We thank Mr. O. Rios for his technical assistance.

Este estudo foi aprovado para o uso de material humano pelas comissões éticas locais do estabelecimento de saúde e do Centro de Pesquisa e avançar nos estudos do Instituto Politécnico Nacional. Aquisição Amostra 1. Tumor <ol><li> Obter a biópsia de tecido adenoma pituitário de um paciente através de um procedimento cirúrgico trans-esfenoidal 14. </li><li> Recolha da amostra adenoma pituitário e colocá-lo em um frasco de vidro estéril contendo 50 ml de fresco 199 de meio de cultura (M199) enriquecido com 10% de soro fetal de bovino (FBS), 0,6 mg / ml de bicarbonato de sódio, 2,4 mg / mL de Hepes e 1% antibióticos (penicilina / estreptomicina) a pH 7,4. Manter a amostra em um frasco de vidro no gelo. Nota: O tecido tumoral pode ser processado várias horas após a cirurgia. </li><li> Transportar a amostra de tumor para o laboratório do frasco de vidro em gelo. </li></ol> 2. Preparação das soluções enzimáticas Tissue dissociação, oSolução de tripsina inibidor e as soluções de alginato Nota: Antes do processo de cultura celular preparar as seguintes soluções. Filtro de todas as soluções que utilizam um filtro de membrana de 0,22 um, antes do uso. <ol><li> Preparar solução de colagenase a 1% por dissolução de 5 mg de colagenase (tipo I), em 5 ml de livre M199-soro. </li><li> Preparar solução de tripsina a 0,01% por dissolução de 0,01 g de tripsina em 10 ml de PBS-EDTA a 0,3%. </li><li> Preparar a solução de inibidor de tripsina a 0,1% por dissolução de 2 mg de inibidor da tripsina de soja em 20 ml de livre M199-soro. </li><li> Preparar a solução de ADNase por dissolução de 20 ul de ADNase I 134 U / ml em 4 ml de solução de inibidor de tripsina. </li><li> Preparar a solução de EGTA (1,2 M) por dissolução de 22,8 mg de EGTA em 40 ml de NaCl 155 mM. Ajustar o pH para 7,4. Continuar a um volume final de 50 ml. </li><li> Preparar a solução de HEPES (20 mM) por dissolução de 238 mg de HEPES em 50 ml de NaCl 155 mM. </li><li> Preparar a solução de alginato a 1,2% por dissolução de 1,2g de alginato de sódio em 100 ml de solução HEPES. Autoclave a solução de alginato. </li><li> Preparar a solução de cálcio (102 mM) dissolvendo 750 mg de CaCl 2 em 50 ml de solução HEPES, ajustar o pH a 7,4 </li></ol> 3. célula primária Cultura e alginato Encapsulation <ol><li> Dentro de uma câmara de fluxo laminar, colocar o tecido de tumor em 35 milímetros uma placa de Petri contendo aproximadamente 20 ml de PBS Ca 2+ e Mg 2+ livre, pH 7,4 (PBS *). </li><li> Tome o tecido com uma pinça cirúrgica e colocá-lo em outra placa de Petri contendo PBS fresco *, lavar cuidadosamente o tecido. Repita este passo até que as células vermelhas do sangue e detritos são removidos. </li><li> Usando uma pinça cirúrgica, segure o tecido adenoma pituitário, e com uma pequena tesoura cirúrgica, cortá-la em pedaços pequenos. Com uma pipeta de Pasteur com bordas arredondadas, transferir os fragmentos de tecido e o PBS * para um tubo de 15 ml, de centrifugação a 68 xg durante 10 min à temperatura ambiente. Nota: Para arredondar as bordas de um Pasteurpipeta, chama ligeiramente a ponta da pipeta em um bico de Bunsen. </li><li> Remover o PBS * usando uma pipeta de Pasteur e adicionar 3-5 mL da solução de colagenase (cerca de 5 ml para 65 milímetros de tecido 3), misturar duas a três vezes através da inversão. Incubar o tecido na colagenase durante 30 minutos a 37 ° C em rotação constante. </li><li> Centrifuga-se o tubo a 68 x g durante 10 min à temperatura ambiente e remover a colagenase, com uma pipeta de Pasteur. </li><li> Adicionar 5 ml de DNase e misturar duas a três vezes por inversão, depois centrifugar o tubo a 68 x g durante 10 min à TA. Nota: Se o tecido não é completamente dissociada, executar uma segunda digestão enzimática com tripsina durante 3 min a 37 ° C. Parar a digestão através da adição de 2 volumes de solução de inibidor de tripsina. </li><li> Aspirar o sobrenadante com uma pipeta Pasteur e descartar. Re-suspender o sedimento em 1 volume de solução de EGTA e misturar-se com 2 volumes de solução de alginato. </li><li> Misture suavemente a suspensão de células e alginatopipetando com uma pipeta de Pasteur. Dê uma seringa estéril com uma agulha G 21, retire o êmbolo; usar uma pipeta para carregar a seringa com a solução de alginato e de células. </li><li> Suavemente inserir o êmbolo para dentro da seringa e dispensar cuidadosamente gota-a-gota a solução de células de alginato em um copo de vidro contendo cerca de 30 ml da solução rica em cálcio. </li><li> Coloque a agulha da seringa de cerca de 5 cm acima da solução de CaCl 2. Os géis de alginato de suspensão de células em contacto com o CaCl2 para formar grânulos esféricos. Manter as drageias de alginato de cálcio na solução durante 5 minutos. Nota: Misture o copo de vidro em que as contas são descartados. Mova-se lentamente com a mão em movimentos circulares, para evitar que grudem uns aos outros. </li><li> Remova cuidadosamente a solução de cálcio com uma pipeta Pasteur, e lavar as contas duas vezes com 3-5 ml de M199 enriquecido com 20% de FBS. </li><li> Transferir as drageias de alginato em uma cultura de tecidos T25 regularesflask usando uma espátula estéril, adicionar 4-5 mL de M199 enriquecido com 20% de FBS e incubou-se a 37 ° C numa incubadora humidificada com 5% de CO 2. Mudar o meio de cultura a cada terceiro dia. </li></ol> 4. Libere células a partir do alginato Nota: Antes de libertar as células a partir das pérolas de alginato, revestimento lamelas 13 mm de diâmetro com poli-D-lisina. CUIDADO: SULPHURIC ACID é um ácido altamente corrosivos, e APTS PODE CAUSAR IRRITAÇÃO NOS OLHOS E PELE. Use luvas de látex para lidar com esses reagentes. <ol><li> Numa hotte, com uma pinça ponto de imergir as lamelas numa placa de Petri de vidro contendo ácido sulfúrico aquoso a 20% durante 1 h à TA. </li><li> Decanta-se o ácido sulfúrico, e lava-se as lamelas cinco vezes com água destilada durante 5 minutos cada. Usando um lugar ponto de pinça as lamelas limpos em uma placa de petri contendo NaOH 0,1 M durante 5 min a RT 15. </li><li> Decantar o NaOH e lavar uma vez com destilarágua levou, aspirar a água e seque as lamelas. </li><li> Usar uma micropipeta para revestir as lamelas com APTS (aminopropil-trietoxissilano) durante 4 min (use 500 ul durante 6 lamelas) inundar o prato de Petri com água destilada. aspirar rapidamente a água e continuar a lavar com água destilada, movendo-se as lamelas com uma pinça de ponto para permitir que a água penetre por baixo. </li><li> Aspirar a água e seque as lamelas, usando um lugar ponto de pinça as lamelas em um prato limpo Petri e esterilizá-los dentro do microondas durante 3 vezes, 45 segundos cada. Adicionar 1000 mL de água estéril para 100 ug de poli-D-lisina (0,1 mg / ml). </li><li> Incubam-se as lamelas com aproximadamente 50 ul de poli-D-lisina durante 5 min à TA. Aspirar o poli-D-lisina completamente. Nota: Isto é importante porque solúvel poli-D-lisina em meio de cultura pode inibir a proliferação celular. </li><li> Lavar as lamelas cinco vezes com água estéril durante 5 minutos cada. Aspirar o stágua e deixe erile lamelas para secar dentro de uma câmara de fluxo laminar. </li><li> Para analisar o citoesqueleto de actina, libertar as células de pituitária do alginato. Tomar algumas das drageias de alginato a partir do frasco de cultura utilizando uma ponta de pipeta de 1 ml e coloca-os em um tubo de 15 ml. </li><li> Adicionar 5 ml de citrato de sódio 55 mM (dissolver-se 323,6 mg de Na 3 C 6 H 5 O 7, 2 H2O em 20 ml de solução HEPES) e centrifugação a 68 xg durante 10 min à temperatura ambiente. Aspirar o sobrenadante e descartar. </li><li> Re-suspender o sedimento em 1 ml de M199 quente enriquecido com 20% FSB; misturar suavemente a suspensão de células com uma pipeta de Pasteur. CUIDADO: phalloidin E DAPI são tóxicos. Utilize luvas para manusear estes reagentes. </li><li> Para contar as células, transferir 125 ul de 0,4% solução de azul de Trypan a um tubo de 1,5 ml. Adicionar 75 ul de M199 e 50 ul da suspensão de células obtida na última etapa (factor de diluição = 5). Homogeneizar. </li><li> Use uma ponta de micropipeta para place cerca de 10 uL da suspensão de células com azul de Tripano na câmara de hemocitómetro. </li><li> Contar as células no contador hemocitómetro utilizando um microscópio invertido com iluminação de contraste de fase. Contagem de todas as células, na praça central 1 mm e quatro esquinas 1 mm. Obter a densidade de células por mililitro multiplicando a contagem média por metro quadrado por o factor de diluição, -. 10 4 Por exemplo, se as contagens médias por quadrados é de 45 células x 5 x 104 = 2,25 x 106 células / ml. Nota: Contar as células em dez praças da câmara de hemocitômetro. Não conte células que tocam na linha do meio em lados direito e inferior. </li><li> Semente 35.000 células em lamelas de vidro de 13 mm de diâmetro cobertos com poli-D-lisina. </li></ol> 5. citoesqueleto de actina Arranjo <ol><li> Após 48 h em cultura, remover o meio de cultura com uma pipeta de Pasteur e adicionar rapidamente 500 ul por lamela de PBS, imediatamente remover o PBS. </li><li> Corrigir e permeabilizar tele células com 500 ul por lamela de tampão de fixação (0,1 M Pipes, pH 6,75, 4% de PEG-6000, EGTA 1 mM, MgSO 1 mM de 4, 0,5% de Triton X-100 e 2% de formaldeído) durante 10 min a 37 ° C </li><li> Remover o tampão de fixação e adicionar 500 ul por lamela de 3,5% de paraformaldeído em PBS durante 30 min à TA. Remover a solução de paraformaldeído. </li><li> Lavam-se as lamelas três vezes por adição de 500 ul por lamela de PBS durante 5 min cada. Lavar as lamelas à temperatura ambiente, com agitação constante. </li><li> Incubam-se as células com cloreto de amónio a 50 mM durante 10 min, aspirar a solução de cloreto de amónio e repetir o passo 5.4. </li><li> Incubam-se as células com 1% de BSA (IgG-livre, livre-proteases) em PBS durante 30 min, remover a solução de BSA e repetir o passo 5.4. </li><li> Incubar as células com 50 mM de phalloidin rodamina conjugada de 7 min a RT, repita o passo 5.4. </li><li> Incubam-se as células com 255 ^ M de DAPI diluído em PBS durante 5 min à temperatura ambiente, repita a etapa 5.4. Finalmente montar tele lamelas com um meio de montagem e selá-los com unha polonês. </li><li> Adquirir imagens dos acordos de actina do citoesqueleto, utilizando um microscópio confocal de varrimento laser com um objetivo 63X, em 541 nm de comprimento de onda de excitação. </li></ol>

<ol>
	<li>Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogels+as+Extracellular+Matrix+Mimics+for+3D+Cell+Culture.">Hydrogels as Extracellular Matrix Mimics for 3D Cell Culture.</a> Biotechnol. Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).</li><li>Amsden, B., Turner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+characteristics+of+calcium+alginate+gels.">Diffusion characteristics of calcium alginate gels.</a> Biotechnol. Bioeng. 65 (5), 605-610 (1999).</li><li>Andersen, T., Strand, B., Formo, K., Alsberg, E., Christensen, B., Rauter, A. P., Lindhorst, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alginates+as+biomaterials+in+tissue+engineering.">Alginates as biomaterials in tissue engineering.</a> Carbohydrate chemistry. Vol. 37, 227-258 (2012).</li><li>Jonitz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+capacity+of+human+chondrocytes+embedded+in+alginate+matrix.">Differentiation capacity of human chondrocytes embedded in alginate matrix.</a> Connect. Tissue. Res. 52 (6), 503-551 (2011).</li><li>Hill, E., Boontheekul, T., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+scaffolds+to+enhance+transplanted+myoblast+survival+and+migration.">Designing scaffolds to enhance transplanted myoblast survival and migration.</a> Tissue. Eng. 12 (5), 1295-1304 (2006).</li><li>Purcell, E. K., Singh, A., Kipke, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alginate+composition+effects+on+a+neural+stem+cell-seeded+scaffold.">Alginate composition effects on a neural stem cell-seeded scaffold.</a> Tissue. Eng. Part. C. Methods. 15 (4), 541-550 (2009).</li><li>Wee, S., Gombotz, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+release+from+alginate+matrices.">Protein release from alginate matrices.</a> Adv. Drug. Deliv. Rev. 31 (4), 267-285 (1998).</li><li>Tashjian, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+strains+of+hormone-producing+pituitary+cells.">Clonal strains of hormone-producing pituitary cells.</a> Methods. Enzymol. 58, 527-535 (1979).</li><li>Fasekas, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+human+pituitary+adenomas+in+cell+cultures+by+light+and+electron+microscopic+morphology+and+immunolabeling.">Characterization of human pituitary adenomas in cell cultures by light and electron microscopic morphology and immunolabeling.</a> Folia. Histochem. Cytobiol. 43 (2), 81-90 (2005).</li><li>Kohler, P. O., Bridson, W. E., Rayford, P. L., Kohler, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormone+Production+by+Human+Pituitary+Adenomas+in+Culture.">Hormone Production by Human Pituitary Adenomas in Culture.</a> Metabolism. 18 (9), 782-788 (1969).</li><li>Kletzkky, O. A., Marrs, R. P., Rundall, T. T., Weiss, M. H., Beierle, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monolayer+and+suspension+culture+of+human+prolactin-secreting+pituitary+adenoma.">Monolayer and suspension culture of human prolactin-secreting pituitary adenoma.</a> Am. J. Obstet. Gynecol. 138 (6), 660-664 (1980).</li><li>Melmed, S., Odenheimer, D., Carlson, H. E., Hershman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+functional+human+pituitary+tumor+cell+cultures.">Establishment of functional human pituitary tumor cell cultures.</a> In Vitro. 18 (1), 35-42 (1982).</li><li>Thompson, K. W., Vincent, M. M., Jensen, F. C., Price, R. T., Schapiro, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+hormones+by+human+anterior+pituitary+cells+in+serial+culture.">Production of hormones by human anterior pituitary cells in serial culture.</a> Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 102 (2), 403-408 (1959).</li><li>Cappabianca, P., Cavallo, L. M., Solari, D., Stagno, V., Esposito, F., de Angelis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoscopic+endonasal+surgery+for+pituitary+adenomas.">Endoscopic endonasal surgery for pituitary adenomas.</a> World neurosurg. 82 (6 Suppl), S3-S11 (2014).</li><li>Aplin, J., Curtis, A. S. G., Lackie, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+Matrices+for+Studing+Cell+Adhesion.">Model Matrices for Studing Cell Adhesion.</a> Measuring cell adhesion. , 110-111 (1991).</li><li>Guiraud, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+prolactin-producing+pituitary+adenomas+in+three-dimensional+culture.">Human prolactin-producing pituitary adenomas in three-dimensional culture.</a> In. Vitro. Cell. Dev. Biol. 27 (3), 188-190 (1991).</li><li>Ma, H. L., Hung, S. C., Lin, S. Y., Chen, Y. L., Lo, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondrogenesis+of+human+mesenchymal+stem+cells+encapsulated+in+alginate+beads.">Chondrogenesis of human mesenchymal stem cells encapsulated in alginate beads.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 64 (2), 273-281 (2003).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Este protocolo tem várias etapas críticas. A primeira é a homogeneidade do grânulo de tamanho, o que é necessário para manter as mesmas condições de difusão de nutrientes e gases em toda a cultura de células. Na nossa experiência, a utilização de uma agulha de 21 G para fazer as esferas de alginato permite a aquisição de uma cultura eficiente de tamanho uniforme do grânulo. O segundo factor importante é a distância a partir da agulha; esta distância deve ser superior a 5 cm da solução de cálcio para evitar pérolas deformadas e as células mortas devido à colisão do fluxo da solução de alginato / célula com a superfície da solução de cálcio. Um terceiro passo é crítico da agitação de vidro em que as pérolas são eliminadas para evitar que eles se colem uns aos outros. Degola resultado em encapsulamento de células irregulares. Algumas modificações para este protocolo pode ser realizada, dependendo da questão de pesquisa, por exemplo, em nossa experiência a solução de alginato de sódio pode ser misturado wom uma proteína da membrana basal, como o colagénio do tipo IV, e seguindo o protocolo anteriormente descrito, obter um andaime alginato tridimensional. Outra possibilidade é fazer almofadas de alginato em poços de 15 mm de diâmetro flutuante; no interior destes geles, as células podem ser semeadas por cima ou dentro delas. Solução de problemas ao trabalhar com o alginato poderia ser necessário se qualquer experiência particular precisa de modificações em suas Ca 2+ ou Mg 2+. Isto é porque a estabilidade de hidrogel pode ser alterada. Ba2 + -e Cu2 + -crosslinked geles de alginato são relativamente estáveis ​​em soluções aquosas, infelizmente, estes catiões são frequentemente citotóxicas 3. Quando se trabalha com tecidos de tumor, tais como tecidos de adenoma pituitário, uma limitação desta técnica é a pequena amostra de tecido fornecida. Portanto, o número de contas de alginato obtida depende do tamanho da amostra de tecido. Anteriormente, um sistema demanter as células adenoma pituitário em uma cultura tridimensional foi descrito. Os autores submeteram as células a gyratory agitação para formar agregados e manteve as células nesta condição por diferentes períodos de 16. A utilização desta cultura em suspensão de células requer equipamento giratório no interior da câmara de cultura. Uma vantagem do protocolo aqui descrito é que permite a cultura de células em um sistema tridimensional sem a necessidade de equipamento de laboratório extra. As células incorporados no sistema de alginato tridimensional são mantidas numa incubadora normal dentro de um frasco normal. Outra vantagem é que o andaime alginato, em contraste com outros sistemas tridimensionais, permite que as células a ser libertado a partir do hidrogel para uma investigação mais aprofundada 7. Além disso, um aspecto importante da cultura de células em drageias de alginato é que as células incorporadas na presente sistema é capaz de sintetizar matriz extracelular de novo. Uma alternativamétodo para o estudo de células embebidas em alginato é a fixação das drageias de alginato, seguida da sua desidratação com concentrações crescentes de polietilenoglicol para o seccionamento subsequente e imuno-histoquímica analisa 17. Estamos interessados ​​no futuro para aplicar o sistema de contas de alginato tridimensional para células pituitária de ratos normais de cultura primária incorporados a fim de analisar suas interações em um ambiente tridimensional, e também para a cultura outro tipo de adenomas hipofisários.

Andaimes tridimensionais têm sido extensivamente utilizados em cultura de células porque proporcionam um suporte estrutural tridimensional de células de cultura e a manutenção de uma comunicação célula-a-célula. materiais poliméricos naturalmente derivados têm sido usados ​​para fazer suportes tridimensionais, incluindo colagénio do tipo I, a quitosana e alginato. O alginato é um polímero natural derivado do Macrocystispyrifera de algas marinhas castanhas (alga marinha). Este polímero é composto por unidades repetidas de ácido D-manurónico β-(M) e L-α-gulurónico ácido (L) 2 e forma geles estáveis ​​na presença de determinados catiões bivalentes, tais como cálcio e bário. Cloreto de cálcio (CaCl2) soluções são vulgarmente utilizados como o reagente de reticulação para formar as drageias de alginato. Soluções de alginato caiu em CaCl2 formar imediatamente géis esféricas tridimensionais. Quando a solução de alginato é misturada com as células, as células são encapsuladas em alginato bEADS 3. O alginato tem propriedades que permitiram que ele seja utilizado como uma matriz para a encapsulação de uma grande variedade de células, incluindo condrócitos, mioblastos 4 5 esqueléticos e as células estaminais neurais 6. É um material inerte e permite a difusão de nutrientes, oxigénio e produtos metabólicos que manter a sobrevivência e função de células; Além disso, ao contrário de outros sistemas de cultura à base de gel, células cultivadas dentro de drageias de alginato pode também ser libertado a partir do andaime usando quelantes de cálcio, tais como citrato de sódio, e, em seguida, as células podem ser colhidas para investigações adicionais 7. adenomas hipofisários são tipicamente tumores benignos com taxas de proliferação baixos. Linhas de células de pituitária de rato adenoma foram cultivadas com sucesso num sistema bidimensional de 8. No entanto, esta cultura de células de tumores humanos de secreção pituitária não é um desenvolvimento eficiente; células de pituitária tumor dispersos crescem malem cultura, as células exibem ligação limitada e difusão, e as células formam tipicamente agregados que flutuam na placa de cultura de 9,10. Várias tentativas têm sido feitas para se obter uma suspensão de células de tumor da pituitária, incluindo uma abordagem enzimática e dispersão mecânica 11, uma abordagem dispersão unicamente mecânica 12 e a cultura de explantes de tumores 10. Com estas abordagens, diferentes autores obtiveram culturas aderentes viáveis ​​para diferentes períodos de tempo. As capacidades das células secretoras do tumor para sobreviver em tais sistemas bidimensionais dependem do tipo de tumor e as suas taxas de proliferação 9. No entanto, em culturas a longo prazo, as células de fibroblastos com fenótipos predominam 11,13. Este artigo descreve um método para a obtenção de uma cultura primária de células de adenoma pituitário encapsuladas em pérolas de alginato que liberta-los ainda mais a partir do alginato de andaime que permite análises detalhadas deaspectos de sua biologia celular, por exemplo, seus arranjos do citoesqueleto.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1019">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:401px;">Reagent&#160;</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">199 culture medium&#160;</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>31100-027</td>
			<td>For culture, warm in a 37 &#176;C water bath before use&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal bovine serum&#160;</td>
			<td>PAA</td>
			<td>A15-751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Sodium bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">N-(2-Hydroxyethyl) piperazine-N&#180;-2ethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>H-4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>PAA</td>
			<td>P11-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS (Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline)</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>21600-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Collagenase type I</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>4176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin&#160;</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>27250-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Research Organics</td>
			<td>3002E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sorbean trypsin inhibitor&#160;</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>17075-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DNAse</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>2139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Alginic acid, From Macrocystis Pyrifera (Kelp)</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>A-2158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>1332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium citrate (Na3C6H5O7)</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>3646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Piperazine-N,N&#8242;-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES)</td>
			<td>Research Organics</td>
			<td>9624P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Polyethylene Glycol 6000 (PEG 6000)</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>528877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA)</td>
			<td>Research Organics</td>
			<td>9574E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Magnesium Sulfate (MgSO4)</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triton-X 100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Formaldehyde</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>2106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Ammonium chloride (NH4Cl)</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BSA Bovine Serum Albumin IgG-Free</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>001-000-161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phalloidin&#8211;Tetramethylrhodamine B isothiocyanate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1951</td>
			<td>Toxic. Use gloves to handle this reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI)</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>D1306</td>
			<td>Toxic. Use gloves to handle this reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Sulfuric acid (H2SO4)</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>9681</td>
			<td>Highly corrosive. Use gloves to handle this reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium hydroxide (NAOH)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.06498</td>
			<td>Can cause eye and skin irritation.Use gloves to handle this reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">(3-Aminopropyl)triethoxysilane (APTS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-3648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Poly-D-lysine hydrobromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypan blue solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8154&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Name&#160;&#160;</td>
			<td>Company&#160;</td>
			<td>Catalog Number&#160;</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Equipment&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Toxic: May cause cancer. Use gloves to handle this reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Rotator&#160;</td>
			<td>Boekel Scientific</td>
			<td>Model 230300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Centrifuge</td>
			<td>DuPont Corporation&#160;</td>
			<td>Model sorvall TC6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">shaker&#160;</td>
			<td>Lab-line Instruments</td>
			<td>Model 314-820&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional alginate-bead culture of human pituitary adenoma cells

Um método de cultura tridimensional é descrito em que as células adenoma pituitário primário são cultivadas em drageias de alginato. O alginato é um polímero derivado de algas marinhas castanhas. Resumidamente, o tecido tumoral é cortado em pequenos pedaços e submetidas a uma digestão enzimática com colagenase e tripsina. Em seguida, uma suspensão de células é obtida. A suspensão de células tumorais é misturado com 1,2% de alginato de sódio e vertida numa solução de CaCl 2, e a suspensão de alginato / célula é gelificada em contacto com o CaCl2 para formar grânulos esféricos. As células embebidas nas drageias de alginato são fornecidos com nutrientes fornecidos pelos meios de cultura enriquecido com 20% de FBS. cultura tridimensional em drageias de alginato mantém a viabilidade das células de adenoma por longos períodos de tempo, até quatro meses. Além disso, as células podem ser libertados a partir do alginato por lavagem das pérolas com citrato de sódio e semeadas em lamelas de vidro para posteriores análises imunocitoquímicas. O uso de um celModelo L cultura permite a fixação e a visualização do citoesqueleto de actina com desorganização mínima. Em resumo, as drageias de alginato proporcionam um sistema de cultura de confiança para a manutenção de células de adenoma pituitário.

Este protocolo foi aplicado com sucesso na cultura e a manutenção de células de adenoma pituitário em drageias de alginato para diferentes períodos de tempo, A Figura 1 mostra células incorporados em drageias de alginato depois de três meses.; estas células exibem formas arredondadas bi-refracção sob um microscópio de luz invertida (Figura 1). A Figura 2 mostra a localização de N-caderina em células de adenoma pituitária de rato embebidos em alginato. O N-caderina é localizada em contatos célula-célula (Figura 2A e 2C) e o núcleo mostrou cromatina estendida (Figura 2B e 2C). As células tumorais em gotas de alginato permanecer viáveis ​​por até 4 meses em cultura; Portanto, as células podem ser libertados a partir das drageias de alginato em momentos diferentes, o que permite a análise de diferentes aspectos dabiologia celular na mesma cultura de células. Por exemplo, o Índice de proliferação foi obtida a partir de dez não-funcionamento adenomas pituitários humanos utilizando a imuno-reactividade para o Ki-67, e um índice de marcação média de 19,2 ± 1,5% (média ± SEM) foi obtido. A Figura 3 mostra pituitária humana cultivadas células de adenoma imunomarcadas para Ki-67. Os citoesqueleto de actina de células de um não-invasivo foram coradas de acordo com o protocolo de imunocitoquímica descrever acima. Células de cultura exibiu formas alongadas com pequenas fibras de stress de actina (Figura 4A) .Os morfologias e arranjos de filamentos de actina variaram com o adenoma pituitário independente do sistema de cultura; Por exemplo, em um adenoma invasiva não-funcionamento, a forma predominante entre estas células foi arredondado com um arranjo dos seus filamentos de actina em anéis corticais descontínuos. (Figura 4B). Figura 1. Células incorporadas em gotas de alginato por 3 meses. As células apresentam formas arredondadas bi-refração sob um microscópio de luz invertida. Nas células Macroadenoma invasiva painel direito embutidos em alginato são mostradas, e no painel esquerdo células macroadenoma não-invasivos são mostrados. Barra de escala = 15 mm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53637/53637fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53637/53637fig2.jpg" /> Figura 2. A análise imuno-citoquímica de N-caderina nas células de adenoma pituitária de rato (GH3) cultura em drageias de alginato. GH3 células foram cultivadas em alginato, fixa incorporada no sistema de alginato coradas para N-caderina (vermelho) e o núcleo (azul ). As células são organizar em um cumulus mostrando N-caderina nas fronteiras célula-célula (A e C). O núcleo (B e C) são mostrados com a cromatina estendida. Barra de escala = 15 mm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53637/53637fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53637/53637fig3.jpg" /> Figura 3. A imunocoloração de Ki-67-células humanas antígeno nuclear cultivadas adenomas hipofisários. Após 2,5 meses em cultura talão de alginato, células de adenoma não-funcionantes invasivos foram fixados e, em seguida, histoquímica para Ki-67 (vermelho) e o núcleo (azul). Algumas células de adenoma mostrar imunocoloração positiva para Ki-67. Barra de escala = 15 mm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53637/53637fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> &lt;p class = &quot;jove_content&quot; fo: manter-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53637/53637fig4.jpg" /> Figura 4. Modalidades de citoesqueleto de actina de células adenomas hipofisários libertados das pérolas de alginato. As células foram fixadas e coradas para a actina filamentos com TRITC-faloidina. As células a partir de uma Macroadenoma não-invasiva foram estendidas sobre o substrato, que mostra as pequenas fibras de stress de actina (A). As células a partir de uma Macroadenoma invasivo mostraram uma forma arredondada com anéis de actina descontínuas (B). Barra de escala = 15 mm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53637/53637fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Three-dimensional Alginate-bead Culture of Human Pituitary Adenoma Cells at JoVE.com

Three-dimensional Alginate-bead Culture of Human Pituitary Adenoma Cells

Three-dimensional culture in alginate beads, due to its simplicity and reproducibility, was chosen to maintain the pituitary adenoma cells. The procedures included an initial enzymatic digestion and mechanical dissociation of the tumor tissue, and the subsequent cell suspension was encapsulated in alginate beads.

Tridimensional Cultura alginato-talão de células humanas adenoma pituitário

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from ...

three-dimensional-alginate-bead-culture-human-pituitary-adenoma

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

9.9K visualizações.  Center for Research and Advanced Studies (CINVESTAV-IPN). Three-dimensional culture in alginate beads, due to its simplicity and reproducibility, was chosen to maintain the pituitary adenoma cells. The procedures included an initial enzymatic digestion and mechanical dissociation of the tumor tissue, and the subsequent cell suspension was encapsulated in alginate beads.

Vídeo: Three-dimensional Alginate-bead Culture of Human Pituitary Adenoma Cells

Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human malignancies.1 Other than surgery for the minority of patients who present with localized disease, there is little or no survival benefit of systemic therapy. Therefore, there is a great need to better understand the biology of NETs, and in particular define new therapeutic targets for patients with nonresectable or metastatic neuroendocrine tumors. 3D cell culture is becoming a popular method for drug screening due to its relevance in modeling the in vivo tumor tissue organization and microenvironment.2,3 The 3D multicellular spheroids could provide valuable information in a more timely and less expensive manner than directly proceeding from 2D cell culture experiments to animal (murine) models.
To facilitate the discovery of new therapeutics for NET patients, we have developed an in vitro 3D multicellular spheroids model using the human NET cell lines. The NET cells are plated in a non-adhesive agarose-coated 24-well plate and incubated under physiological conditions (5% CO2, 37 &deg;C) with a very slow agitation for 16-24 hr after plating. The cells form multicellular spheroids starting on the 3rd or 4th day. The spheroids become more spherical by the 6th day, at which point the drug treatments are initiated. The efficacy of the drug treatments on the NET spheroids is monitored based on the morphology, shape and size of the spheroids with a phase-contrast light microscope. The size of the spheroids is estimated automatically using a custom-developed MATLAB program based on an active contour algorithm. Further, we demonstrate a simple method to process the HistoGel embedding on these 3D spheroids, allowing the use of standard histological and immunohistochemical techniques. 
This is the first report on generating 3D spheroids using NET cell lines to examine the effect of therapeutic drugs. We have also performed histology on these 3D spheroids, and displayed an example of a single drug's effect on growth and proliferation of the NET spheroids. Our results support that the NET spheroids are valuable for further studies of NET biology and drug development.

We present a simple agarose overlay platform to grow 3D multicellular spheroids using neuroendocrine cancer cell lines. This method provides a very convenient way to examine the effect of therapeutic drugs on the neuroendocrine tumor cells. It could also help us establish human neuroendocrine tumor spheroids for cancer therapy.

Humanos Linhas tumor neuroendócrino de células como um modelo tridimensional para o estudo da terapia de tumores humanos Neuroendócrino

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

Medicina

Three-dimensional Imaging of Nociceptive Intraepidermal Nerve Fibers in Human Skin Biopsies

A punch biopsy of the skin is commonly used to quantify intraepidermal nerve fiber densities (IENFD) for the diagnosis of peripheral polyneuropathy 1,2. At present, it is common practice to collect 3 mm skin biopsies from the distal leg (DL) and the proximal thigh (PT) for the evaluation of length-dependent polyneuropathies 3. However, due to the multidirectional nature of IENFs, it is challenging to examine overlapping nerve structures through the analysis of two-dimensional (2D) imaging. Alternatively, three-dimensional (3D) imaging could provide a better solution for this dilemma.
In the current report, we present methods for applying 3D imaging to study painful neuropathy (PN). In order to identify IENFs, skin samples are processed for immunofluorescent analysis of protein gene product 9.5 (PGP), a pan neuronal marker. At present, it is standard practice to diagnose small fiber neuropathies using IENFD determined by PGP immunohistochemistry using brightfield microscopy 4. In the current study, we applied double immunofluorescent analysis to identify total IENFD, using PGP, and nociceptive IENF, through the use of antibodies that recognize tropomyosin-receptor-kinase A (Trk A), the high affinity receptor for nerve growth factor 5. The advantages of co-staining IENF with PGP and Trk A antibodies benefits the study of PN by clearly staining PGP-positive, nociceptive fibers. These fluorescent signals can be quantified to determine nociceptive IENFD and morphological changes of IENF associated with PN. The fluorescent images are acquired by confocal microscopy and processed for 3D analysis. 3D-imaging provides rotational abilities to further analyze morphological changes associated with PN. Taken together, fluorescent co-staining, confocal imaging, and 3D analysis clearly benefit the study of PN.

In order to study the changes of nociceptive intraepidermal nerve fibers (IENFs) in painful neuropathies (PN), we developed protocols that could directly examine three-dimensional morphological changes observed in nociceptive IENFs. Three-dimensional analysis of IENFs has the potential to evaluate the morphological changes of IENF in PN.

Imagem tridimensional de nociceptivos Fibras Nervosas intraepidérmicos em biópsias de pele humana

A punch biopsy of the skin is commonly used to quantify intraepidermal nerve fiber densities (IENFD) for the diagnosis of peripheral polyneuropathy 1,2. ...

A Three-dimensional Tissue Culture Model to Study Primary Human Bone Marrow and its Malignancies

Tissue culture has been an invaluable tool to study many aspects of cell function, from normal development to disease. Conventional cell culture methods rely on the ability of cells either to attach to a solid substratum of a tissue culture dish or to grow in suspension in liquid medium. Multiple immortal cell lines have been created and grown using such approaches, however, these methods frequently fail when primary cells need to be grown ex vivo. Such failure has been attributed to the absence of the appropriate extracellular matrix components of the tissue microenvironment from the standard systems where tissue culture plastic is used as a surface for cell growth. Extracellular matrix is an integral component of the tissue microenvironment and its presence is crucial for the maintenance of physiological functions such as cell polarization, survival, and proliferation. Here we present a 3-dimensional tissue culture method where primary bone marrow cells are grown in extracellular matrix formulated to recapitulate the microenvironment of the human bone (rBM system). Embedded in the extracellular matrix, cells are supplied with nutrients through the medium supplemented with human plasma, thus providing a comprehensive system where cell survival and proliferation can be sustained for up to 30 days while maintaining the cellular composition of the primary tissue. Using the rBM system we have successfully grown primary bone marrow cells from normal donors and patients with amyloidosis, and various hematological malignancies. The rBM system allows for direct, in-matrix real time visualization of the cell behavior and evaluation of preclinical efficacy of novel therapeutics. Moreover, cells can be isolated from the rBM and subsequently used for in vivo transplantation, cell sorting, flow cytometry, and nucleic acid and protein analysis. Taken together, the rBM method provides a reliable system for the growth of primary bone marrow cells under physiological conditions.

In standard culture methods cells are taken out of their physiological environment and grown on the plastic surface of a dish. To study the behavior of primary human bone marrow cells we created a 3-D culture system where cells are grown under conditions recapitulating the native microenvironment of the tissue.

A Cultura de Tecidos modelo tridimensional para estudar primária da medula óssea humana e suas Malignancies

Tissue culture has been an invaluable tool to study many aspects of cell function, from normal development to disease. Conventional cell culture methods ...

Three Dimensional Cultures: A Tool To Study Normal Acinar Architecture vs. Malignant Transformation Of Breast Cells

Invasive breast carcinomas are a group of malignant epithelial tumors characterized by the invasion of adjacent tissues and propensity to metastasize. The interplay of signals between cancer cells and their microenvironment exerts a powerful influence on breast cancer growth and biological behavior1. However, most of these signals from the extracellular matrix are lost or their relevance is understudied when cells are grown in two dimensional culture (2D) as a monolayer. In recent years, three dimensional (3D) culture on a reconstituted basement membrane has emerged as a method of choice to recapitulate the tissue architecture of benign and malignant breast cells. Cells grown in 3D retain the important cues from the extracellular matrix and provide a physiologically relevant ex&#160;vivo system2,3. Of note, there is growing evidence suggesting that cells behave differently when grown in 3D as compared to 2D4. 3D culture can be effectively used as a means to differentiate the malignant phenotype from the benign breast phenotype and for underpinning the cellular and molecular signaling involved3. One of the distinguishing characteristics of benign epithelial cells is that they are polarized so that the apical cytoplasm is towards the lumen and the basal cytoplasm rests on the basement membrane. This apico-basal polarity is lost in invasive breast carcinomas, which are characterized by cellular disorganization and formation of anastomosing and branching tubules that haphazardly infiltrates the surrounding stroma. These histopathological differences between benign gland and invasive carcinoma can be reproduced in 3D6,7. Using the appropriate read-outs like the quantitation of single round acinar structures, or differential expression of validated molecular markers for cell proliferation, polarity and apoptosis in combination with other molecular and cell biology techniques, 3D culture can provide an important tool to better understand the cellular changes during malignant transformation and for delineating the responsible signaling.

Three dimensional culture of mammary epithelial cells on a reconstituted basement membrane is a useful method to recapitulate the in vivo architecture of the benign breast, and to differentiate the malignant phenotype from the benign breast phenotype. Importantly, this system can be applied to study invasive carcinomas in other tissues.

Três Culturas dimensionais: Uma ferramenta para o estudo normal Acináceo Arquitetura vs transformação maligna das células de mama

Invasive breast carcinomas are a group of malignant epithelial tumors characterized by the invasion of adjacent tissues and propensity to metastasize. The ...

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional (3D) Model

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the extracellular matrix (ECM) has been demonstrated to be a critical regulator of cell behavior in culture and homeostasis in vivo. The current approach of culturing cells on two-dimensional (2D), plastic surfaces results in the disturbance and loss of complex interactions between cells and their microenvironment. Through the use of three-dimensional (3D) culture assays, the conditions for cell-microenvironment interaction are established resembling the in vivo microenvironment. This article provides a detailed methodology to grow breast cancer cells in a 3D basement membrane protein matrix, exemplifying the potential of 3D culture in the assessment of cell invasion into the surrounding environment. In addition, we discuss how these 3D assays have the potential to examine the loss of signaling molecules that regulate epithelial morphology by immunostaining procedures. These studies aid to identify important mechanistic details into the processes regulating invasion, required for the spread of breast cancer.

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional 3D Model

This article provides detailed methodologies for the use of three-dimensional (3D) assays to quantify breast cancer cell invasion. Specifically, we discuss the procedures required to set up such assays, quantification, and data analysis, as well as methods to examine the loss of membrane integrity that occurs when cells invade.

Quantificação de cancro da mama invasiva das células usando um modelo (3D) tridimensional

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the ...

Three-dimensional Co-culture Model for Tumor-stromal Interaction

Cancer progression (initiation, growth, invasion and metastasis) occurs through interactions between malignant cells and the surrounding tumor stromal cells. The tumor microenvironment is comprised of a variety of cell types, such as fibroblasts, immune cells, vascular endothelial cells, pericytes and bone-marrow-derived cells, embedded in the extracellular matrix (ECM). Cancer-associated fibroblasts (CAFs) have a pro-tumorigenic role through the secretion of soluble factors, angiogenesis and ECM remodeling. The experimental models for cancer cell survival, proliferation, migration, and invasion have mostly relied on two-dimensional monocellular and monolayer tissue cultures or Boyden chamber assays. However, these experiments do not precisely reflect the physiological or pathological conditions in a diseased organ. To gain a better understanding of tumor stromal or tumor matrix interactions, multicellular and three-dimensional cultures provide more powerful tools for investigating intercellular communication and ECM-dependent modulation of cancer cell behavior. As a platform for this type of study, we present an experimental model in which cancer cells are cultured on collagen gels embedded with primary cultures of CAFs.

Here we present a protocol to co-culture in three-dimensions, which is useful for investigating multicellular interactions and extracellular matrix-dependent modulation of cancer cell behavior. In this experimental model, cancer cells are cultured on collagen gels embedded with human cancer-associated fibroblasts.

Tridimensional modelo de co-cultura para Interaction Tumor estromal-

Cancer progression (initiation, growth, invasion and metastasis) occurs through interactions between malignant cells and the surrounding tumor stromal ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in particular (e.g., brain tumors such as glioblastoma multiforme and squamous cell carcinoma of the head and neck &#8211; SCCHN) it is a cause of severe morbidity and can be life-threatening even in the absence of distant metastases. In addition, cancers which have relapsed following treatment unfortunately often present with a more aggressive phenotype. Therefore, there is an opportunity to target the process of invasion to provide novel therapies that could be complementary to standard anti-proliferative agents. Until now, this strategy has been hampered by the lack of robust, reproducible assays suitable for a detailed analysis of invasion and for drug screening. Here we provide a simple micro-plate method (based on uniform, self-assembling 3D tumor spheroids) which has great potential for such studies. We exemplify the assay platform using a human glioblastoma cell line and also an SCCHN model where the development of resistance against targeted epidermal growth factor receptor (EGFR) inhibitors is associated with enhanced matrix-invasive potential. We also provide two alternative methods of semi-automated quantification: one using an imaging cytometer and a second which simply requires standard microscopy and image capture with digital image analysis.

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.

Tridimensional (3D) Tumor Esferóide Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

Three-Dimensional Culture Assay to Explore Cancer Cell Invasiveness and Satellite Tumor Formation

Mammalian cell culture in monolayers is widely used to study various physiological and molecular processes. However, this approach to study growing cells often generates unwanted artifacts. Therefore, cell culture in a three-dimensional (3D) environment, often using extracellular matrix components, emerged as an interesting alternative due to its close similarity to the native in vivo tissue or organ. We developed a 3D cell culture system using two compartments, namely (i) a central compartment containing cancer cells embedded in a collagen gel acting as a pseudo-primary macrospherical tumor and (ii) a peripheral cell-free compartment made of a fibrin gel, i.e. an extracellular matrix component different from that used in the center, in which cancer cells can migrate (invasion front) and/or form microspherical tumors representing secondary or satellite tumors. The formation of satellite tumors in the peripheral compartment is remarkably correlated to the known aggressiveness or metastatic origin of the native tumor cells, which makes this 3D culture system unique. This cell culture approach might be considered to assess cancer cell invasiveness and motility, cell-extracellular matrix interactions and as a method to evaluate anti-cancer drug properties.

Cancer cells are embedded in a collagen gel and then sandwiched in an acellular fibrin gel to generate a 3D culture system in which the invasiveness and formation of satellite tumors may be monitored.

Tridimensional Cultura Ensaio para Explorar Cancer Invasividade celular e formação de tumor Satélite

Mammalian cell culture in monolayers is widely used to study various physiological and molecular processes. However, this approach to study growing cells ...

Three-Dimensional Printing of a Complex Aortic Anomaly

Complex congenital aortic anomalies include diverse types of malformations that may be clinically asymptomatic or present with respiratory or esophageal symptoms. These anomalies may be associated with other congenital heart diseases. It is hard to identify the accurate anatomic vessel location from two-dimensional imaging data, such as computed tomography. As an additive manufacturing method, three-dimensional (3-D) printing can covert the acquired imaging data into 3-D physical models. This protocol describes the procedure for modeling the volumetric DICOM imaging into 3-D data and printing it as an anatomically realistic 3-D model. Using this model, surgeons can identify the vessel location of complex aortic anomalies, which is helpful for pre-operative planning and intra-operative guidance.

Here, we present a protocol to use three dimensional printed models for pre-operative planning and intra-operative reorganization of complicated vascular locations when handling a congenital aortic anomaly.

Impressão tridimensional de uma anomalia complexa da aorta

Complex congenital aortic anomalies include diverse types of malformations that may be clinically asymptomatic or present with respiratory or esophageal ...

Three-Dimensional Printing Guide Template Assisted Percutaneous Vertebroplasty (PVP)

Percutaneous vertebroplasty (PVP) is considered an effective treatment for the back pain caused by osteoporotic vertebral compression fracture. The accuracy of PVP mainly depends on the surgeons&#39; experience and multiple fluoroscopes during a traditional procedure. Puncture related complications were reported all over the world. To make the surgical procedure more precise and decrease the rate of puncture-related complications, our team applied a three-dimensional printing guide template to PVP to modify the traditional procedure. This protocol introduces how to model target vertebrae DICOM imaging data into three-dimensions in the software, how to simulate operation in this 3-D model, and how to use all of the surgical data to reconstruct a patient specific template for application. Using this template, surgeons can identify suitable puncture points accurately to improve the accuracy of the operation. The whole protocol includes: 1) diagnosis of the osteoporotic vertebral compression fracture; 2) acquisition of CT imaging of the target vertebra; 3) simulation of the operation in the software; 4) design and fabrication of the 3-D printing guide template; and 5) application of the template into an operation procedure.

Three-Dimensional Printing Guide Template Assisted Percutaneous Vertebroplasty PVP

Herein, we present a three-dimensional printing guide template for percutaneous vertebraplasty. A patient with a T11 vertebral compression fracture was selected as a case study.

Modelo de guia de impressão tridimensional assistida Vertebroplastia Percutânea (PVP)

Percutaneous vertebroplasty (PVP) is considered an effective treatment for the back pain caused by osteoporotic vertebral compression fracture. The ...