A microscopia de células vivas permite que os pesquisadores estudem a dinâmica nuclear da levedura de fissão em mitose e meiose em tempo real. A força deste método vem do estudo de processos nucleares em células vivas em condições fisiológicas normais que elimina a necessidade de fixações e manchas tóxicas. Esta técnica aborda questões relacionadas ao tempo de proteína, estabilidade e mobilidade que podem não ser favoráveis à manipulação genética ou biomecânica.
É fundamental prestar muita atenção à saúde e aptidão das células de levedura de fissão antes da imagem. Examine sempre as características de morfologia e crescimento para garantir a consistência dos resultados em experimentos. Este protocolo mostra a maneira relativamente simples de preparar slides de microscópio que, quando dominados corretamente, podem aumentar a consistência e a reprodutibilidade de imagens de células vivas prolongadas.
Para começar a pegar a matéria celular da placa de despertar criogênico, coloque-a nas placas SIM, e incuba-as a 25 graus Celsius ou 32 graus Celsius, dependendo do genótipo da levedura para acordar as cepas de leveduras de fissão da preservação criogênica. Em seguida, use um laço estéril para colher células de colônias individuais nas cepas de leveduras de fissão despertadas e inocula-las em tubos de ensaio contendo três mililitros de meio líquido YES. Coloque os tubos em um agitador a 150 a 220 rpm para crescer a 25 ou 32 graus Celsius durante a noite até a fase de tronco tardio com uma leitura de densidade óptica desejada de 0,7 a 1,0.
Transfira 10 microlitros da cultura para um deslizamento de microscópio. Coloque uma mancha de cobertura e coloque-a sob um microscópio para verificar se há morfologia celular adequada e estado nutricional. Para configurar um slide de microscópio para análise de mitose ou análise de meiose adicione primeiro dois gramas de agarose no frasco de 500 mililitros contendo 100 mililitros de médio mínimo mais suplementos para mitose ou meio de esporulação líquida para a meiase.
Aqueça a solução de agarose em um forno de micro-ondas a 60% de potência em incrementos de 10 segundos ou coloque o béquer em um banho de água de 55 graus Celsius por 10 minutos. Gire a solução para garantir um derretimento eficiente. Configure dois slides de microscópio em um suporte de ponta de pipeta com o slide superior apoiado em duas pilhas de fita de laboratório em ambas as extremidades como suporte fazendo uma forma cruzada.
Ajuste a distância entre os dois slides para maiores que dois milímetros, a fim de formar uma almofada grossa nas etapas seguintes para imagens prolongadas. Depois de resfriar a agarose derretida por um minuto à temperatura ambiente, remova o slide superior e use uma ponta de pipeta larga para distribuir 50 a 100 microliters no slide inferior para fazer uma mancha. Antes que a agarose esfrie coloque o slide superior em cima para gerar uma almofada de cerca de um e meio a dois centímetros de diâmetro.
A imagem de células vivas ideais é fundamental para etapas subsequentes de processamento de dados. Certifique-se de eliminar quaisquer bugigangas de ar na agarose derretida e crie uma almofada fina para períodos de imagem superiores a quatro horas. Para examinar eventos mitóticos, as células crescem a partir de culturas iniciais em EMM líquido ou PMG mais suplementos durante a noite.
Transfira um mililitro da cultura em um cuvette, e meça no espectotúmetro em um comprimento de onda de 595 nanômetros. O crescimento celular é considerado fase de tronco médio quando a densidade óptica atinge 0,4. Em seguida, centrífugue um mililitro da suspensão celular a 1.375 vezes g por um minuto.
Remova o supernatante e resuspenja a pelota celular em suplementos mínimos médios mais suplementos para um volume final de 100 microliters. Para a imagem, eventos meioticos crescem células a partir de culturas iniciantes em meio mínimo mais suplementos durante a noite. O crescimento celular é considerado fase de tronco tardio quando a densidade óptica em 595 nanômetros está entre 0,7 e um.
Em seguida, a partir das culturas de registro tardio obter 500 microliters de cada cepa tipo mate, H negativo e H positivo, e combinar para fazer uma suspensão de célula de um mililitro. Centrifugar as células a 1.375 vezes g por um minuto. Remova o supernatante e resuspenque a pelota em um mililitro de extrato de maltose líquido.
Repita a lavagem do extratos de maltose mais três vezes para garantir a remoção eficiente de nutrientes. Após a última lavagem do extrato maltose resuspensar as células em um mililitro de extrato de maltose e transferir a mistura para um frasco de 50 mililitros contendo nove mililitros de extrato de maltose. Incubar por 12 a 16 horas a 22 a 25 graus Celsius em uma velocidade mínima de rotação entre 50 e 100 rpm.
O aparecimento de muitas moças de levedura de fissão redonda resultantes de auto-floculação abundante indica acasalamento eficiente. Em seguida, pegue uma amostra de um mililitro da cultura de acasalamento e centrífuga a 1.375 vezes g por um minuto. Remova 750 microlitadores do supernante e resuspenja as células no restante do supernatante.
Vórtice vigorosamente por cinco segundos para interromper os aglomerados. Dispense 20 microliters de uma suspensão celular mitótica ou meiotic em uma almofada de 2%. Remova qualquer excesso de meio invertendo o slide e colocando-o na parte superior da toalha de papel sem fiapos por dois a três segundos.
Vire o slide e coloque delicadamente uma mancha de vidro na parte superior da almofada, garantindo não gerar bolhas de ar. Para criar uma monocamada celular gire o deslizamento no sentido horário com o dedo indicador para uma volta completa para células de mitose ou duas voltas completas para células de meiose. Certifique-se de que a matéria celular se dispersa através da almofada de agarose permitindo uma melhor separação de células únicas ou asci.
Com o auxílio de uma pequena vara de madeira dispense selante de hidrocarboneto derretido ao longo das bordas do deslizamento de cobertura para selar cada almofada de agarose. Uma vez que a almofada de agarose é selada coloque-a no estágio do microscópio. Ligue a câmara de temperatura e coloque-a na temperatura desejada.
Coloque uma placa com uma toalha de papel molhada na câmara para controlar a umidade do sistema de microscópio. Deixe equilibrar por 10 a 15 minutos nas condições de imagem apropriadas. Isso permite que quaisquer bolhas de ar restantes se dissipem e quaisquer mudanças de última hora ocorram.
Use o objetivo 40X para encontrar campos de visão apropriados para a imagem. Mude para o objetivo 60X de iniciar a aquisição de dados. No software que controla a função microscópio escolha os conjuntos de filtros de microscópio que melhor correspondem aos fluoroforos sob observação.
Ajuste os comprimentos de onda de excitação para coincidir com os fluoroforos utilizados, empregue a menor potência de excitação que produz um sinal consistente e use tempos de exposição de quatro a oito horas para gerar dados de imagem aceitáveis, mas quantificáveis e reprodutíveis. Colete pelo menos seis pontos de tempo de aquisição a cada hora. No software de coleta de imagens selecione pelo menos um canal de fluorescência a partir do qual adquirir dados e empregar um estoque Z composto por 13 seções com espaçamento de 0,5 micrômetros.
No software Fiji, carregue uma imagem desconvolved selecionando o recurso Bio-Formats Importer sob o menu plug-ins. Na janela pop-up Opções de importação, selecione Hyperstack, modo Cor Padrão, verifique a escala automática e pressione o botão OK. Certifique-se de que a janela exibida tenha o número correto de canais de fluorescência e períodos de tempo rolando para os lados nas respectivas barras na parte inferior.
Salve como um arquivo Tiff que não compactua dados. Em seguida, no menu Analisar use a opção Definir medidas para escolher diferentes parâmetros. Por exemplo: Área, valor cinza mínimo min, densidade integrada, valor cinza médio, mediana, posição de pilha, perímetro e etiqueta display.
Selecione Cor e clique na Ferramenta de Canais. Na janela pop-up dos canais, verifique o Canal de Cores para qual intensidade ou área será medida. Selecione Imagem, em seguida, Digite e clique em 32 bits.
Escolha os recursos Ajustar e Limiar no menu Imagem. Verifique a caixa de fundo Escuro, selecione o método Padrão e escolha Vermelho para sobrepor os sinais de interesse. Use a ferramenta varinha para destacar cada estrutura de interesse e pressione a letra T no teclado para adicionar o ROI selecionado à janela do gerenciador de ROI pop-up.
Em seguida, abra a pasta de ROI com zíper para carregar o gerenciador de ROI e clique em cada identificador de ROI no painel lateral esquerdo. Selecione Medir no menu Analisar e repita este comando em cada identificador de ROI para quantificar os objetos de interesse em todas as fatias da pilha de imagens. Guarde os resultados como um arquivo CSV para análise estatística.
Neste estudo, se as células morrerem de fome devido à limitação de nutrientes ou ao crescimento excessivo, elas mostrarão excesso de vacúolos e diminuição do tamanho das células. As células logarítmicas mostram replicação ativa de DNA e divisão celular, bem como expressão pan-nuclear tos4-GFP e separação de focos Sad1-DsRed. A falta de acasalamento, como é o caso quando as células não estão suficientemente famintas de nitrogênio, impedirá que entrem em meiose.
Um par de células de fissão submetidas à karyogamia são mostradas. A floculação robusta da suspensão celular de acasalamento aumenta a interação célula-célula e, portanto, indica acasalamento bem sucedido e indução meiotic eficiente. Asci zigoticas tomam múltiplas formas, incluindo as formas de zig-zag e células de banana.
Na mitose à medida que as células transitam da metafase para a telophase, a primeira mudança envolve uma contração do tamanho nuclear na metafase, enquanto a segunda mostra a divisão do núcleo durante a anfáfase. Além de compartilhar algumas dinâmicas de segregação com células mitóticas, as células meioticas exibem oscilação nuclear durante a recombinação homólogoa e a redução adicional dos nucleosídeos no final da II.It é responsabilidade dos pesquisadores garantir que os parâmetros do experimento possam ser reproduzidos entre experimentos, e que os dados coletados sejam adequados para análise a jusante. Imagens de células vivas permitiram que os investigadores examinassem de perto a mecânica da divisão nuclear em mitose e meiose.
À medida que as marcas fluorescentes e os recursos do microscópio melhoram o número e o tipo de processos que podemos observar, aumentará.
