+mice.">Insights into the function of Rim protein in photoreceptors and etiology of Stargardt's disease from the phenotype in abcr knockout mice.</a> Cell. 98, 13-23 (1999).</li><li>Holz, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+lysosomal+degradative+functions+in+RPE+cells+by+a+retinoid+component+of+lipofuscin.">Inhibition of lysosomal degradative functions in RPE cells by a retinoid component of lipofuscin.</a> Investigative ophthalmology &amp; visual science. 40, 737-743 (1999).</li><li>Sparrow, J. R., Nakanishi, K., Parish, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lipofuscin+fluorophore+A2E+mediates+blue+light-induced+damage+to+retinal+pigmented+epithelial+cells.">The lipofuscin fluorophore A2E mediates blue light-induced damage to retinal pigmented epithelial cells.</a> Investigative ophthalmology &amp; visual science. 41, 1981-1989 (2000).</li><li>Smith, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipofuscin+and+autofluorescence+metrics+in+progressive+STGD.">Lipofuscin and autofluorescence metrics in progressive STGD.</a> Investigative ophthalmology &amp; visual science. 50, 3907-3914 (2009).</li><li>Delori, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+measurements+of+autofluorescence+with+the+scanning+laser+ophthalmoscope.">Quantitative measurements of autofluorescence with the scanning laser ophthalmoscope.</a> Investigative ophthalmology &amp; visual science. 52, 9379-9390 (2011).</li><li>Burke, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+fundus+autofluorescence+in+recessive+Stargardt+disease.">Quantitative fundus autofluorescence in recessive Stargardt disease.</a> Investigative ophthalmology &amp; visual science. 55, 2841-2852 (2014).</li><li>Duncker, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+fundus+autofluorescence+and+optical+coherence+tomography+in+best+vitelliform+macular+dystrophy.">Quantitative fundus autofluorescence and optical coherence tomography in best vitelliform macular dystrophy.</a> Investigative ophthalmology &amp; visual science. 55, 1471-1482 (2014).</li><li>Duncker, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+fundus+autofluorescence+distinguishes+ABCA4-associated+and+non-ABCA4-associated+bull's-eye+maculopathy.">Quantitative fundus autofluorescence distinguishes ABCA4-associated and non-ABCA4-associated bull's-eye maculopathy.</a> Ophthalmology. 122, 345-355 (2015).</li><li>Greenberg, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+fundus+autofluorescence+in+healthy+eyes.">Quantitative fundus autofluorescence in healthy eyes.</a> Investigative ophthalmology &amp; visual science. 54, 5684-5693 (2013).</li><li>Delori, F. C., Goger, D. G., Dorey, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+accumulation+and+spatial+distribution+of+lipofuscin+in+RPE+of+normal+subjects.">Age-related accumulation and spatial distribution of lipofuscin in RPE of normal subjects.</a> Investigative ophthalmology &amp; visual science. 42, 1855-1866 (2001).</li><li>Sparrow, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+fundus+autofluorescence+in+mice:+correlation+with+HPLC+quantitation+of+RPE+lipofuscin+and+measurement+of+retina+outer+nuclear+layer+thickness.">Quantitative fundus autofluorescence in mice: correlation with HPLC quantitation of RPE lipofuscin and measurement of retina outer nuclear layer thickness.</a> Investigative ophthalmology &amp; visual science. 54, 2812-2820 (2013).</li><li>Delori, F. C., Webb, R. H., Sliney, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maximum+permissible+exposures+for+ocular+safety+(ANSI+2000),+with+emphasis+on+ophthalmic+devices.">Maximum permissible exposures for ocular safety (ANSI 2000), with emphasis on ophthalmic devices.</a> Journal of the Optical Society of America. A, Optics, image science, and vision. 24, 1250-1265 (2007).</li></ol>

STA: no disclosures, JPG: no disclosures, RTS: consultant, Ocata Therapeutics.

異常のRPEリポフスチン分布は、増加または減少するかどうか、網膜疾患の感受性マーカーであり、一般に感覚網膜の機能の喪失と関連しています。ここで、我々は、RPEリポフスチンの評価のためQAFのアプリケーションを記述します。我々の標準化されたイメージング技術と一緒に可変レーザパワーと検出器感度9を補正する内部蛍光基準の取り込みは、AFレベルの信頼できる定量を可?...

網膜色素上皮（RPE）は、多数のプロセス1を通して感覚網膜の機能をサポートしています。加齢性黄斑変性症（AMD）は、先進国における治療不可能な失​​明の最も重要な原因であり、顔料の喪失、機能及び萎縮の損失を含むRPEの変化によって特徴づけられます。 AMDでは、通常の老化、RPEは、貪食感光体の断片を含む蛍光、リソソーム由来の細胞小器官を蓄積リポフスチン顆粒と呼ばれます。 RPEのリポフスチンの蓄積は、酸化障害1を示していると考えられてきたが、最近の研究では、RPEの形態は、高リポフスチンのレベル2と高齢目で正常のままであることを示しています。しかし、リポフスチン分布の異常パターンは、リポフスチンの特定の損失で、両方の組織学的および臨床的に3,4、AMDおよびAMDの進行のためのマーカーを文書化されています不良プロセスへRPEリポフスチンの歌うは、特定の遺伝性網膜変性症で起こることが示されています。シュタルガルト病（STGD）に罹患している患者は、最終的にはAMD 5に見られるものと同様の視力喪失を開発し、若い年齢でRPEにおけるリポフスチンを蓄積します。これらの知見は、リポフスチンの蓄積は、それ自体が毒性であるとRPEの機能障害6,7を駆動することができることを示唆しました。しかし、時間をかけてSTGDを有する被験者の詳細なイメージング研究では、焦点リポフスチンの蓄積は8以降のRPEの損失につながった確認しませんでした。リポフスチン異常は網膜変性のマーカーであるが故に、リポフスチンの直接毒性の役割が証明されていないままです。 RPEは、網膜の最も後方の細胞層であるが、眼底からの蛍光信号の大部分を生成します。 RPE由来する自家蛍光の発生と検出（AF）は、VIを可能にする共焦点走査型レーザー検眼鏡（cSLO）を用いて行うことができます眼底AFの空間分布のsualization。特定の網膜変性は、これらの状態の診断およびモニタリングにおける独特の眼底AFのパターン、AF用撮像補助を示します。標準的なAF撮影が臨床的に重要であるが、定量的なAF（QAF）は、RPEの健康を評価する重要な手段となっています。我々と他の人が確実に特定の網膜の位置9でQAFレベルを決定することができる標準的手法を開発しました。 QAFは、網膜の状態の診断およびモニタリングにおける潜在的な用途を有し、また、予後、リスク層別化に有用性を有することができます。また、QAFの診断機能はまた、特定の網膜疾患10-12について記載されています。ここでは、健康と病気の目の評価では、そのアプリケーションの視覚的なデモンストレーションを伴う私たちの技術を実行するための段階的な詳細を提供します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="671">
	<tbody>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:243px;">Spectralis HRA + OCT</td>
			<td style="width:143px;">Heidelberg Engineering</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">0.5% tropicamide ophthalmic solution</td>
			<td style="width:143px;">n/a</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">2.5% phenylephrine ophthalmic solution</td>
			<td style="width:143px;">n/a</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:243px;">Internal fluorescent reference</td>
			<td style="width:143px;">Heidelberg Engineering</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">IGOR Pro software</td>
			<td style="width:143px;">WaveMetrics</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative fundus autofluorescence for the evaluation of retinal diseases

The retinal pigment epithelium (RPE) is juxtaposed to the overlying sensory retina, and supports the function of the visual system. Among the tasks performed by the RPE are phagocytosis and processing of outer photoreceptor segments through lysosome-derived organelles. These degradation products, stored and referred to as lipofuscin granules, are composed partially of bisretinoids, which have broad fluorescence absorption and emission spectra that can be detected clinically as fundus autofluorescence with confocal scanning laser ophthalmoscopy (cSLO). Lipofuscin accumulation is associated with increasing age, but is also found in various patterns in both acquired and inherited degenerative diseases of the retina. Thus, studying its pattern of accumulation and correlating such patterns with changes in the overlying sensory retina are essential to understanding the pathophysiology and progression of retinal disease. Here, we describe a technique employed by our lab and others that uses cSLO in order to quantify the level of RPE lipofuscin in both healthy and diseased eyes.

この技術は、両方の健康13および疾患状態10-12でQAFを研究するために使用しました。健康な目（ 図1）においては、RPEから放出されたAFは、眼底（ 図1A）の全体にわたって比較的均一に分布しています。減少し強度が原因で目とカメラの光学系に黄斑色素による光の遮断、および画像の側面やコーナーでのために中央黄斑部に見...

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Quantitative Fundus Autofluorescence for the Evaluation of Retinal Diseases

網膜疾患の評価のための定量的眼底自己蛍光

The retinal pigment epithelium (RPE) supports the sensory retina through recycling visual cycle byproducts, which accumulate as lipofuscin. These products are autofluorescent and can be qualitatively imaged in vivo. Here, we describe a method to quantitatively image RPE lipofuscin using confocal scanning laser ophthalmoscopy.

The retinal pigment epithelium (RPE) is juxtaposed to the overlying sensory retina, and supports the function of the visual system. Among the tasks ...

quantitative-fundus-autofluorescence-for-evaluation-retinal

Research

JoVE Journal

Medicine

11.3K ビュー.  NYU School of Medicine. The retinal pigment epithelium (RPE) supports the sensory retina through recycling visual cycle byproducts, which accumulate as lipofuscin. These products are autofluorescent and can be qualitatively imaged in vivo. Here, we describe a method to quantitatively image RPE lipofuscin using confocal scanning laser ophthalmoscopy. 

ビデオ: Quantitative Fundus Autofluorescence for the Evaluation of Retinal Diseases

The Use of Primary Human Fibroblasts for Monitoring Mitochondrial Phenotypes in the Field of Parkinson's Disease

Parkinson's disease (PD) is the second most common movement disorder and affects 1% of people over the age of 60 1. Because ageing is the most important risk factor, cases of PD will increase during the next decades 2. Next to pathological protein folding and impaired protein degradation pathways, alterations of mitochondrial function and morphology were pointed out as further hallmark of neurodegeneration in PD 3-11.
After years of research in murine and human cancer cells as in vitro models to dissect molecular pathways of Parkinsonism, the use of human fibroblasts from patients and appropriate controls as ex vivo models has become a valuable research tool, if potential caveats are considered. Other than immortalized, rather artificial cell models, primary fibroblasts from patients carrying disease-associated mutations apparently reflect important pathological features of the human disease.
Here we delineate the procedure of taking skin biopsies, culturing human fibroblasts and using detailed protocols for essential microscopic techniques to define mitochondrial phenotypes. These were used to investigate different features associated with PD that are relevant to mitochondrial function and dynamics. Ex vivo, mitochondria can be analyzed in terms of their function, morphology, colocalization with lysosomes (the organelles degrading dysfunctional mitochondria) and degradation via the lysosomal pathway. These phenotypes are highly relevant for the identification of early signs of PD and may precede clinical motor symptoms in human disease-gene carriers. Hence, the assays presented here can be utilized as valuable tools to identify pathological features of neurodegeneration and help to define new therapeutic strategies in PD.

Fibroblasts from patients carrying mutations in Parkinson's disease-causing genes represent an easily accessible ex vivo model to study disease-associated phenotypes. Live cell imaging gives the opportunity to study morphological and functional parameters in living cells. Here we describe the preparation of human fibroblasts and subsequent monitoring of mitochondrial phenotypes.

パーキンソン病の分野におけるミトコンドリアの表現型を監視するための主要ヒト線維芽細胞の使用

Parkinson's disease (PD) is the second most  common movement disorder and affects 1% of people over the age of 60 1. Because ageing is  the most important ...

医学

Techniques for Processing Eyes Implanted with a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis: Part 2 Epiretinal Implants with Retinal Tacks

Retinal prostheses for the treatment of certain forms of blindness are gaining traction in clinical trials around the world with commercial devices currently entering the market. In order to evaluate the safety of these devices, in preclinical studies, reliable techniques are needed. However, the hard metal components utilised in some retinal implants are not compatible with traditional histological processes, particularly in consideration for the delicate nature of the surrounding tissue. Here we describe techniques for assessing the health of the eye directly adjacent to a retinal implant secured epiretinally with a metal tack.
Retinal prostheses feature electrode arrays in contact with eye tissue. The most commonly used location for implantation is the epiretinal location (posterior chamber of the eye), where the implant is secured to the retina with a metal tack that penetrates all the layers of the eye. Previous methods have not been able to assess the proximal ocular tissue with the tack in situ, due to the inability of traditional histological techniques to cut metal objects. Consequently, it has been difficult to assess localized damage, if present, caused by tack insertion.
Therefore, we developed a technique for visualizing the tissue around a retinal tack and implant. We have modified an established technique, used for processing and visualizing hard bony tissue around a cochlear implant, for the soft delicate tissues of the eye. We orientated and embedded the fixed eye tissue, including the implant and retinal tack, in epoxy resin, to stabilise and protect the structure of the sample. Embedded samples were then ground, polished, stained, and imaged under various magnifications at incremental depths through the sample. This technique allowed the reliable assessment of eye tissue integrity and cytoarchitecture adjacent to the metal tack.

Here we describe histological techniques for visualising ocular tissue directly adjacent to a metal epiretinal tack and retinal prosthesis.

網膜タックと2部網膜上インプラント：ローカライズされた病理組織学的分析のための人工網膜を移植した処理の目のための技術

Retinal prostheses for the treatment of certain forms of blindness are gaining traction in clinical trials around the world with commercial devices ...

Automated Radiochemical Synthesis of [18F]3F4AP: A Novel PET Tracer for Imaging Demyelinating Diseases

3-[18F]fluoro-4-aminopyridine, [18F]3F4AP, is a radiofluorinated analog of the FDA-approved drug for multiple sclerosis 4-aminopyridine (4AP). This compound is currently under investigation as a PET tracer for demyelination. We recently described a novel chemical reaction to produce metafluorinated pyridines consisting of direct fluorination of a pyridine N-oxide and the utilization of this reaction for the radiochemical synthesis of [18F]3F4AP. In this article, we demonstrate how to produce this tracer using an automated synthesizer and an in-house made flow hydrogenation reactor. We also show the standard quality control procedures performed before releasing the radiotracer for preclinical animal imaging studies. This semi-automated procedure may serve as the basis for future production of [18F]3F4AP for clinical studies.

Automated Radiochemical Synthesis of [18F]3F4AP: A Novel PET Tracer for Imaging Demyelinating Diseases

We demonstrate the semi-automated radiochemical synthesis of [18F]3F4AP and quality control procedures.

[<sup&gt; 18</sup&gt; F] 3F4AP：脱髄疾患イメージングのための新規PETトレーサ

3-[18F]fluoro-4-aminopyridine, [18F]3F4AP, is a radiofluorinated analog of the FDA-approved drug for multiple sclerosis 4-aminopyridine (4AP). This ...

Smartphone Fundus Photography

Smartphone fundus photography is a simple technique to obtain ocular fundus pictures using a smartphone camera and a conventional handheld indirect ophthalmoscopy lens. This technique is indispensable when picture documentation of optic nerve, retina, and retinal vessels is necessary but a fundus camera is not available. The main advantage of this technique is the widespread&#160;availability of smartphones that allows documentation of macula and optic nerve changes in many settings that was not previously possible. Following the well-defined steps detailed here, such as proper alignment of the phone camera, handheld lens, and the patient&#39;s pupil, is the key for obtaining a clear retina picture with no interfering light reflections and aberrations. In this paper, the optical principles of indirect ophthalmoscopy and fundus photography will be reviewed first. Then, the step-by-step method to record a good quality retinal image using a smartphone will be explained.

Fundus photography normally requires specialized fundus cameras that are not always available in all clinical settings.&#160;Here, a simple method to record ocular fundus images using a smartphone camera and a conventional high-plus handheld indirect ophthalmoscopy lens is described.

スマートフォン眼底撮影

Smartphone fundus photography is a simple technique to obtain ocular fundus pictures using a smartphone camera and a conventional handheld indirect ...

Using Retinal Imaging to Study Dementia

The retina offers a unique &#8220;window&#8221; to study pathophysiological processes of dementia in the brain, as it is an extension of the central nervous system (CNS) and shares prominent similarities with the brain in terms of embryological origin, anatomical features and physiological properties.&#160; The vascular and neuronal structure in the retina can now be visualized easily and non-invasively using retinal imaging techniques, including fundus photography and optical coherence tomography (OCT), and quantified semi-automatically using computer-assisted analysis programs. Studying the associations between vascular and neuronal changes in the retina and dementia could improve our understanding of dementia and, potentially, aid in diagnosis and risk assessment.&#160; This protocol aims to describe a method of quantifying and analyzing retinal vasculature and neuronal structure, which are potentially associated with dementia. This protocol also provides examples of retinal changes in subjects with dementia, and discusses technical issues and current limitations of retinal imaging.

The retina shares prominent similarities with the brain and thus represents a unique window to study vasculature and neuronal structure in the brain non-invasively. This protocol describes a method to study dementia using retinal imaging techniques. This method can potentially aid in diagnosis and risk assessment of dementia.

眼底イメージングを使用して認知症を研究するには

The retina offers a unique &#8220;window&#8221; to study pathophysiological processes of dementia in the brain, as it is an extension of the central ...

Invasive Hemodynamic Assessment for the Right Ventricular System and Hypoxia-Induced Pulmonary Arterial Hypertension in Mice

Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a chronic and severe cardiopulmonary disorder. Mice are a popular animal model used to mimic this disease. However, the evaluation of right ventricular pressure (RVP) and pulmonary artery pressure (PAP) remains technically challenging in mice. RVP and PAP are more difficult to measure than left ventricular pressure because of the anatomical differences between the left and right heart systems. In this paper, we describe a stable right heart hemodynamic measurement method and its validation using healthy and PAH mice. This method is based on open-chest surgery and mechanical ventilation support. It is a complicated procedure compared to closed chest procedures. While a well-trained surgeon is required for this surgery, the advantage of this procedure is that it can generate both RVP and PAP parameters at the same time, so it is a preferable procedure for the evaluation of PAH models.

Here, we present a protocol to perform an invasive hemodynamic assessment of the right ventricle and pulmonary artery in mice using an open-chest surgery approach.

マウスにおける右心室系と低酸素誘発性肺動脈高血圧に対する侵襲的血行力学的評価

Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a chronic and severe cardiopulmonary disorder. Mice are a popular animal model used to mimic this disease. ...

Oxygen-Induced Retinopathy Model for Ischemic Retinal Diseases in Rodents

One of the commonly used models for ischemic retinopathies is the oxygen-induced retinopathy (OIR) model. Here we describe detailed protocols for the OIR model induction and its readouts in both mice and rats. Retinal neovascularization is induced in OIR by exposing rodent pups either to hyperoxia (mice) or alternating levels of hyperoxia and hypoxia (rats). The primary readouts of these models are the size of neovascular (NV) and avascular (AVA) areas in the retina. This preclinical in vivo model can be used to evaluate the efficacy of potential anti-angiogenic drugs or to address the role of specific genes in the retinal angiogenesis by using genetically manipulated animals. The model has some strain and vendor specific variation in the OIR induction which should be taken into consideration when designing the experiments.

Oxygen-induced retinopathy (OIR) can be used to model ischemic retinal diseases such as retinopathy of prematurity and proliferative diabetic retinopathy and to serve as a model for proof-of-concept studies in evaluating antiangiogenic drugs for neovascular diseases. OIR induces robust and reproducible neovascularization in the retina that can be quantified.

げっ歯類における虚血性網膜症の酸素誘導網膜症モデル

One of the commonly used models for ischemic retinopathies is the oxygen-induced retinopathy (OIR) model. Here we describe detailed protocols for the OIR ...

Retinal Pigment Epithelium Transplantation in a Non-human Primate Model for Degenerative Retinal Diseases

Retinal pigment epithelial (RPE) transplantation holds great promise for the treatment of inherited and acquired retinal degenerative diseases. These conditions include retinitis pigmentosa (RP) and advanced forms of age-related macular degeneration (AMD), such as geographic atrophy (GA). Together, these disorders represent a significant proportion of currently untreatable blindness globally. These unmet medical needs have generated heightened academic interest in developing methods of RPE replacement. Among the animal models commonly utilized for preclinical testing of therapeutics, the non-human primate (NHP) is the only animal model that has a macula. As it shares this anatomical similarity with the human eye, the NHP eye is an important and appropriate preclinical animal model for the development of advanced therapy medicinal products (ATMPs) such as RPE cell therapy.
This manuscript describes a method for the submacular transplantation of an RPE monolayer, cultured on a polyethylene terephthalate (PET) cell carrier, underneath the macula onto a surgically created RPE wound in immunosuppressed NHPs. The fovea-the central avascular portion of the macula-is the site of the greatest mechanical weakness during the transplantation. Foveal trauma will occur if the initial subretinal fluid injection generates an excessive force on the retina. Hence, slow injection under perfluorocarbon liquid (PFCL) vitreous tamponade is recommended with a dual-bore subretinal injection cannula at low intraocular pressure (IOP) settings to create a retinal bleb. 
Pretreatment with an intravitreal plasminogen injection to release parafoveal RPE-photoreceptor adhesions is also advised. These combined strategies can reduce the likelihood of foveal tears when compared to conventional techniques. The NHP is a key animal model in the preclinical phase of RPE cell therapy development. This protocol addresses the technical challenges associated with the delivery of RPE cellular therapy in the NHP eye.

The non-human primate (NHP) is an ideal model for studying human retinal cellular therapeutics due to the anatomical and genetic similarities. This manuscript describes a method for submacular transplantation of retinal pigment epithelial cells in the NHP eye and strategies to prevent intraoperative complications associated with macular manipulation.

ヒト以外の霊長類モデルにおける変性網膜疾患の網膜色素上皮移植

Retinal pigment epithelial (RPE) transplantation holds great promise for the treatment of inherited and acquired retinal degenerative diseases. These ...

Retinal Pathophysiological Evaluation in a Rat Model

A posterior segment eye disease like diabetic retinopathy alters the physiology of the retina. Diabetic retinopathy is characterized by a retinal detachment, breakdown of the blood-retinal barrier (BRB), and retinal angiogenesis. An in vivo rat model is a valuable experimental tool to examine the changes in the structure and function of the retina. We propose three different experimental techniques in the rat model to identify morphological changes of retinal cells, retinal vasculature, and compromised BRB. Retinal histology is used to study the morphology of various retinal cells. Also, quantitative measurement is performed by retinal cell count and thickness measurement of different retinal layers. A BRB breakdown assay is used to determine the leakage of extraocular proteins from the plasma to vitreous tissue due to the breakdown of BRB. Fluorescence angiography is used to study angiogenesis and leakage of blood vessels by visualizing retinal vasculature using FITC-dextran dye.

Diabetic retinopathy is one of the leading causes of blindness. Histology, blood-retinal barrier breakdown assay, and fluorescence angiography are valuable techniques to understand the pathophysiology of the retina, which could further enhance the efficient drug screening against diabetic retinopathy.

ラットモデルにおける網膜病態生理学的評価

A posterior segment eye disease like diabetic retinopathy alters the physiology of the retina. Diabetic retinopathy is characterized by a retinal ...

Repetitive Blood Sampling from the Subclavian Vein of Conscious Rat

Rats are widely used in pharmacokinetics (PK) and toxicokinetic (TK) studies that need to collect a certain amount of blood at specific time points to detect drug exposure. The rat blood sampling method determines the quality of the plasma and further affects the precision of the test results. The subclavian vein blood collection method described in this protocol collects blood samples repeatedly in the conscious state of animals to meet the needs of PK and TK tests. The skills of restraint handling and appropriate procedure of needle incision ensure the success rate of blood collection. It is easy to operate while ensuring the quality of plasma and at the same time catering to animal welfare. However, this method requires skilled operation, and an improper one may cause animal weakness, pain, lameness, and even mortality. The current method has been used in the testing facility for a 4-week oral toxicity study in Sprague Dawley (SD) rats with TK. The maximum amount of blood collected within 24 h did not exceed 20% of the animal's total blood. The animals' body weight was more than 200 g for males and females. The data showed that the animals' bodyweight increased steadily every week, and the clinical observation was normal after repetitive sample collection.

The present protocol describes a simple and efficient method for collecting blood from the subclavian vein in rats. It enables rapid, timely, and easily identifiable sampling without anesthesia and obtains high-quality blood through repetitive sample collection.

意識性ラットの鎖骨下静脈からの反復採血

Rats are widely used in pharmacokinetics (PK) and toxicokinetic (TK) studies that need to collect a certain amount of blood at specific time points to ...