O novo ensaio do tanque se combinará com poderosas ferramentas genéticas em Zebrafish oferece um método para dissecar como o cérebro modula o estresse e como circuitos neurais podem ser desregulados. As vias de sinalização genética e neuronal são altamente conservadas entre zebrafish e mamíferos e essa técnica pode ajudar a aprofundar nossa compreensão dos mecanismos subjacentes à resposta ao estresse. O método não é específico para o Zebrafish e tem sido usado com os peixes cegos mexicanos e, portanto, pode ser potencialmente estendido a outras espécies de peixes.
Um teste pode ser útil para determinar a iluminação adequada e o contraste do animal em um fundo para alcançar o rastreamento bem sucedido. O ensaio raramente é usado, mas pode ser um processo envolvido. Visualizar as etapas ajudará outros pesquisadores a executar o procedimento com sucesso.
Jacqueline Chin, pós-doutora no laboratório, e Lydia Albert, uma estudante de graduação, estarão demonstrando esse procedimento. Comece preenchendo um béquer de 250 mililitros e pelo menos dois tanques de retenção com água do sistema de peixes. Na manhã do teste, transfira pelo menos 10 zebrafish adultos para cada condição experimental em tanques de retenção individuais antes de transferir todos os peixes para a Sala de Comportamento para aclimatação por pelo menos uma hora.
Rotule os tanques de tal forma que a condição ou genótipo dos animais seja cego para o experimentador e use uma rede para colocar suavemente um único adulto no béquer pré-preenchido. Deixe o peixe adulto se aclimatar no béquer por 10 minutos antes de despejar suavemente a água e o peixe do béquer no tanque experimental. Assim que o peixe estiver no tanque, inicie a gravação da câmera e afaste-se da configuração para evitar sofrimento adicional aos peixes.
Quando a gravação terminar, remova o indivíduo do novo tanque e coloque o peixe em um novo tanque de retenção. Para avaliar os efeitos de drogas específicas de interesse, diluir a droga para uma concentração de trabalho em 250 béquers mililitros de água do sistema. Usando um béquer com água do sistema apenas como controle.
Mascarar as identidades da droga e controlar os béquers para garantir que o testador esteja cego às condições de tratamento até a pós-análise e realize um novo teste de tanque, como demonstrado para obter uma resposta de estresse comportamental de base. No final da gravação da linha de base, use uma rede para transferir imediatamente o peixe para um dos béquers de teste por 10 minutos antes de transferir o peixe para um béquer de lavagem contendo apenas água fresca do sistema. É importante usar redes separadas designadas para cada béquer de tratamento para evitar a dosagem acidental do peixe controle, especialmente quando vários tratamentos medicamentosos estão envolvidos.
Depois de 10 minutos, coloque o peixe em um novo tanque para um segundo novo teste de tanque. No final do teste transfira o zebrafish adulto para um novo tanque de retenção e substitua a água do sistema no segundo tanque novo por água fresca do sistema para o próximo passo para evitar a contaminação cruzada da droga experimental. No final de todos os testes, devolva os indivíduos para a instalação de peixes.
Aqui é mostrada a atividade locomotor de um único zebrafish durante o primeiro e último minuto de um novo teste de tanque de 10 minutos. Quando introduzido pela primeira vez no tanque, os peixes normalmente passam a maior parte do tempo no fundo do novo tanque. Com o tempo, no entanto, os peixes adultos demonstram um aumento gradual no tempo gasto no topo do tanque.
De fato, o tempo total gasto no topo do tanque durante o primeiro minuto é significativamente menor em comparação com o último minuto do novo teste do tanque. Em contrapartida, a distância total percorrida entre o primeiro e o último minuto não revela diferenças significativas. Neste experimento representativo, a análise dos caminhos locomotores adultos do Zebrafish revelou pouca diferença entre a atividade de natação de zebrafish antes e depois do tratamento para grupos de adultos expostos apenas ao veículo.
Em contraste, adultos expostos a uma droga ansiolítica passaram grande parte do tempo no topo do tanque em comparação com os caminhos locomomotores do mesmo peixe antes da exposição à droga. Essas diferenças não se devem à menor locomoção em geral, pois não foram mensuradas diferenças significativas na distância percorrida para nenhum dos grupos. Como os ritmos comportamentais são afetados por processos circadianos, certifique-se de realizar réplicas experimentais realizadas em dias diferentes durante a mesma hora do dia para cada experimento.
Ensaios comportamentais adicionais, como o teste de campo aberto ou outras medidas fisiológicas de estresse, podem ser realizados para validar ainda mais os resultados obtidos a partir do novo teste de mergulho do tanque. Este método pode ser usado como um ensaio de alto rendimento para abordar questões relacionadas ao estresse, medo e ansiedade.
