Name: generating a "humanized" drosophila s2 cell line sensitive to pharmacological inhibition of kinesin-5
Uploaded: 2016-01-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generating a "Humanized" Drosophila S2 Cell Line Sensitive to Pharmacological Inhibition of Kinesin-5 at JoVE.com

Gostaríamos de agradecer a Patricia Wadsworth para o dom do kinesin-5 construção. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa NIH (5 R01 GM107026) para TJM e pela Research Grant No. 5-FY13-205 da March of Dimes Foundation para TJM, bem como o apoio da Charles H. capa Foundation, Inc., Boston, MA. para TJM

1. transfecção de células S2 <ol><li> A partir de um frasco previamente cultivadas 25cm 2, adicionar-GFP ct-expressando-tubulina células S2 10 para um volume final de 2 ml a 100% de confluência, e permitir-lhes semi-aderir ao fundo de uma cultura de 35 mm de tecido do prato para cerca de 1 h. </li><li> Remova a mídia do prato. Transfectar 2 ug da Eg5-mCherry construção 11 com 1 ml de meio de Schneider suplementado com FBS a 10% (a seguir referido como meio de Schneider) e Reagente de Transfecção, seguindo o protocolo do fabricante. Fecha-se o prato com Parafilm e incubar as células a 25 ° C durante 16-18 horas. </li><li> Adicionar 1 ml de meio de Schneider. Retorno células a 25 ° C incubadora. </li><li> No dia 3 após a transfecção, transferir 500 ul de células transfectadas para uma nova placa de cultura de 35 mm de tecido contendo 1,5 ml de meio de Schneider durante um teste de indução. Induzem a expressão de Eg5-mCherry por adição de CuSO4 </sub&gt; até uma concentração final de 500 uM. Selar o prato em Parafilm e incubar a 25 ° CO / N. </li><li> Para fazer lamelas revestidas com concanavalina A pipeta, um volume suficiente de solução de concanavalina A (0,5 mg / mL dissolvido em H 2 O) para revestir uma lamela de ácido lavou-se, remover o excesso, e permitir que as lamelas secar ao ar. </li><li> Coloque um 22 mm x 22 mm concanavalina revestidos por uma lamela limpa numa cultura de 35 mm de tecido do prato, em seguida, 500 ul de sementes a 100% de confluência das células induzidas para a lamela e permitir que as células aderir durante 1 hora à TA. </li><li> Para verificar se há expressão Eg5-mCherry, montar a lamela em uma câmara de rosa (ou vaso de imagem apropriado) com a mídia para imagens em RT em um microscópio de fluorescência. Use fontes de luz adequadas e conjuntos de filtros para visualizar as células. Por exemplo, o microscópio usado no estudo tem uma fonte de luz LED branco e EGFP (ITCF / Cy2) e dsRed (TRITC / Cy3) filtro cubos. Eg5-mCherry localiza aos microtúbulos e é enriquecido near pólos do fuso. </li><li> Depois de garantir que as células expressando tanto são Eg5-mCherry e GFP-α-tubulina, transferir o restante das células transfectadas, não induzidas a 25 cm2 frasco de cultura de tecidos contendo 4 ml de meio de Schneider. </li><li> Adicionar Blasticidina S HCl a uma concentração final de 25 ug / mL ao frasco de células transfectadas e continuar a divisão na presença de 25 ug / ml de Blasticidina S HCl até a morte celular cessa tendo a certeza de verificar a expressão da Eg5-mCherry periodicamente. Incubar as linhas celulares em 25 ° C incubadora. NOTA: A percentagem de células que expressam Eg5-mCherry aumenta ao longo do tempo. </li><li> Uma vez que as células são transfectadas de forma estável, continuam a dividir na ausência de fármaco e congelar as células 12 para uso futuro. </li></ol> 2. RNA Interferência <ol><li> PCR amplificar uma região ~ 500 pb de Klp61F de cDNA (LD15641) utilizando o iniciador com adição de sequência de promotor de T7 (sequência previsto na lista de materiais) para serutilizado como um molde para a síntese de ARNcd. <ol><li> Defina-se quatro reacções de PCR, 50 pi cada uma, contendo 100 ng de ADN molde, 25 pM de cada iniciador, tampão adequado, e a polimerase. Ajuste o protocolo de PCR no termociclador de acordo com o protocolo do fabricante da polimerase. </li><li> Piscina e quatro reacções de PCR limpas usando um PCR limpar kit de acordo com o protocolo do fabricante. Armazenar o molde limpo a -20 ° C. </li></ol></li><li> Prepare ARN de cadeia dupla (ARNcd) de molde usando um kit de transcrição de ARN de T7, seguindo as instruções do fabricante. Esperar ~ concentração de 5-15 mg / ml de ARNdc. ARNcd armazenar a -20 ° C. </li><li> Para knockdown Klp61F com ARNcd, permitem que as células que expressam S2 Eg5-mCherry a 25% de confluência em semi-aderir ao fundo 35 de um prato de cultura de tecido mm durante 1 hora. </li><li> Remova a mídia dos pratos e adicionar 5 ug de dsRNA contra Klp61F (Drosophila kinesin-5) diluído em 1 ml de Schneider isento de soro &quot;s mídia. </li><li> Incubar à temperatura ambiente durante 1 h, em seguida adicionar 1 ml de meio de Schneider com 10% de FBS. Incubar as células a 25 ° C. </li><li> 24 horas após o tratamento ARNcd, induzir a expressão da Eg5-mCherry por adição de CuSO4 até uma concentração final de 500 uM. Incubar as células a 25 ° C durante mais 24 h. </li></ol> 3. Imagens de células vivas <ol><li> Coloque um 22 mm x 22 mm concanavalina A lamela revestida num limpo 35 mm de cultura de tecidos prato. </li><li> Semente de 500 ul de células que foram tratados com ARNdc e induzidas O / N para a concanavalina A lamela revestida e lhes permitem aderir durante cerca de 1 hora. </li><li> Montar a lamela em uma câmara de rosa (ou recipiente apropriado) para a imagem latente. </li><li> Encontre células mitóticas expressam tanto Eg5-mCherry e GFP-α-tubulina. NOTA: As células mitóticas expressando apenas GFP-α-tubulina fusos monopolares deve ter desde Klp61F, que é necessário para bipolaridade fuso, é derrubado 10,13. </li><li> Coletar imagens de lapso de tempo de eixos bipolares (por exemplo, um quadro por minuto) em células que expressam tanto Eg5-mCherry e GFP-α-tubulina. </li><li> Enquanto imagem, remova a mídia da câmara de rosa, e substituí-la por meios de Schneider contendo 1 mM STLC mais de 3 trocas de mídia consecutivos (~ 5 ml total) para a câmara para visualizar colapso do fuso. </li><li> À lavagem da droga e reverter o colapso do eixo, retire cuidadosamente a mídia contendo STLC da câmara de rosa, e lavar em meio de Schneider 4x (6-8 ml total) antes de reencher a câmara se levantou pela última vez com meio fresco. Continuar imagiologia. </li></ol> 4. Correção de Erros Assay <ol><li> Coloque um 22 mm x 22 mm concanavalina A lamelas revestidas em placas de cultura de 35 mm de tecido limpo. </li><li> Semente 500 ul de células que foram tratados com ARNdc sobre o Klp61F concanavalina A lamela revestida e lhes permitem aderir. </li><li> Depois as células são adherEd, adicionar 1,5 ml de meio de Schneider a cada placa para levar o volume final até 2 ml. </li><li> Para reter as células em mitose, MG132 adicionar a uma concentração final de 10 uM a cada um dos pratos, e incubar durante 1 h. </li><li> Adicionar 1 uM STLC e incubar durante 1 h para permitir que monopoles para formar. </li><li> Lavar a STLC por lavagem 3x lamelas com 2 ml de meio de Schneider frescos cada vez. </li><li> Incubar lamelas com meio de Schneider, além de quaisquer drogas farmacológicas (por exemplo, inibidores de quinase Aurora) ou DMSO, como um controlo. Nota: as concentrações do inibidor variam e concentrações finais adequada deve ser determinada pelo experimentador. As soluções de reserva são normalmente feitas de tal modo que o inibidor é diluída 1: 1.000 em mídia. Neste caso, uma diluição de 1: DMSO (ou num solvente apropriado) 1000 serve como controlo do veículo. Usamos o inibidor de Aurora B Binucleine 2 a uma concentração final de 40 uM. </li><li> Fix células em diferentes pontos no tempo tO observar a progressão da formação do fuso bipolar e para avaliar os estados de ligação cinetócoro. Consertar: <ol><li> Enxaguar rapidamente as lamelas com 2 ml de 1x BRB-80. </li><li> Fixar as células por adição de 2 ml de 10% de paraformaldeído em diluídos 1x BRB-80 durante 10 min. Pipet paraformaldeído cuidadosamente em uma capa química. </li><li> Permeabilizar as células com 2 ml de 1x PBS + 1% de Triton-X durante 8 min. </li><li> Lavagem das lâminas 3x com 2 ml de PBS 1x + 0,1% de Triton-X. </li><li> Transferência lamelas do lado célula viradas para cima para uma folha de Parafilm (use um marcador para rotular Parafilm adequadamente para manter o controle das lâminas) em uma placa de Petri de 150 milímetros. </li><li> Cobrir as lamelas com 150 ul de soro de burro fervida (BDS) e incubar a temperatura ambiente durante 1 h para bloquear o anticorpo não específico de ligação. Nota: Aqui, o protocolo de fixação pode ser parado para ser mantida a um ponto mais tarde. As lamelas podem ser armazenados numa câmara de humidade a 4 ° C durante até 24 h. Para fazer com que a câmara de humidade, a linha do aro de um prato de 150 mmcom um laboratório wipe molhado e cubra com a tampa placa de Petri. </li><li> Remover bloco, e incuba-se as lamelas durante 1 hora à temperatura ambiente com 150 ul de anticorpos primários diluídos apropriadamente em BDS para corar para cinetocoros e microtúbulos até às concentrações finais de 2 ug / ml (ou de acordo com as recomendações do fabricante) e 1 ug / ml, respectivamente . Nota: Aqui, o protocolo de fixação pode ser parado para ser mantida a um ponto mais tarde. As lamelas podem ser armazenados numa câmara de humidade a 4 ° C durante até 24 h. </li><li> Lavar 3x lamelas com 500 ul de 1x PBS + 0,1% de Triton-X. </li><li> Incubar lamelas durante 30-60 min à temperatura ambiente com os anticorpos secundários conjugados com fluoróforos adequados diluídos em BDS. </li><li> Lavar 3x lamelas com 500 ul de 1x PBS + 0,1% de Triton-X. </li><li> Incubar lamelas com 150 ul de BDS contendo 1 ug / ml de concentração final de DAPI, durante 5 min. </li><li> Lavar as lamelas com PBS 1x 2x + 0,1% de Triton-X, C e montaroverslips lado célula para baixo em um slide 3x1 &quot;com 8 mL de meio de montagem. Pinte os cantos com unha polonês para imobilizar as lamelas em lâminas. </li></ol></li><li> Células de imagem com eixos bipolares que estão expressando Eg5-mCherry. Tirar uma série Z constituído por 30 aviões em 0.2 mm intervalos em todos os canais usando um objetivo 100X. Analisar cuidadosamente as cinetócoros e microtúbulos para determinar os estados de fixação (biorientados ou anexos syntelic). </li></ol>

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

A visualização de correcção de erros é uma técnica valiosa para estudar as etapas envolvidas neste processo celular importante e complexo. Para fazê-lo, os anexos erradas são gerados usando inibidores reversíveis, e correcção de erros é observada mediante lavagem do fármaco. Este ensaio foi inicialmente desenvolvido utilizando células de cultura de tecidos de mamíferos, 5. No entanto, a presença de grande número de cinetocoros em muitos tipos de células de mamíferos modelo coloca um desafio na observação de eventos individuais de correcção de erros. As células S2 de Drosophila possuem tão poucos como 4 pares de cinetocoros, tornando-as numa linha celular mais preferível para a observação de correcção de erros. No entanto, uma grande desvantagem é que muitos inibidores são ineficazes em células S2 de Drosophila. Assim, a capacidade de gerar uma linha de células S2 de Drosophila expressando humana humanizado cinesina-5 fornece uma ferramenta valiosa para estudar a correcção de erros. Embora as células S2 de Drosophila pode ser ummelhor linha celular para estudar a correção de erros, as várias etapas envolvidas na obtenção da linha celular e derrubando genes essenciais coloca alguns desafios para esta técnica. Por exemplo, a eficiência da transfecção pode ser muito baixo. Se menos de 20% das células expressam o Eg5-mCherry, a transfecção deve ser repetido o processo de selecção como irá demorar mais tempo. Além disso, a percentagem de células que expressam ambas as proteínas fluorescentes pode diminuir ao longo do tempo. Isto pode ser superado através da divisão de células na presença de Blasticidina S HCl e higromicina B para seleccionar as células que expressam Eg5-mCherry e GFP-α-tubulina, respectivamente. É também importante notar que as células S2 de Drosophila têm ortólogos para muitas proteínas e humanos; Portanto, é essencial para optimizar as condições de knockdown para as proteínas endógenas. Condições óptimas de knockdown pode variar na quantidade de ARNdc e a duração do tratamento. Considerando-se o surgimento e rápida melhoria das CRISPR-Cas9 Technologies 15-17, a geração de uma linha de células de Drosophila com o gene Klp61F substituído por Eg5 humano apresenta uma alternativa poderosa capaz de superar as limitações da transfecção e abordagem knockdown. Nosso trabalho demonstra que a mosca-a-homem substituição gene deve ser uma opção viável neste caso, embora os reagentes necessários para fazê-lo em células de Drosophila S2 estão sendo desenvolvidos atualmente. Este processo não está limitado a Eg5, mas pode ser aplicado para estudar a função de outras proteínas de interesse. Se o uso de inibidores que tenham sido previamente estabelecidos para ser ineficaz em células de Drosophila S2, este protocolo pode ser modificado para se estudar o efeito direto de inibidores em células vivas, sem preocupações sobre os efeitos alvo fora. A linha celular produzida usando este protocolo pode também ser utilizada no rastreio de alto rendimento para identificar as análises potenciais drogas que visam proteínas envolvidas na correcção de erro.

Igual a segregação do genoma durante a divisão celular requer interacções entre as correctas microtúbulos fusiformes ADN e replicados. Os microtúbulos interagir fisicamente com os cromossomas por meio de um conjunto de proteínas que se monta em centrómeros conhecidos como o cinetocoro 1. Distribuição correta dos cromossomos exige que cinetócoros irmãos são biorientado, em que cada irmã está associada a microtúbulos provenientes de pólos opostos do fuso. Kinetochore microtúbulos (KT-MT) anexos que não estão na conformação biorientado são rápida e eficientemente desestabilizada para proporcionar a oportunidade para estabelecer biorientation num processo conhecido como correcção de erros. Um ensaio de correcção de erros que foi previamente estabelecida em células de mamíferos requer montagem 5 fusos monopolares utilizando inibidores de moléculas pequenas reversíveis contra Eg5 (cinesina-5). O tratamento da droga gera uma infinidade de acessórios syntelic errôneas em que botcinetócoros h irmãos anexar ao mesmo pólo do fuso. Uma lavagem subsequente do fármaco, permite a visualização do processo de correcção de erro. O ensaio de correcção de erros pode ser realizada na presença de inibidores de moléculas pequenas ou knockdowns para estudar a contribuição de proteínas candidatas para corrigir erróneos anexos KT-MT. A habilidade de visualizar a correcção de erros em células vivas é uma ferramenta poderosa para melhor compreender o mecanismo molecular envolvido neste processo complexo. No entanto, o grande número de cromossomas presentes na maioria das linhas celulares coloca um desafio na observação anexos KT-MT individuais. As células S2 de Drosophila seria ideal para a aplicação do ensaio de correcção de erro à medida que conter tão poucos como 4 cromossomas 6, mas os inibidores de moléculas pequenas de cinesina 5 tal como S-tritil-L-cisteína (STLC) e monastrol 7-9 não afecta a formação do fuso ou cinesina-5 função motora em células de Drosophila. Nós, portanto, gênerosTed uma linha de células S2 de Drosophila expressando cinesina-5 humana sob um promotor indutível que é sensível aos inibidores da cinesina-5. Este protocolo descreve como o knockdown endógena Drosophila cinesina-5 homólogo, Klp61F, e usar esta linha de células no ensaio de correcção de erros com base em células.

<table><tbody><tr><td>Effectine Transfection Reagent</td><td>Qiagen</td><td>301425</td><td></td></tr><tr><td>Klp61F cDNA</td><td>Drosophila Genomic Resource Center</td><td>13690</td><td>Gene Name LD15641</td></tr><tr><td>Schneider&amp;rsquo;s Media</td><td>Invitrogen</td><td>21720-024</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, certified</td><td>Invitrogen</td><td>10082-147</td><td>Heat Inactivated, US origin</td></tr><tr><td>Copper(II) Sulfate (CuSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma</td><td>C8027-500G</td><td>500&amp;nbsp;mM stock</td></tr><tr><td>S-trityl-L-cysteine</td><td>Sigma</td><td>164739-5G</td><td>1&amp;nbsp;mM stock in DMSO</td></tr><tr><td>Blasticidin HCl</td><td>Invitrogen</td><td>R21001</td><td>5&amp;nbsp;mg/ml stock in 1x PBS</td></tr><tr><td>Hygromycin B</td><td>Invitrogen</td><td>10687010</td><td></td></tr><tr><td>T7 Large scale RNA Production System</td><td>Promega</td><td>P1320</td><td>The approximate dsRNA concentration from each reaction is about 5-15&amp;nbsp;&amp;micro;g/&amp;micro;l</td></tr><tr><td>Klp61F RNAi F primer</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>TAATACGACTCACTATAGGGTA-TTTGCGCATTATTTTAAAA</td></tr><tr><td>Klp61F RNAi R primer</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>TAATACGACTCACTATAGGGAT-ATTGATCAATTGAAAC</td></tr><tr><td>PCR clean-up kit</td><td>Mo Bio Laboratories, Inc</td><td>1250</td><td></td></tr><tr><td>Concanavalin A</td><td>Sigma</td><td>C5275</td><td>0.5&amp;nbsp;mg/ml solution made by dissolving in 1x PBS.</td></tr><tr><td>Boiled Donkey Serum</td><td>Jackson ImmunoResearch Labs</td><td>017-000-121</td><td>5% stock solution in 1x PHEM buffer, bring solution up to boil. Stored in 4&amp;nbsp;&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Mounting Media</td><td></td><td></td><td>20&amp;nbsp;mM Tris pH 8.0,&amp;nbsp; 0.5% &lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-propyl gallate, 90% Glycerol. Stored in 4&amp;nbsp;&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>1x BRB-80</td><td></td><td></td><td>80 mM PIPES pH 6.9; 1&amp;nbsp;mM EGTA; 1 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>White Light Source</td><td>Lumencor Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ET EGFP Filter Cube</td><td>Chroma</td><td>49002</td><td></td></tr><tr><td>DSRed Filter Cube</td><td>Chroma</td><td>49005</td><td></td></tr><tr><td>anti-NDC80 antibody&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>Custom made by the Maresca Lab</td></tr><tr><td>DM1&amp;alpha; (anti-&amp;alpha;-tubulin)</td><td>Sigma</td><td>T6199</td><td></td></tr><tr><td>anti-CID antibody</td><td>AbCam</td><td>ab10887</td><td></td></tr></tbody></table>

generating a &#34;humanized&#34; drosophila s2 cell line sensitive to pharmacological inhibition of kinesin-5

Kinetochores are large protein-based structures that assemble on centromeres during cell division and link chromosomes to spindle microtubules. Proper distribution of the genetic material requires that sister kinetochores on every chromosome become bioriented by attaching to microtubules from opposite spindle poles before progressing into anaphase. However, erroneous, non-bioriented attachment states are common and cellular pathways exist to both detect and correct such attachments during cell division. The process by which improper kinetochore-microtubule interactions are destabilized is referred to as error correction. To study error correction in living cells, incorrect attachments are purposely generated via chemical inhibition of kinesin-5 motor, which leads to monopolar spindle assembly, and the transition from mal-orientation to biorientation is observed following drug washout. The large number of chromosomes in many model tissue culture cell types poses a challenge in observing individual error correction events. Drosophila S2 cells are better subjects for such studies as they possess as few as 4 pairs of chromosomes. However, small molecule kinesin-5 inhibitors are ineffective against Drosophila kinesin-5 (Klp61F). Here we describe how to build a Drosophila cell line that effectively replaces Klp61F with human kinesin-5, which renders the cells sensitive to pharmacological inhibition of the motor and suitable for use in the cell-based error correction assay.

Klp61F é necessário para formar fusos bipolares. O cinesina-5 humana, Eg5, pode resgatar a função de Klp61F em células S2 de Drosophila (Figura 1A e D). Após a adição da cinesina-5 inibidor (STLC), níveis associadas a microtúbulos da gota do motor (Figura 1B e E), e os colapsos do fuso, o que resulta em um monopolo (Figura 1C e F) em células sem Klp61F endógenos sobre o ARNi sucesso (filme Suplementar 1). É digno de nota que fusos bipolares em colapso após a adição de STLC nas células S2 porque cinesina humanizados-5 actividade não é necessária para manter bipolaridade fuso em células humanas. Esta discrepância interessante pode ser um resultado de diferenças na sobreposição de microtúbulos interpolar e / ou estabilidade nos dois sistemas modelo 14. Cinesina-5 de inibição (Figura 2 A e E) pode ser reve<html> rsed por lavagem do fármaco e a recuperação de um fuso bipolar pode ser seguido ao longo do tempo. Após a remoção do inibidor (Figura 2B e F), Eg5-mCherry re-associados com os microtúbulos como um bipolares monta fuso (Figura 2C e G), e as células podem progredir para um anafase bipolar (Figura 2D e H, filme suplementar 2 ). <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53594/53594fig1.jpg" /> Figura 1. A adição de 1 mM STLC leva a fusos monopolares em células S2 de Drosophila. Imagens representativas de time-lapse imagem de uma célula de Drosophila S2 expressar Eg5-mCherry (AC) e GFP-α-tubulina (DF) durante a adição de 1 mM STLC. O inibidor de Eg5 foi adicionado em 3 minutos. Barra de escala = 5 uM. Timestamp = min: seg.<html> &quot;target =&quot; _ blank w.jove.com/files/ftp_upload/53594/53594fig1large.jpg &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53594/53594fig2.jpg" /> Figura 2. A reforma do fuso bipolar após a remoção de STLC. Imagens representativas de time-lapse imagem de uma célula de Drosophila expressando 2 Eg5-mCherry (AD) e GFP-α-tubulina (EH) durante um experimento STLC washout. STLC foi lavado para fora em 5 min. A reforma do fuso bipolar dentro de 1 hora de remover o STLC. Barra de escala = 5 uM. Timestamp: min: seg. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53594/53594fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Filme 1" src="/files/ftp_upload/53594/53594mov1.jpg" /> &quot;target =&quot; _ blank ww.jove.com/files/ftp_upload/53594/addin.mov &quot;&gt; Filme Suplementar 1. (Clique direito a download). Widefield imagens de fluorescência de um exemplo representativo de uma célula de Drosophila S2 expressar Eg5-mCherry ( esquerda) e GFP-α-tubulina (à direita). 1 uM STLC foi adicionado aos 2 min, e as formas do fuso um monopolo dentro de 10 min após a adição do inibidor. As imagens foram adquiridas a cada 1 minuto e tocada a uma velocidade de 10 quadros por segundo. Barra de escala = 5 mm. <img alt="Filme 2" src="/files/ftp_upload/53594/53594mov2.jpg" /> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53594/washout.mov" target="_blank">Filme Suplementar 2. (Clique direito a download).</a> Widefield imagens de fluorescência de um exemplo representativo de uma célula de Drosophila S2 expressar Eg5-mCherry (esquerda) e GFP-α-tubulina (à direita). Meios contendo 1 uM foi removido e STLClavado a 5 min. A reforma do fuso bipolar dentro de 1 hora de remover o inibidor. As imagens foram adquiridas a cada 1 min e jogado a uma taxa de 10 quadros por segundo. Barra de escala = 5 uM.

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Generating a "Humanized" Drosophila S2 Cell Line Sensitive to Pharmacological Inhibition of Kinesin-5

Gerando um &quot;humanizado&quot;<em&gt; Drosophila</em&gt; S2 linha de células sensíveis a inibição farmacológica de cinesina-5

This protocol describes how to generate a Drosophila S2 cell line that is sensitive to small molecule inhibitors of kinesin-5. The use of these cells in a cell-based error correction assay is also outlined.

Kinetochores are large protein-based structures that assemble on centromeres during cell division and link chromosomes to spindle microtubules. Proper ...

generating-humanized-drosophila-s2-cell-line-sensitive-to

Research

JoVE Journal

Biology

Generating a &#34;Humanized&#34; Drosophila S2 Cell Line Sensitive to Pharmacological Inhibition of Kinesin-5

7.2K visualizações.  University of Massachusetts, Amherst. This protocol describes how to generate a Drosophila S2 cell line that is sensitive to small molecule inhibitors of kinesin-5. The use of these cells in a cell-based error correction assay is also outlined. 

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Use of Drosophila S2 Cells for Live Imaging of Cell Division

Drosophila S2 cells are an important tool in studying mitosis in tissue culture, providing molecular insights into this fundamental cellular process in a rapid and high-throughput manner. S2 cells have proven amenable to both fixed- and live-cell imaging applications. Notably, live-cell imaging can yield valuable information about how loss or knockdown of a gene can affect the kinetics and dynamics of key events during cell division, including mitotic spindle assembly, chromosome congression, and segregation, as well as overall cell cycle timing. Here we utilize S2 cells stably transfected with fluorescently tagged mCherry:&#945;-tubulin to mark the mitotic spindle and GFP:CENP-A (referred to as &#8216;CID&#8217; gene in Drosophila) to mark the centromere to analyze the effects of key mitotic genes on the timing of cell divisions, from prophase (specifically at Nuclear Envelope Breakdown; NEBD) to the onset of anaphase. This imaging protocol also allows for the visualization of the spindle microtubule and chromosome dynamics throughout mitosis. Herein, we aim to provide a simple yet comprehensive protocol that will allow readers to easily adapt S2 cells for live imaging experiments. Results obtained from such experiments should expand our understanding of genes involved in the cell division by defining their role in several simultaneous and dynamic events. Observations made in this cell culture system can be validated and further investigated in vivo using the impressive toolkit of genetic approaches in flies.

Use of Drosophila S2 Cells for Live Imaging of Cell Division

Cell divisions can be visualized in real time using fluorescently tagged proteins and time-lapse microscopy. Using the protocol presented here, users can analyze cell division timing dynamics, mitotic spindle assembly, and chromosome congression and segregation. Defects in these events following RNA interference (RNAi)-mediated gene knockdown can be assessed and quantified.

Uso de células de Drosophila S2 para imagens ao vivo da divisão celular

Drosophila S2 cells are an important tool in studying mitosis in tissue culture, providing molecular insights into this fundamental cellular process in a ...

Genética

A Screening Method for Identification of Heterochromatin-Promoting Drugs Using Drosophila

Drosophila is an excellent model organism that can be used to screen compounds that might be useful for cancer therapy. The method described here is a cost-effective in vivo method to identify heterochromatin-promoting compounds by using Drosophila. The Drosophila&#39;s DX1 strain, having a variegated eye color phenotype that reflects the extents of heterochromatin formation, thereby providing a tool for a heterochromatin-promoting drug screen. In this screening method, eye variegation is quantified based on the surface area of red pigmentation occupying parts of the eye and is scored on a scale from 1 to 5. The screening method is straightforward and sensitive and allows for testing compounds in vivo. Drug screening using this method provides a fast and inexpensive way for identifying heterochromatin-promoting drugs that could have beneficial effects in cancer therapeutics. Identifying compounds that promote the formation of heterochromatin could also lead to the discovery of epigenetic mechanisms of cancer development.

A Screening Method for Identification of Heterochromatin-Promoting Drugs Using Drosophila

Drosophila is a widely used experimental model suitable for screening drugs with potential applications for cancer therapy. Here, we describe the use of Drosophila variegated eye color phenotypes as a method for screening small-molecule compounds that promote heterochromatin formation.

Um método de triagem para identificação de drogas promotoras de heterocromatina usando drosophila

Drosophila is an excellent model organism that can be used to screen compounds that might be useful for cancer therapy. The method described here is a ...

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

We describe a method for ex vivo culturing of whole Drosophila brains. This can be used as a counterpoint to chronic genetic manipulations for investigating the cell biology and development of central brain structures by allowing acute pharmacological interventions and live imaging of cellular processes. As an example of the technique, prior work from our lab1 has shown that a previously unrecognized subcellular compartment lies between the axonal and somatodendritic compartments of axons of the Drosophila central brain. The development of this compartment, referred to as the axon initial segment (AIS)2, was shown genetically to depend on the neuron-specific cyclin-dependent kinase, Cdk5. We show here that ex vivo treatment of wild-type Drosophila larval brains with the Cdk5-specific pharmacological inhibitors roscovitine and olomoucine3 causes acute changes in actin organization, and in localization of the cell-surface protein Fasciclin 2, that mimic the changes seen in mutants that lack Cdk5 activity genetically.
A second example of the ex vivo culture technique is provided for remodeling of the connections of embryonic mushroom body (MB) gamma neurons during metamorphosis from larva to adult. The mushroom body is the center of olfactory learning and memory in the fly4, and these gamma neurons prune their axonal and dendritic branches during pupal development and then re-extend branches at a later timepoint to establish the adult innervation pattern5. Pruning of these neurons of the MB has been shown to occur via local degeneration of neurite branches6, by a mechanism that is triggered by ecdysone, a steroid hormone, acting at the ecdysone receptor B17, and that is dependent on the activity of the ubiquitin-proteasome system6. Our method of ex vivo culturing can be used to interrogate further the mechanism of developmental remodeling. We found that in the ex vivo culture setting, gamma neurons of the MB recapitulated the process of developmental pruning with a time course similar to that in vivo. It was essential, however, to wait until 1.5 hours after puparium formation before explanting the tissue in order for the cells to commit irreversibly to metamorphosis; dissection of animals at the onset of pupariation led to little or no metamorphosis in culture. Thus, with appropriate modification, the ex vivo culture approach can be applied to study dynamic as well as steady state aspects of central brain biology.

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

This article describes a method by which one can mimic in vivo development of the Drosophila mushroom body in an ex vivo culture system.

A cultura Ex vivo de todo, o desenvolvimento cerebral de Drosophila

We describe a method for ex vivo culturing of whole Drosophila brains. This can be used as a counterpoint to chronic genetic manipulations for ...

Neurociência

A Cell-based Assay to Investigate Non-muscle Myosin II Contractility via the Folded-gastrulation Signaling Pathway in Drosophila S2R+ Cells

We have developed a cell-based assay using Drosophila cells that recapitulates apical constriction initiated by folded gastrulation (Fog), a secreted epithelial morphogen. In this assay, Fog is used as an agonist to activate Rho through a signaling cascade that includes a G-protein-coupled receptor (Mist), a G&#945;12/13 protein (Concertina/Cta), and a PDZ-domain-containing guanine nucleotide exchange factor (RhoGEF2). Fog signaling results in the rapid and dramatic reorganization of the actin cytoskeleton to form a contractile purse string. Soluble Fog is collected from a stable cell line and applied ectopically to S2R+ cells, leading to morphological changes like apical constriction, a process observed during developmental processes such as gastrulation. This assay is amenable to high-throughput screening and, using RNAi, can facilitate the identification of additional genes involved in this pathway.

A Cell-based Assay to Investigate Non-muscle Myosin II Contractility via the Folded-gastrulation Signaling Pathway in Drosophila S2R+ Cells

Here we describe a contractility assay using Drosophila S2R+ cells. The application of an exogenous ligand, folded gastrulation (Fog), leads to the activation of the Fog signaling pathway and cellular contractility. This assay can be used to investigate the regulation of cellular contractility proteins in the Fog signaling pathway.

Um ensaio de baseada em célula para investigar não-músculo Myosin II contratilidade através o dobrado-gastrulação sinalização via em Drosophila S2R + células

We have developed a cell-based assay using Drosophila cells that recapitulates apical constriction initiated by folded gastrulation (Fog), a secreted ...

Biologia do Desenvolvimento

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the number of novel cell lines is expected to increase. The DGRC aims to familiarize researchers with using Drosophila cell lines as an experimental tool to complement and drive their research agenda. Procedures for working with a variety of Drosophila cell lines with distinct characteristics are provided, including protocols for thawing, culturing, and cryopreserving cell lines. Importantly, this publication demonstrates the best practices required to work with Drosophila cell lines to minimize the risk of contaminations from adventitious microorganisms or from other cell lines. Researchers who become familiar with these procedures will be able to delve into the many applications that use Drosophila cultured cells including biochemistry, cell biology and functional genomics.

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Drosophila cell lines are important reagents for both fundamental and biomedical research. This article provides protocols for thawing, subculturing, and the cryopreservation of commonly used Drosophila cell lines to assist researchers in incorporating the use of these reagents in their research.

Descongelamento, cultivo e Cryopreserving linhas de células de Drosophila

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature and genome sequence database. Cultured Drosophila S2 cells, the product of disassociated 20-24 hour old embryos1, possess all these properties. Consequently, S2 cells are extremely well-suited for the analysis of cellular processes, including the discovery of the genes encoding the molecular components of the process or mechanism of interest. The features of S2 cells that are most responsible for their utility are the ease with which they are maintained, their exquisite sensitivity to double-stranded (ds)RNA-mediated interference (RNAi), and their tractability to fluorescence microscopy as either live or fixed cells.
S2 cells can be grown in a variety of media, including a number of inexpensive, commercially-available, fully-defined, serum-free media2. In addition, they grow optimally and quickly at 21-24&deg;C and can be cultured in a variety of containers. Unlike mammalian cells, S2 cells do not require a regulated atmosphere, but instead do well with normal air and can even be maintained in sealed flasks.
Complementing the ease of RNAi in S2 cells is the ability to readily analyze experimentally-induced phenotypes by phase or fluorescence microscopy of fixed or live cells. S2 cells grow in culture as a single monolayer but do not display contact inhibition. Instead, cells tend to grow in colonies in dense cultures. At low density, S2 cultures grown on glass or tissue culture-treated plastic are round and loosely-attached. However, the cytology of S2 cells can be greatly improved by inducing them to flatten extensively by briefly culturing them on a surface coated with the lectin, concanavalin A (ConA)3. S2 cells can also be stably transfected with fluorescently-tagged markers to label structures or organelles of interest in live or fixed cells. Therefore, the usual scenario for the microscopic analysis of cells is this: first, S2 cells (which can possess transgenes to express tagged markers) are treated by RNAi to eliminate a target protein(s). RNAi treatment time can be adjusted to allow for differences in protein turn-over kinetics and to minimize cell trauma/death if the target protein is important for viability. Next, the treated cells are transferred to a dish containing a coverslip pre-coated with conA to induce cells to spread and tightly adhere to the glass. Finally, cells are imaged with the researcher's choice of microscopy modes. S2 cells are particularly good for studies requiring extended visualization of live cells since these cells stay healthy at room temperature and normal atmosphere.

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

Drosophila Schneider (S2) cells are an increasingly popular system for the discovery and functional analysis of genes. Our goal is to describe some of the microscopic techniques that make S2 cells such an increasingly important experimental system.

Preparação de Drosophila Células S2 para microscopia de luz

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature ...

Biologia

Inibição optogenética da contratilidade da actomiosina mediada por Rho1 em Drosophila

Optogenetic Inhibition of Rho1-Mediated Actomyosin Contractility Coupled with Measurement of Epithelial Tension in Drosophila Embryos

Contractile forces generated by actin and non-muscle myosin II ("actomyosin contractility") are critical for morphological changes of cells and tissues at multiple length scales, such as cell division, cell migration, epithelial folding, and branching morphogenesis. An in-depth understanding of the role of actomyosin contractility in morphogenesis requires approaches that allow the rapid inactivation of actomyosin, which is difficult to achieve using conventional genetic or pharmacological approaches. The presented protocol demonstrates the use of a CRY2-CIBN based optogenetic dimerization system, Opto-Rho1DN, to inhibit actomyosin contractility in Drosophila embryos with precise temporal and spatial controls. In this system, CRY2 is fused to the dominant negative form of Rho1 (Rho1DN), whereas CIBN is anchored to the plasma membrane. Blue light-mediated dimerization of CRY2 and CIBN results in rapid translocation of Rho1DN from the cytoplasm to the plasma membrane, where it inactivates actomyosin by inhibiting endogenous Rho1. In addition, this article presents a detailed protocol for coupling Opto-Rho1DN-mediated inactivation of actomyosin with laser ablation to investigate the role of actomyosin in generating epithelial tension during Drosophila ventral furrow formation. This protocol can be applied to many other morphological processes that involve actomyosin contractility in Drosophila embryos with minimal modifications. Overall, this optogenetic tool is a powerful approach to dissect the function of actomyosin contractility in controlling tissue mechanics during dynamic tissue remodeling.

Autor em destaque: Inibição optogenética da contratilidade da actomiosina mediada por Rho1 juntamente com a medição da tensão epitelial em embriões de Drosophila  

Actomyosin contractility plays an important role in cell and tissue morphogenesis. However, it is challenging to manipulate actomyosin contractility in vivo acutely. This protocol describes an optogenetic system that rapidly inhibits Rho1-mediated actomyosin contractility in Drosophila embryos, revealing the immediate loss of epithelial tension after the inactivation of actomyosin in vivo.

Inibição Optogenética da Contratilidade da Actomiosina Mediada por Rho1 Juntamente com a Medida da Tensão Epitelial em Embriões de Drosophila

Contractile forces generated by actin and non-muscle myosin II ("actomyosin contractility") are critical for morphological changes of cells and tissues at ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a variety of neurodegenerative diseases, understanding microtubule based motor transport and its regulation will likely ultimately lead to improved therapeutic approaches. Kinesin-1 is a eukaryotic motor protein which moves in an anterograde (plus-end) direction along microtubules (MTs), powered by ATP hydrolysis. Here we report a detailed purification protocol to isolate active full length kinesin from Drosophila embryos, thus allowing the combination of Drosophila genetics with single-molecule biophysical studies. Starting with approximately 50 laying cups, with approximately 1000 females per cup, we carried out overnight collections. This provided approximately 10 ml of packed embryos. The embryos were bleach dechorionated (yielding approximately 9 grams of embryos), and then homogenized. After disruption, the homogenate was clarified using a low speed spin followed by a high speed centrifugation. The clarified supernatant was treated with GTP and taxol to polymerize MTs. Kinesin was immobilized on polymerized MTs by adding the ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate at room temperature. After kinesin binding, microtubules were sedimented via high speed centrifugation through a sucrose cushion. The microtubule pellet was then re-suspended, and this process was repeated. Finally, ATP was added to release the kinesin from the MTs. High speed centrifugation then spun down the MTs, leaving the kinesin in the supernatant. This kinesin was subjected to a centrifugal filtration using a 100 KD cut off filter for further purification, aliquoted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 &deg;C. SDS gel electrophoresis and western blotting was performed using the purified sample. The motor activity of purified samples before and after the final centrifugal filtration step was evaluated using an in vitro single molecule microtubule assay. The kinesin fractions before and after the centrifugal filtration showed processivity as previously reported in literature. Further experiments are underway to evaluate the interaction between kinesin and other transport related proteins.

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

This is a protocol to isolate active full length Kinesin from Drosophila embryos for single-molecule biophysical studies. We show how to collect embryos, make the embryo lysate, and then polymerize microtubules (MTs). Kinesin is purified by immobilizing it on the MTs, spinning down the Kinesin-MT complexes, and then releasing the kinesin from the MTs via ATP addition.

Isolamento e Purificação de cinesina partir Drosophila Os embriões

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Gerando um "humanizado"

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Uso de células de Drosophila S2 para imagens ao vivo da divisão celular

Um método de triagem para identificação de drogas promotoras de heterocromatina usando drosophila

A cultura Ex vivo de todo, o desenvolvimento cerebral de Drosophila

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Descongelamento, cultivo e Cryopreserving linhas de células de Drosophila

Preparação de Drosophila Células S2 para microscopia de luz

Inibição Optogenética da Contratilidade da Actomiosina Mediada por Rho1 Juntamente com a Medida da Tensão Epitelial em Embriões de Drosophila

Inibição Optogenética da Contratilidade da Actomiosina Mediada por Rho1 Juntamente com a Medida da Tensão Epitelial em Embriões de Drosophila

Inibição Optogenética da Contratilidade da Actomiosina Mediada por Rho1 Juntamente com a Medida da Tensão Epitelial em Embriões de Drosophila

Isolamento e Purificação de cinesina partir Drosophila Os embriões