Descrevemos estratégias e protocolos passo a passo para estabelecer organoides 3D em série derivados do câncer de próstata metastático. Nossos protocolos otimizados são práticos para configurar culturas 3D para experimentos usando material inicial limitado diretamente de pacientes ou tecidos tumorais de xenoenxerto derivados do paciente. Os organoides 3D deste protocolo podem ser usados como modelos ex vivo para entender mecanismos básicos da patologia do câncer de próstata metastático ósseo e para testar o tratamento.
A mídia de cultura organoide 3D neste protocolo é específica para células derivadas da próstata. Outras partes de nossos protocolos são aplicáveis a diferentes tipos de tecidos tumorais e locais metastáticos. A técnica de doming pode ser a parte mais difícil deste processo.
A prática da técnica de doming garantirá um tamanho consistente da mistura de organoides, mídia e Matrigel, e minimizará a formação de bolhas durante a suspensão da amostra. Demonstrar visualmente este método fornece uma melhor compreensão de como lidar com o Matrigel viscoso para culminar com sucesso organoides de menor densidade a partir de um baixo número de células. Comece reutilizando a pelota de célula no volume apropriado da membrana do porão para uma configuração de placa de 24 poços.
Pipeta para cima e para baixo suavemente para garantir que as células sejam resuspended, em seguida, pipeta o volume apropriado da suspensão celular para o centro de uma placa de cultura de tecido pré-aquecido. Inverta a placa e coloque-a imediatamente de cabeça para baixo na incubadora de cultura celular fixada a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 15 minutos. Pipeta o volume apropriado de meio pré-aquecido contendo 10 micromolar Y-27632 dihidrocloreto em cada poço.
Para formar uma cúpula flutuante da cúpula redonda anexada, retire a cúpula da placa usando um raspador de células. Corte um pedaço de dois por quatro polegadas de filme de parafina e coloque-o em cima dos divots de uma ponta vazia segurando rack de uma caixa de ponta de pipeta de plástico de um mililitro. Use um dedo indicador de luvas para pressionar suavemente o filme de parafina para rastrear os divots tomando cuidado para não romper o filme.
Pulverize o filme de parafina com 70% de etanol e ligue a lâmpada UV no capô da cultura celular para esterilizar o filme preparado por pelo menos 30 minutos. Enquanto isso, resuspense as células pré-processadas em 20 microliters de membrana do porão. Em seguida, pipeta a suspensão para os divots formados no filme de parafina.
Coloque as contas solidificadas e o filme de parafina em uma placa de seis poços e pipeta de três a cinco mililitros de meio pré-aquecido contendo 10 micromolar Y-27632 dihidrocloida em cada poço enquanto escova suavemente as contas do filme de parafina. Para processar os organoides para histologia, remova a mídia existente do poço tomando cuidado para não aspirar as cúpulas de membrana do porão. Adicione um volume igual de solução de recuperação celular e incubar a placa por 60 minutos a quatro graus Celsius.
Após a incubação, desaloja a cúpula da membrana do porão usando uma pipeta e esmague-a com uma ponta de pipeta. Colete a cúpula dissociada e a solução de recuperação celular em um tubo de 1,5 mililitro. Centrifugar o tubo a 300 vezes g em quatro graus Celsius por cinco minutos, em seguida, remova o supernante e reserve-o.
Guarde todos os supernantes até o passo final quando a presença de organoides for confirmada no volume desejado de PBS frio e pipeta suavemente para cima e para baixo para desalojar mecanicamente a pelota sem interromper os organoides. Repita a centrifugação e remova o sobrenatante. Fixar a pelota em um volume combinado de 4%PFA por 60 minutos em temperatura ambiente.
Após a fixação, repita a etapa de centrifugação e a lavagem do PBS. Em seguida, adicione lentamente 200 microliters de 2%de agarose quente e imediatamente, mas suavemente desprender a pelota celular da parede do tubo sem interrompê-la usando uma agulha de calibre 25 presa a uma seringa de um mililitro. Para o método de rotação de garose, é fundamental separar a pelota celular da parede do tubo logo após a adição de agarose usando uma agulha de calibre 25.
Uma vez que a agarose tenha se solidificado completamente, retire-a do tubo com uma agulha de calibre 25 presa a uma seringa de um mililitro e transfira-a para um novo tubo de 1,5 mililitro. Encha o tubo com 70% de etanol e proceda com o protocolo convencional de desidratação tecidual e incorporação de parafina. Este protocolo foi usado com sucesso para estabelecer organoides 3D de modelos de xenoenxerto derivados do paciente do câncer de próstata metastático ósseo, bem como diretamente do tecido cancerígeno.
Os organoides apresentaram diferentes fenótipos que se manifestaram como cistos, esferoides e organoides de maior complexidade. Uma cúpula inteira de membrana de porão e organoides pode ser vista em uma imagem costurada a partir de 25 imagens de ampliação de alta resolução e 10X. Para investigar melhor o tecido tumoral, a citoquímica imunofluorescente foi realizada em uma seção de cinco micrômetros de parafina de organoides visando o marcador de células epiteliais basais citokeratin-5, marcador de célula epitelial luminal cytokeratin-8 e DAPI.
Este protocolo pode ser otimizado para outras aplicações como manchas ocidentais, cocultura e citometria de fluxo para explorar características de organoides 3D e os efeitos dos tratamentos medicamentosos. Esses experimentos poderiam abordar mecanismos de resistência a medicamentos e a eficácia de novas terapêuticas isoladamente ou em combinação com as terapias atuais. Os organoides 3D desta técnica retêm heterogeneidade entre sujeitos e intra-sujeitos e, portanto, são um modelo mais preciso da doença em pacientes.
Essa técnica abre caminho para que os pesquisadores explorem mecanismos de resistência a medicamentos, tumorigênese, metástase e terapêutica que podem ser mais previsíveis da progressão da doença em pacientes e sua resposta à terapia.
