O descompactamento da rhodopsina causa degeneração progressiva da retina chamada retinite pigmentosa. Embora um método de imagem tradicional tenha capacidade limitada para quantificar o transporte de rodopsina, este ensaio recém-desenvolvido baseado em imagem permite uma triagem de alto rendimento, eliminando falsos positivos. Esta técnica permite uma avaliação rápida da farmacodinâmica medicamentosa.
No olho de resgatar a dobra da rhodopsina causadora de doenças, acelerando assim o potencial de um tratamento para a doença silenciosamente intratável e cegante, a retinite pigmentosa. A localização celular de uma proteína de membrana é muito importante para sua função. Este método pode ser facilmente modificado e aplicado para quantificar o transporte de qualquer outra proteína de membrana de interesse.
Certifique-se de preparar um mapa de placas e adicionar suavemente e aspirar líquido de cada poço da placa, para manter o número da célula e as condições de estado imunológico consistentes entre as células. Isso produzirá um alto fator Z, e resultados confiáveis. Para começar, sementes 5000 células por poço em um fundo preto murado, claro, poli-lysine tratada 384-bem-placa.
Incubar a placa a 37 graus Celsius com 5% de CO2 por três horas para as células se anexarem ao fundo da placa. Em seguida, use uma pipeta multicanal para adicionar 10 microliters por poço de soluções de trabalho 5X, de acordo com um mapa de placa pré-determinado como o mostrado aqui. Agora, adicione 10 microliters por poço de 2%DMSO às colunas 22 e 24.
Além disso, adicione 10 microliters por poço de 25 micromolar 9-cis-retinal à coluna 23 em uma sala escura sob luz vermelha fraca. Quando terminar de carregar todos os vários compostos de teste, cubra a placa com papel alumínio e incubar a 37 graus Celsius por 24 horas. Tire o 384-bem-prato em uma sala escura com luz vermelha fraca.
Aqui, usando aspirador de 8 canais, conectado a uma garrafa de coleta de vácuo, para aspirar suavemente o meio dos poços da placa. Em seguida, use uma pipeta multicanal para adicionar 20 microliters por poço de 4%paraformaldeído recém-preparado a toda a placa de 384 poços, e fixar as células por 20 minutos à temperatura ambiente. Após a fixação, coloque a placa em luz normal.
Lá, use um aspirador de 8 canais, para aspirar o Paraformaldeído em cada poço, e use uma pipeta multicanal para adicionar 50 microliters por poço de PBS. Aspire e substitua o PBS por um total de três ciclos de lavagem. Em seguida, adicione 20 microliters por poço de 5% de soro de cabra a cada poço, e incubar a placa em temperatura ambiente por 30 minutos.
Após a incubação, aspire os poços e adicione 15 microlitadores de 20 microgramas por mililitro B630 anticorpo anti-rhodopsin, em soro de cabra de 1%aos poços nas fileiras A a O.Next, adicione 15 microliters por poço de 1%soro de cabra para remar P para o grupo de controle de anticorpos secundários. Incubar a placa em temperatura ambiente por 90 minutos, ou a quatro graus Celsius durante a noite. Em seguida, cubra a placa com papel alumínio para evitar o fotobleaching dos fluoroforos.
Em seguida, lave a placa três vezes com 50 microliters por poço de PBS. Após a última lavagem, aspire o PBS, e adicione 15 microliters por poço de cinco microgramas por mililitro de anticorpo igG de cabra conjugado Cy3. Cubra a placa com papel alumínio e incuba as amostras à temperatura ambiente por uma hora.
Após a incubação, lave a placa três vezes. Em seguida, adicione 50 microliters por poço de PBS, contendo um micrograma por mililitro de mancha hoechst à temperatura ambiente por 15 minutos. Por fim, sele a placa do poço com um filme transparente, cubra-a com papel alumínio e guarde a quatro graus Celsius por até uma semana.
Remova a folha e coloque a placa de amostra em um imager de alto teor, com A1 posicionado no canto superior esquerdo da placa. Em seguida, abra o software de aquisição de imagens para configurar parâmetros para aquisição de imagens. Abra a janela de configuração de aquisição da placa e crie uma nova configuração ou carregue um arquivo de configuração existente.
Selecione o objetivo de 20X e configure o pixel binning como dois, de modo que o tamanho do pixel calibrado é de 0,80 por 0,80 mícrons. Em seguida, defina as linhas de varredura como 2000, e o tamanho da imagem como 1000 por 1000 pixels por site. Em seguida, selecione o tipo de placa a ser imageado.
Use as informações fornecidas pelo fabricante para preencher as dimensões da placa. Agora, selecione os poços a serem imagens junto com quatro sites a serem imagens por poço. Evite o lado do poço, que são tocados pelas pontas de aspiração.
Para imagens, selecione lasers de excitação como 405, 488 e 461 nanômetros. Em seguida, selecione os filtros de emissão para canais DAPI, FITC e Texas Red. Otimize a potência laser e os ganhos de cada canal, para garantir que os poços de controle positivo não estejam saturados.
Selecione bem para se concentrar bem para foco automático. Em seguida, selecione o poço inicial a ser adquirido e defina o foco automático do site para todos os sites. Além disso, selecione quatro médias por linha para cada canal e otimize o valor de deslocamento Z para cada canal.
Valide, que tudo esteja devidamente configurado, primeiro testando dois a três poços nos cantos da placa, para ter certeza de que as imagens estão em foco para todos os poços testados. Em seguida, verifique, que imagens de todos os sites por poço têm células com mais de 40% de confluência. Finalmente, verifique se as intensidades de fluorescência em todos os canais estão quase meio saturadas nos poços de controle 100%.
Em seguida, salve o método de aquisição de imagem e execute toda a placa. Observe o imager até que ele termine de capturar imagens da primeira coluna da placa para verificar novamente a qualidade da imagem antes de deixar o imager. Quando terminar, remova a placa e armazene-a a quatro graus Celsius para uso futuro.
Puxe dados de imagem, usando um software de análise de imagem de alto conteúdo. Selecione um dos poços de controle de 100% na coluna 23 para configurar os parâmetros. Primeiro, selecione a pontuação de célula de comprimento de onda multi-comprimento como o método de análise e comece a configurar as configurações adicionais.
Defina os núcleos usando imagens do canal DAPI. Pré-visualização, para ter certeza de que os núcleos definidos se encaixam bem com as imagens dos núcleos. Em seguida, defina a forma da célula no canal FITC, onde a Vênus de Rhodopsin é imageda.
Para isso, configure diâmetros mínimos e máximos de cada célula, intensidade mínima de fluorescência acima do fundo, bem como área mínima de cada célula. Agora, defina as áreas de mancha de superfície da célula de rodopsina no canal Vermelho do Texas, estabelecendo os diâmetros mínimos e máximos de forma celular, intensidade de fluorescência minium acima do fundo, bem como área mínima de cada célula manchada. Teste o algoritmo atual em cinco poços para determinar se as configurações são otimizadas.
Em seguida, salve as configurações e feche a janela de configuração. Execute todos os poços com o método de análise otimizado. Quando terminar, exporte o número do objeto como o número de célula intacta.
Exporte a intensidade média do canal FITC como a intensidade de Vênus de Rhodopsin, e exporte a intensidade média do Canal Vermelho do Texas como intensidade de Rhodopsin na superfície celular. Use o software de planilha para gerar um mapa de calor de duas cores para cada parâmetro. Organize o nome das linhas celulares no eixo x e os compostos no eixo y.
Aqui, nossas imagens de P23H rhodopsin Venus trataram células U2OS, expressando fluorescência de Vênus em verde, e imuno-coloração da superfície celular em vermelho. As células foram tratadas com DMSO ou cinco micromolar 9-cis-retinal. O ensaio de transporte de rodopsina, comparando a quantidade de rodopsina em toda a célula em várias condições, mostra uma recuperação significativa na linha celular mutante P23H, quando tratada com 9 cis-retinal.
Além disso, a intensidade da rodopsina na superfície celular, e a razão da mancha de rhodopsina na superfície celular à intensidade de Vênus de rodopsina em toda a célula, não são significativamente menores para o mutante P23H, em comparação com o tipo selvagem rhodopsin tratado com DMSO. Um mapa de calor é uma maneira eficiente de comparar a quantidade média de rodopsina e a localização por célula entre vários mutantes. Aqui, controles de tipo selvagem e seis mutantes de rodopsina são listados horizontalmente, e os efeitos dos tratamentos compostos são comparados verticalmente.
De acordo com estudos anteriores, a intensidade de rodopsina na superfície celular e a razão da mancha de rodopsina na superfície celular à intensidade de Vênus de rodopsina são menores para os seis mutantes em comparação com o tipo selvagem tratado com DMSO. Os compostos um, dois, seis e nove aumentaram significativamente a proporção de mancha de rhodopsina na superfície celular para a intensidade de Vênus de rodopsina em T4R, P23H, D190N e P267L mutantes de rodopsina, sugerindo que esses compostos resgatem o transporte desses mutantes de rodopsina para o plasma da membrana. Tenha em mente que as células precisam estar entre 50 e 70% confluentes antes da fixação, pois isso é fundamental para a análise de imagem.
Além disso, mostramos imagens de um poço em toda a placa. Certifique-se de que as imagens em foco, e que a fluorescência, que não sai, tem todo o valor limite para qualquer canal. Até um seletor de compostos, que resgatam o transporte de rodopsina, podemos validar o processo, em seguida, passar a eficácia desses compostos in vivo, usando um modelo de rato expressando o mutante rhodopsin P23H.
Este método nos permite quantificar a quantidade de proteína de membrana e sua localização. Portanto, é uma ótima ferramenta para micro erro iniciado na proteína da membrana por assistência e degradação. O paraformaldeído, como está neste experimento, possui procedimentos envolvendo o manuseio desse reagente.
Será feito sob o capô. Os resíduos, incluindo este reagente, devem ser descartados adequadamente como um produto químico perigoso.
