Os autores reconhecem o projeto East Development Dairy Africano (EADD) pelo apoio prático no terreno em cooperativas leiteiras de formação no Uganda rural na produção de leite fermentado. CSK Food Enriquecimento é reconhecida pela produção, controle de qualidade e avaliação da capacidade fermentativa da cultura de arranque. Lactosan GmbH &amp; Co, na Áustria, é reconhecido por assistência de produção. Os autores agradecem Karin Overkamp (TNO Microbiologia e Biologia de Sistemas, Zeist, Países Baixos) para a análise HPLC, e Derrick Assimwe (UIRI) para gravar as declarações do autor em Uganda. Estas gravações ocorreram durante a reunião inicial apoiados pelo IDRC do alimento fermentado para o projeto de vida (CIFSRF Fase 2) em Entebbe, Uganda, de Maio de 2016. A VU University Amsterdam eo museu micropia são reconhecidos por contribuições financeiras e de prestação de serviços de laboratório para a produção do vídeo descrito neste artigo. Os autores agradecem Wim van Egmondpara microscopia de bactérias do iogurte.

1. Preparação de fresco de arranque Para preparar o motor de arranque fresco, tome 1 L de qualquer um de alta temperatura Ultra (UHT), leite transformado ou leite de vaca fresco. Se ele é o leite UHT, vá para o passo 1.3. Se é o leite de vaca fresco, prossiga com o passo 1.1. <ol><li> análises de leite para o leite de vaca fresco <ol><li> Para o teste organoléptico para detectar anormalidades ou a deterioração do leite, verifique a aparência visual do leite e verificar o seu cheiro. </li><li> Para o teste de pano-em-ebulição, transferir uma pequena amostra do leite para uma colher de sopa. Segurar a colher acima de uma fonte de calor até que o leite começa a ferver. Remova a colher a partir da fonte de calor e olhar para o leite para detectar sinais de coagulação que indicam o leite de má qualidade. </li><li> Para o teste de galactômetro, encher um cilindro, copo de vidro ou qualquer outro objecto oco, pelo menos, 15 cm de altura com leite. Coloque a galactômetro no leite. leituras lactímetro de 28 ou mais para o leite a 30 ° C indiccomeu o leite de densidade suficiente sem adição de água. </li><li> Para o teste de etanol, fazer uma solução de etanol 80% em água destilada. Misture uma quantidade igual de leite com uma quantidade igual de 80% de etanol, por exemplo, misturando uma colher de chá de leite com uma colher de chá de 80% de etanol em um copo. Olhe para a mistura para detectar sinais de coagulação que indicam o leite de má qualidade. </li></ol></li><li> Quando o leite fresco está a ser utilizado, filtra-se o leite com um crivo ou tecido de filtro (tamanho de poro 0,1-0,5 mm), previamente pasteurizado em água a ferver durante 15 min. </li><li> Pasteurização <ol><li> Transferir o leite em uma panela pequena e fechar a panela com uma tampa. Coloque a panela numa panela pouco maior. Encher a panela maior com água, até 2 cm abaixo da borda do recipiente pequeno. </li><li> Aqueça esta configurado usando uma fonte adequada de calor (por exemplo, aquecimento eléctrico, queimador a gás, fogão de carvão, lenha) até que o leite chega a 85 ° C, medida com um termómetro de laboratório. </li><li> Vire o sourcE de calor para baixo e manter a temperatura de 85 ° C durante 30 min. </li></ol></li><li> Retire a panela com o leite da panela com a água e deixe esfriar. Opcionalmente transferir a panela a uma panela com água fria para acelerar o processo de arrefecimento. Não retire a tampa da panela, exceto para tomar medidas de temperatura. </li><li> Deixe o leite arrefecer para 45 ° C, medida com um termómetro de cozinha ou de laboratório. Neste ponto, a transferência do leite para um frasco de vácuo, e inocular o leite, adicionando o conteúdo de um pacote de a cultura de sementeira (1 g). </li><li> Deixar o leite inoculado durante 16 horas no balão de vácuo, para permitir que a fermentação ocorra. Verificar o pH final do leite fermentado, que deve ser de 4,4 ou menos, como medido com um medidor de pH ou papel indicador de pH. </li><li> Após a fermentação, agite ou mexa o produto por aproximadamente 5 - 10 min para obter uma textura suave. </li><li> Armazenar até que os próximos passos. <ol><li> Para a produção de casa, despeje o fermento fresco para dentrouma bandeja de cubo de gelo para fazer cubos de gelo de 10 ml. Coloque os cubos de gelo no congelador (-18 ° C) e continue com a secção 2 a 3 meses. </li><li> Para a produção de até 100 L escala em locais de poucos recursos, continue com a secção 3, garantindo assim que a etapa 3.5 é iniciado 16 horas após a conclusão da etapa 1.5. Alternativamente, coloque o fermento fresco no frigorífico (7 ° C) após o passo 1.6 e continue com a secção 3 a 5 dias. </li><li> Para a produção de uma vasta gama de tipo não lácteo de alimentos fermentados, continue com a secção 4. </li></ol></li></ol> 2. produção de lotes pequenos em Household Nível <ol><li> Use qualquer quantidade conveniente de leite (sugerido 1 - 10 L). </li><li> Execute o passo 1.1. </li><li> Execute o passo 1.2. </li><li> Pasteurização <ol><li> Transferir o leite em uma panela pequena e fechar a panela com uma tampa. Coloque a panela numa panela pouco maior. Encher a panela maior com água, até 2 cm abaixo da borda do recipiente pequeno. </li><li>Aqueça esta configurado usando uma fonte adequada de calor (por exemplo, aquecimento eléctrico, queimador a gás, fogão de carvão, lenha) até que o leite chega a 60 ° C, medida com um termómetro de laboratório ou cozinha. </li><li> Opcional: Neste ponto, adicionar o açúcar a uma concentração sugerida de 5% (w / v), como medido com um equilíbrio. Agita-se bem com uma colher da mistura previamente pasteurizado por submersão em água a ferver durante 15 min. Continuar o aquecimento até que o leite atinge 85 ° C, medida com um termómetro de cozinha ou de laboratório. </li><li> Ligar a fonte de calor para baixo e manter a temperatura de 85 ° C durante 30 min. </li></ol></li><li> Execute o passo 1.4. </li><li> Deixe o leite arrefecer para 45 ° C, medida com um termómetro de cozinha ou de laboratório. Neste ponto, inocular o leite através da adição de um cubo de gelo (como foi preparado no ponto 1) para cada litro de leite e o leite transferir a (um) frasco (s) de vácuo. </li><li> Deixe o leite no frasco de vácuo para permitirfermentação a ter lugar até um pH de 4,4 é atingido, conforme medido com um medidor de pH ou papel indicador de pH. Esta é estimada em 12 h. </li><li> Execute o passo 1.7. </li><li> Transfira o leite fermentado com um frigorífico (7 ° C) e deixe-o esfriar por pelo menos 3 horas antes do consumo. Quando armazenado sob refrigeração adequada, o produto é melhor consumido no prazo de um mês. </li></ol> 3. Produção em ambiente rural em países com poucos recursos Nota: Use um máximo de 100 litros de leite por 1 L-mãe fresca. <ol><li> Execute o passo 1.1. </li><li> Execute o passo 1.2. </li><li> Pasteurização: <ol><li> Transferir o leite em uma lata de leite de tamanho adequado e fechar a lata com uma tampa. Coloque a lata em uma panela grande. Encha a panela com água, até ao mais alto nível possível. </li><li> Aqueça este set-up usando uma fonte adequada de calor (fogo de madeira é o mais rápido e muitas vezes o melhor custo-benefício) até que o leite chega a 60 ° C, medida com um laboratório oucozinha termômetro. </li><li> Opcional: Dependendo da preferência do sabor, adicionar o açúcar numa proporção de 50 g por litro. Agita-se bem com uma colher de mistura que foi previamente pasteurizado por submersão em água a ferver durante 15 min. Continuar o aquecimento até que o leite atinge 85 ° C, medida com um termómetro de cozinha ou de laboratório. </li><li> Reduzir o aquecimento e manter a temperatura de 85 ° C durante 30 min. </li></ol></li><li> Retire a lata com o leite da panela com água e deixe esfriar. Para acelerar o processo de arrefecimento, transferir a lata para uma panela com água fria. Não se remover a tampa da lata, com excepção para a medição da temperatura. </li><li> Deixe o leite arrefecer para 45 ° C, medida com um termómetro de cozinha ou de laboratório. Retire a lata da panela de água fria. Neste ponto, inocular o leite pela adição do fermento fresco completo (isso nunca pode ser uma overdose). </li><li> Enrole um cobertor em torno da lata de leite para fins de isolamento e a prevenção de um rapID diminuição da temperatura (idealmente, a temperatura irá permanecer entre 45 e 35 ° C). Deixar o leite inoculado na lata para permitir que a fermentação ocorra até um pH de 4,4 seja alcançado. Este processo leva cerca de 12 horas. </li><li> Remover a manta a partir da lata e abrir a lata. <ol><li> Opcional: remover a camada superior aquosa do leite fermentado para obter uma textura mais suave do leite fermentado probiótico (iogurte). </li><li> Opcional: adicionar sabores artificiais de qualidade alimentar (por exemplo, morango ou baunilha), por exemplo a uma concentração de 0,1% (v / v) doseados por 10 ml de copo de medição ou colher (dependendo da concentração do sabor e da preferência o cliente). </li><li> Opcional: adicione conservantes. Um custo eficaz e segura escolha é o uso de sorbato de potássio, a uma concentração máxima de 0,12 g / L (fonte: http://www.efsa.europa.eu/en/efsajournal/pub/4144 aconselha a 3 mg / kg de peso corporal / dia). Nota: As crianças com um peso inferior a 10 kg não devem tomar more de um máximo de 30 mg de sorbato de potássio quando se toma uma dose de 250 ml de leite fermentado, que é corresponde a uma dosagem de cerca de 2 colheres de sopa por 50 L. </li><li> Agita-se o leite fermentado cuidadosamente com uma colher metálica que foi previamente esterilizado por submersão em água a ferver durante 15 min. </li></ol></li><li> Opcional: Coloque o leite fermentado, a transferência para um frigorífico (7 ° C) e esfriar por pelo menos 3 horas antes do consumo. Nota: Quando armazenado sob refrigeração adequada, abaixo de 7 ° C, o produto é melhor consumido dentro de duas semanas. Quando armazenado sob refrigeração adequada, e conservante é adicionado como descrito em 3.7.3 do produto é melhor consumido dentro de 4 semanas. </li></ol> 4. produção de outros alimentos fermentados Esta secção descreve a produção de leite fermentado do que outros alimentos fermentados com um volume máximo de cerca de 50 L. <ol><li> Pasteurizar uma gaze por submersão em água a ferver durante pelo lleste 15 min. Amarre o pano de queijo vagamente sobre uma bacia ou pan que pode armazenar cerca de 2 L usando uma corda ou uma faixa de borracha. </li><li> Despeje a mãe fresca no pano de queijo, evitar o derramamento de mais, e manter espaço suficiente entre a parte inferior da bacia e da gaze. </li><li> Colocar a taça num frigorífico a cerca de 7 ° C durante 8-12 horas, até cerca de 0,5 L de soro de leite drenado a partir do iogurte na tigela. </li><li> Usar o soro de leite para fazer diferentes tipos de alimentos fermentados. Os exemplos são dados abaixo. Nota: Os alimentos fermentados obtidos irá conter soro de leite (leite). Leite e seus derivados são reconhecidos entre os ingredientes mais comuns que causam alergias e intolerâncias alimentares. <ol><li> Para a produção de Obushera, sorgo ou uma bebida com base painço Uganda seguir o protocolo descrito por Mukisa et ai. 22. </li><li> Para a produção de Uji, uma papa de aveia queniano feita a partir de milho ou sorgo, ou uma mistura de ambos, seguir o protocolo utilizado pela Jomo Kenyatta Universidade de Agricultura e Tecnologia no Quênia e descrito por Kort et al. 15. </li><li> Para a produção de Zomkom, uma bebida à base de sorgo de Burkina Faso, seguir o protocolo descrito por Christèle et al. 23 e Kort et al. 15. </li><li> Para a produção de Mutandabota, um produto dos frutos da árvore baobá e leite que é amplamente consumidos na África Austral siga o procedimento descrito por Mpofu et al. 24. Note-se que para este produto o motor de arranque fresco que é obtido no ponto 1 pode ser usado diretamente sem antes realizar o passo 4,1-4,3. </li></ol></li></ol>

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Wilbert Sybesma e Remco Kort são os fundadores da Yoba for Life Foundation, uma não-organização sem fins lucrativos, credenciada pelo Fisco holandês como um Benevolent Instituição Pública (PBI), que visa promover a produção eo consumo de produtos fermentados na África locais . produtos fermentados feitos com a cultura de sementes Yoba, incluindo iogurte, zomkom, obushera e mutandabota não são comercializados pela fundação como tal, mas a Yoba for Life Foundation estimula a produção e apropriação local, permitindo que as actividades geradoras de rendimentos para os empresários africanos no setor de alimentos . O Yoba for Life Foundation distribui e vende saquetas ready-to-use com culturas de sementes secas bacteriana através de uma rede de parceiros e voluntários para facilitar a produção local de leite e produtos por fermentação bacteriana controlada à base de cereais.

O protocolo de produção simples, usando equipamento básico e uma cultura alimentar de arranque romance fermentado descrito neste artigo facilita a produção de um leite fermentado probiótico de alta qualidade a nível familiar e em áreas rurais em países com poucos recursos. É crítico para pasteurizar o leite durante um período mínimo de 30 minutos, a fim de se obter a redução ou a eliminação de organismos de deterioração e potenciais microrganismos patogénicos suficiente. Além disso, o adequado aquecimento provoca desnaturação da proteína de soro de leite 17 que irá subsequentemente associar com micelas de caseína 25 resultando na formação de ligações cruzadas no leite fermentado 26. Por conseguinte, a viscosidade do produto final é aumentado em comparação com o leite menos extensivamente aquecida 27. Também é crítico para evitar a inoculação do leite acima de 45 ° C, devido a temperaturas mais elevadas as bactérias será inactivado. Da mesma forma, se estiver disponível e os custos-effective, é preferida a utilização de leite UHT, especialmente para a produção de o motor de arranque fresco. Em primeiro lugar, o leite UHT é praticamente isenta de microrganismos indesejados. Em segundo lugar, em proteínas de soro de leite UHT têm sido extensivamente desnaturada, o que os torna mais acessível para as proteases bacterianas, promovendo a sua degradação e subsequente crescimento das bactérias de iogurte. Durante o processo de arrefecimento, as proteínas parcialmente refold ao seu estado nativo, por conseguinte re-aquecimento antes da inoculação é benéfica para a produção de iogurte. Resultados da fermentação prolongada em um leite fermentado com um pH &lt;4,4, o que é muitas vezes indesejável. A fermentação pode ser parado em tempo hábil, colocando o leite fermentado na geladeira. Iogurtes produzidos localmente na África têm sido mostrados para conter níveis significativos de lactococos 28, tais como L. lactis, o qual pode causar a produção de péptidos que têm um sabor amargo 29-32, que é geralmente undesirable 31. Portanto, é essencial que a fermentação realiza-se a uma temperatura entre 45 e 35 ° C 15,28. Uma vez que a temperatura vai diminuir lentamente durante a fermentação em um ambiente semi-controlada, a inoculação é feita a 45 ° C, a temperatura mais elevada permitida. isolamento suficiente durante a fermentação é essencial para evitar a diminuição da temperatura abaixo de 35 ° C. produção manual de iogurte em ambiente rural tem um risco relativamente elevado de contaminação microbiana por organismos de deterioração. Em particular, as leveduras são capazes de se propagar nas condições ácidas em iogurte. A contaminação por fungos pode conduzir à produção de gás em excesso, seja na fase de incubação ou durante o armazenamento, estragando assim o iogurte imediatamente ou encurtar significativamente a sua vida de prateleira 33,34. níveis de levedura pode ser minimizado através de esterilização por calor e / ou limpeza com hipoclorito de sódio de todos os utensílios e equipamentos antes de cada sagacidade contato<html> h, o leite ou iogurte. Especialmente depois de deterioração levedura tenha ocorrido, a esterilização e limpeza intensa e extensa é necessária para eliminar a contaminação. Os riscos acima descritos mostram claramente que o sucesso da aplicação deste protocolo de produção em países pobres de recursos é limitada pela sua natureza manual e com o mesmo aumento da taxa de deterioração associada. A taxa de deterioração torna-se ainda maior em comunidades que carecem de instalações de refrigeração ou ter disponibilidade altamente flutuante de eletricidade. Além disso, a falta de acesso ao material de embalagem acessível de alta qualidade pode limitar a absorção de o protocolo descrito. O equipamento necessário é básico e universal, mas um termômetro de laboratório ou cozinha é essencial. Finalmente, atualmente apenas um número limitado de países têm as instalações para produzir a cultura de arranque liofilizado. A maioria dos países com poucos recursos não têm as instalações, e, portanto, dependem de importação para obter esse produto. _content &quot;&gt; Entre os géneros alimentícios, leite fermentado, incluindo o iogurte é o veículo mais comum para as bactérias probióticas. A produção de leite fermentado não requer equipamento especial para além de um termómetro. Assim, a combinação do acima descrito primeiro cultura fermento probiótico genérico 13 com uma simples protocolo de produção permite a produção reproduzível, controlada e segura de leite fermentado probiótico por quase qualquer pessoa em qualquer lugar, incluindo a produção aos níveis da indústria de casa e de casa de campo em áreas rurais em países com poucos recursos. em habitualmente praticado fermentações naturais, níveis iguais de probiótico as bactérias não podem ser garantidos 9. a cultura de arranque auto-estáveis ​​em 1 g saquetas permitir que os produtores de pequena escala, a custos reduzidos produzir alimentos fermentados, sem a necessidade de comprar grandes quantidades de culturas de arranque que normalmente perdem viabilidade após a abertura da embalagem, especialmente quando mantida à temperatura ambiente e a uma humidade relativa elevada, que éa nosso conhecimento o caso de todas as outras culturas iogurte arranque disponíveis. Além disso, a quantidade de bactérias secas que é importado permanece muito baixa, abaixo de 0,1% da concentração cultura probiótica no produto final, porque quase todas a cultura fermento é produzida localmente devido ao método de pré-incubação, que é descrito neste protocolo . A produção de leite fermentado é descrito em detalhe neste artigo e pode ser o primeiro passo para dominar a arte da produção de alimentos fermentados probióticas, que, posteriormente, podem ser aplicados a muitos tipos de fermentar outros alimentos (como referido neste artigo). Para atualizar o leite fermentado básica, um possível próximo passo é a produção de fruta real leite fermentado. Isto requer a preparação de um fruto de conserva estéril (uma mistura de fruta, açúcar e, opcionalmente, alguns dos aditivos) ou a compra de um fruto de pronto-a-preservar a ser misturado com o leite fermentado depois da fermentação 35,36.

Este artigo descreve um protocolo de produção que permite a produção de leite fermentado probiótico e nutritivos e outros alimentos fermentados probióticos com a ajuda de uma cultura de sementeira que provou benefícios para a saúde. O protocolo é robusto e de fácil execução por qualquer pessoa, em qualquer lugar, incluindo países com poucos recursos. Na África Subsaariana, 21% das mortes de crianças &lt;5 anos é causada por diarreia 1, dos quais 29% é causada por etiologia rotaviral em particular 2. Demonstrou-se que o consumo diário de alimento fermentado contendo uma dose recomendada de 1 x 10 10 CFU de L. rhamnosus GG estimula a saúde do intestino e reduz a incidência e gravidade da diarréia por rotavírus 3-7. Bactérias benéficas estão presentes em grande variedade de alimentos fermentados tradicionais em todo África subsariana 8-10. No entanto, esses alimentos são quase exclusivamente home-produced, têm uma vida útil relativamente curta e aumentaram os riscos de segurança devido à natureza descontrolada da fermentação 11. Além disso, o consumo desses alimentos tradicionais diminui devido à urbanização e ocidentalização geral das dietas na África 10,12. A bactéria probiótica genérico L. rhamnosus yoba 2012 13, a qual é idêntica a L. rhamnosus GG, foi introduzida depois da patente original de L. rhamnosus GG tinha expirado 14. A cultura de semente seca tem um A w de cerca de 0,1, o que mantém a viabilidade elevada, após um período de armazenamento de pelo menos um ano à temperatura ambiente (dados não mostrados). A cultura semente é embalado em porções de 1 g e pode ser utilizada para a produção de um máximo de 100 L de leite fermentado. Ao produzir um ou dois lotes de um dia, as culturas de arranque pode ajudar a chegar a uma capacidade de produção de até 1.000 litros por semana a partir de vésperary dias leite fresco. O uso de L. rhamnosus yoba 2012 com S. thermophilus C106 como um adjuvante de cultura que permite o Lactobacillus para propagar 15 é um consórcio bacteriana original que não tenha sido relatada por outros autores. O protocolo de produção envolve a ressuspensão do um pacote de conteúdo (1 g) de liofilizado de cultura de arranque (cultura de semente) a 1 L de leite, resultando num chamado arranque fresco após incubação durante um período de 16 horas. O motor de arranque fresco é subsequentemente utilizada para inocular um máximo de 100 L de leite. Este método de pré-incubação reduz a quantidade de bactérias liofilizadas utilizados, reduzindo assim os custos de produção em comparação com a incubação directa como por exemplo descrita por Goff 16. A formulação utilizada para o protocolo descrito no presente documento mantém as vantagens de uma cultura liofilizada, como a estabilidade de vida de prateleira e fácil armazenamento e manuseamento, resultando em altamente rfermentações eproducible. Além disso, o protocolo de produção, tal como descrito neste artigo não requer equipamento de alta tecnologia, por oposição aos métodos de produção convencionais utilizados no mundo desenvolvido 17. Finalmente, o arranque fresco pode ser utilizado para a inoculação de outro (não lácteos) matérias-primas para a produção de uma vasta gama de alimentos fermentados como é mostrado com sucesso para Obushera, KWETE, Uji, e Zomkom, todos os alimentos tradicionalmente fermentados à base de cereais de Uganda (os dois primeiros), Quênia e Burkina Faso, respectivamente 15. Esta é apenas uma pequena fração da grande quantidade de alimentos fermentados desenvolvidos em África 18. A fermentação é a repartição de macromoléculas, tais como amido, açúcares e proteínas em produtos que têm uma digestibilidade aumentou, através das atividades de enzimas e / ou microorganismos. A fermentação é uma técnica amplamente utilizada na África Sub-Sahariana. trajeséter com secagem e salga permite a conservação de alimentos na ausência de instalações ou técnicas industriais como a indústria conserveira 9,19 arrefecimento. Tradicionais de fermentação, muitas vezes usa-slopping de volta, em que uma pequena porção a partir de um lote anterior é adicionado a um novo lote de facilitar a fermentação e para reduzir a possibilidade de falha de fermentação 11. Harrison e Tomkins 20 descrever uma ampla gama de alimentos fermentados tradicionais africanas com base em milho, sorgo ou milho, e o papel benéfico esses alimentos podem trazer para desmame crianças, por exemplo, reduzindo a diarreia infantil e mortalidade associadas. Nout e Sarkar 19 descrevem a produção tradicional de um prato de mandioca fermentada que é amplamente consumido na África ocidental. Franz et al. 9 fornecem uma extensa descrição de alimentos fermentados africanos categorizados em cereais e vegetais alimentos, alimentos colheita de raízes em amido e alimentos de proteína animal. Além de que, Narvhus e Gadaga <s-se&gt; 21 descrever especificamente a produção tradicional de leite fermentado na África. Para a produção de leite fermentado probiótico (ou outros alimentos fermentados), especialmente no caso da produção de casa, a disponibilidade de um congelador é vantajoso armazenar o fermento fresco em porções congeladas. Em países com poucos recursos, a produção de leite fermentado pode ser bem executada pelas comunidades produtoras de leite. A experiência actual com as comunidades locais em Uganda indica que Cooperativas de Laticínios são entidades adequadas a retomar a produção de iogurte de seus próprios suprimentos de leite. A disponibilidade de uma lata de leite é vantajoso, embora seja também possível, embora menos preferível, para preparar grandes quantidades de leite fermentado num recipiente maior. Além disso, a disponibilidade de energia eléctrica ea com ela presença conectado de arrefecimento instalações em lojas e quiosques locais em países com poucos recursos é uma vantagem na expansão dos negócios ea redução operdas de f devido à deterioração. No entanto, como será discutido no protocolo, através da adição de sorbato de potássio, é possível preservar a iogurte durante vários dias à temperatura ambiente e reduzir spoilages em caso de oscilações de energia.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1034">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Yoba starter culture</td>
			<td style="width:199px;">Yoba for Life foundation</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:501px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Milk</td>
			<td>Obtained from local cow</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td>Fresh, whole milk, free from antibiotics and obtained from a healthy cow</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Optionally sugar</td>
			<td>Bought at local supermarket</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td>Canesuger was used, but beet sugar is also possible. Free from impurities</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Laboratory Thermometer</td>
			<td>Narang Scientific Industries</td>
			<td>TM-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Lactometer</td>
			<td>Narang Scientific Industries</td>
			<td>LM-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethanol 96%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">476226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">pH paper</td>
			<td>Macherey-Nagel GmbH &#38; Co</td>
			<td style="width:119px;">90206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cheesecloth</td>
			<td>Beyond Gourmet</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td>Any high quality food grade cheese cloth can do</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sieve/strainer</td>
			<td>Cuisinart</td>
			<td>CTG-00-3MS</td>
			<td>Any fine mesh strainer can do, but stainless steel strainers are preferred.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1 l Thermos flask</td>
			<td>Bought at local warehouse</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1 liter pan + lid</td>
			<td>Bought at local warehouse</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td>Stainless steel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2 liter pan</td>
			<td>Bought at local warehouse</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td>Any heat- and waterproof material will do</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">50 liter pan</td>
			<td>Bought at local warehouse</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td>Any heat- and waterproof material will do</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Milk can</td>
			<td>Narang Scientific Industries</td>
			<td>MC-SS-30</td>
			<td>Any stainless steel milkcan can do</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Blanket</td>
			<td>Bought at local warehouse</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td>The thicker the blanket, the better the isolation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

novel production protocol for small-scale manufacture of probiotic fermented foods

Uma seco romance consórcio bacteriana de Lactobacillus rhamnosus yoba 2012 e Streptococcus thermophilus C106 é cultivado em 1 L de leite. Esta mãe fresca pode ser usada para a produção de leite fermentado e outros alimentos fermentados, quer em casa ou no de pequena escala em áreas rurais. Para a mãe fresca, 1 L de leite é pasteurizado em uma panela que se encaixa em um maior contendo água panela, colocada sobre uma fonte de calor. Neste banho de água, o leite é aquecido e incubou-se a 85 ° C durante 30 min. Em seguida, o leite é arrefecida até 45 ° C, transferido para um frasco de vácuo, inoculado com as bactérias secas e mantido durante pelo menos 16 horas entre 30 ° C e 45 ° C. Para o propósito da produção de casa frequente, o motor de arranque é fresco congelado em cubos de gelo, que podem ser utilizados para a produção de pequenos volumes de até 2 L de leite fermentado. Com a finalidade de produção de pequena escala em países com poucos recursos, a pasteurização de até 100 L de leite is conduzidas em latas de leite que são colocados numa panela grande encheu-se com água e aqueceu-se num fogo a 85 ° C durante 30 minutos, e subsequentemente arrefecida para 45 ° C. Em seguida, o lote de 100 L, é inoculada com o 1 L de partida preparado de fresco antes mencionado. Para assegurar uma fermentação eficaz a uma temperatura entre 30 e 45 ° C, o leite pode é coberto com uma cobertura, durante 12 h. Para a produção de alimentos fermentados não-lácteos, o motor de arranque fresco é deixado num pano de queijo durante 12 horas, e o soro de leite drenado-off pode ser subsequentemente utilizado para a inoculação de uma ampla variedade de matérias-primas alimentares, incluindo vegetais e cereal- alimentos à base.

O lado esquerdo da Tabela 1 mostra um diagrama esquemático da seção 1 do protocolo. Isto é seguido por um diagrama combinado generalizada das secções 2 e 3 do lado direito da tabela. Perfis de fermentação de leite inoculado com a cultura de semente, utilizando o protocolo de produção, tal como descrito neste artigo foram registados. A Figura 1 ilustra a fermentação da cultura fresca (como descrito na secção 1). A Figura 2 mostra a fermentação do leite fermentado (produto final , conforme descrito nas seções 2 e 3). Uma vez que, na prática, em zonas rurais controlo rigoroso da temperatura é difícil, as medições foram feitas à temperatura de 37 ° C e 45 ° C. Para a fermentação a 37 ° C, os perfis de acidificação das duas saquetas testados mostram uma ligeira diferença no aparecimentoda acidificação exponencial de aproximadamente 30 minutos, tanto na produção de o motor de arranque fresco e o produto final. Os valores de pH final de ambas as culturas são idênticos após 16 horas. Valores de pH típicos e os títulos para o L. propagadas rhamnosus e S. cepas thermophilus seguindo os processos de produção descritos para diferentes alimentos fermentados podem ser encontrados na Tabela 2. Cell contagens por L. rhamnosus e S. thermophilus foram determinadas em meio de agar MRS e LM17, respectivamente, usando métodos de revestimento microbiológicos vulgarmente aplicados. Contagem de células final de L. rhamnosus yoba 2012 foram 1,7 x 10 7, 3,7 x 10 9 e 3,3 x 10 9 UFC ml-1 para o leite fermentado, KWETE e uji, respectivamente. valores de pH finais foram de 4,3 e 4,2 para o leite fermentado e KWETE, respectivamente. Os resultados preliminares indicaram que a adição de PotasSium sorbato não antes da fermentação não influenciar negativamente mas mesmo aumenta o número de L. viável rhamnosus 2012 yoba bactérias no iogurte duas semanas após a sua produção (dados não mostrados). A Figura 3 mostra os resultados da cromatografia líquida de alta performance (HPLC) em combinação com um detector de índice de refracção (IR) de leite não fermentado em comparação com o leite fermentado. Os resultados indicam que os níveis de lactose no leite, enquanto diminuição dos níveis de ácido láctico e os níveis de galactose aumentar, o que é um resultado da actividade metabólica da cultura de sementes. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54365/54365fig1.jpg" /> Figura 1. perfil de fermentação do arranque feito de fresco semi leite desnatado (1,5% de gordura, 3,5% de proteína). Um litro de leite foi inoculado com uma saqueta (1 g) de cultura de sementeira e fermentada a 37 ° C(••••, duplicar), bem como 45 ° C (- - - -, duplicar) durante 16 horas. A linha reta (----) em pH 4.4 é inserido como uma indicação para determinar quando a fermentação é concluída. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54365/54365fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54365/54365fig2.jpg" /> Figura 2. Perfil de fermentação do leite fermentado (produto final) feito de leite semi-desnatado (1,5% de gordura, 3,5% de proteína). Um litro de leite foi inoculado com 20 g de uma cultura fresca e fermentada a 37 ° C (•• ••, duplicar), bem como 45 ° C (- - - -, duplicar) durante 16 horas. A linha recta (----) a pH 4,4 é inserido como uma indicação para determinar quando a fermentação é terminada.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54365/54365fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54365/54365fig3.jpg" /> Figura 3. Os padrões de HPLC de eluição de leite não fermentado (preto) e leite fermentado durante 16 horas com a cultura de sementeira (azul). Os padrões de eluição indicar o consumo de lactose e de galactose e produção de lactato. Açúcares e ácidos fracos foram identificados com base no tempo de retenção eo rácio de UV-absorção e índice de refração de pico área de superfície. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54365/54365fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="tabela 1" src="/files/ftp_upload/54365/54365tbl1.jpg" /> Tabela Applica cultura 1. Semente<html> protocolo ção. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54365/54365tbl1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta tabela.</a> <img alt="mesa 2" src="/files/ftp_upload/54365/54365tbl2.jpg" /> Tabela 2. Propagação de Lactobacillus rhamnosus yoba 2012, em uma variedade de alimentos fermentados. Os dados foram obtidos a partir de Kort et al. 15. As fermentações foram levadas a cabo a 37 ° C, salvo indicação em contrário. A contagem de células de L. rhamnosu s yoba 2012 e S. thermophilus C106 após inoculação tanto variou entre 1 x 10 6 e 1 x 10 7 UFC mL -1. O mutandabota funcional foi preparado com um motor de arranque contendo exclusivamente L. rhamnosus yoba 2012 como relatado por Mpofu et al. 24; ND, não determinado.d 54365 / 54365tbl2large.jpg &quot;target =&quot; / _ blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta tabela. Arquivo suplementar. A produção local e vendas de iogurte probiótico na África rural. Tiros e imagens são tiradas em Balawoli e Namagera, Uganda, de Maio de 2016. O clipe mostra a cadeia de valor a partir de recepção de leite para processamento, embalagem, vendas e, finalmente, para o consumo de um lote de 50 litros de iogurte probiótico, preparado com o uso de apenas equipamentos básicos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54365/yoba_production_in_Uganda_suppl_material.mp4" target="_blank">por favor clique aqui para baixar.</a>

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Novel Production Protocol for Small-scale Manufacture of Probiotic Fermented Foods

A production protocol is described for the small-scale production of probiotic fermented dairy drink with the aid of a novel bacterial starter culture.

Protocolo de Produção da novela para em pequena escala Fabricação de alimentos fermentados probióticos

A novel dried bacterial consortium of Lactobacillus rhamnosus yoba 2012 and Streptococcus thermophilus C106 is cultured in 1 L of milk. This fresh starter ...

novel-production-protocol-for-small-scale-manufacture-probiotic

Research

JoVE Journal

Biology

23.5K visualizações.  Yoba for Life Foundation. A production protocol is described for the small-scale production of probiotic fermented dairy drink with the aid of a novel bacterial starter culture. 

Vídeo: Novel Production Protocol for Small-scale Manufacture of Probiotic Fermented Foods

Protocol for Mosquito Rearing (A. gambiae)

This protocol describes mosquito rearing in the insectary. The insectary rooms are maintained at 28&deg;C and ~80% humidity, with a 12 hr. day/night cycle. For this procedure, you'll need mosquito cages, 10% sterile sucrose solution, paper towels, beaker, whatman filter paper, glass feeders, human blood and serum, water bath, parafilm, distilled water, clean plastic trays, mosquito food (described below), mosquito net to cover the trays, vacuum, and a collection chamber to collect adults.

Protocol for Mosquito Rearing A. gambiae

This video illustrates the general techniques used to rear Anopheles gambiae in the laboratory. The methods for caring for laboratory mosquitoes are demonstrated through all stages of the organism's life cycle from larvae to pupae to blood-feeding adults.

Protocolo para a Criação Mosquito (A. gambiae)

This protocol describes mosquito rearing in the insectary. The insectary rooms are maintained at 28&deg;C and ~80% humidity, with a 12 hr. day/night ...

Biologia

Neutrophil Isolation Protocol

Neutrophil polymorphonuclear granulocytes (PMN) are the most abundant leukocytes in humans and among the first cells to arrive on the site of inflammatory immune response. Due to their key role in inflammation, neutrophil functions such as locomotion, cytokine production, phagocytosis, and tumor cell combat are extensively studied. To characterize the specific functions of neutrophils, a clean, fast, and reliable method of separating them from other blood cells is desirable for in vitro studies, especially since neutrophils are short-lived and should be used within 2-4 hours of collection. Here, we demonstrate a standard density gradient separation method to isolate human neutrophils from whole blood using commercially available separation media that is a mixture of sodium metrizoate and Dextran 500. The procedure consists of layering whole blood over the density gradient medium, centrifugation, separation of neutrophil layer, and lysis of residual erythrocytes. Cells are then washed, counted, and resuspended in buffer to desired concentration. When performed correctly, this method has been shown to yield samples of >95% neutrophils with >95% viability.

Neutrophils are among the first cells to arrive on the site of inflammatory immune response, and their functions and mechanisms have been studied extensively in vitro. We demonstrate a standard density gradient separation method to isolate human neutrophils from whole blood using commercially available separation media.

Isolamento de neutrófilos Protocolo

Neutrophil polymorphonuclear granulocytes (PMN) are the most abundant leukocytes in humans and among the first cells to arrive on the site of inflammatory ...

Lentivirus Production

RNA interference (RNAi) is a system of gene silencing in living cells. In RNAi, genes homologous in sequence to short interfering RNAs (siRNA) are silenced at the post-transcriptional state. Short hairpin RNAs, precursors to siRNA, can be expressed using lentivirus, allowing for RNAi in a variety of cell types. Lentiviruses, such as the Human Immunodeficiency Virus, are capable to infecting both dividing and non-dividing cells. We will describe a procedure which to package lentiviruses. Packaging refers to the preparation of competent virus from DNA vectors. Lentiviral vector production systems are based on a 'split' system, where the natural viral genome has been split into individual helper plasmid constructs. This splitting of the different viral elements into four separate vectors diminishes the risk of creating a replication-capable virus by adventitious recombination of the lentiviral genome. Here, a vector containing the shRNA of interest and three packaging vectors (p-VSVG, pRSV, pMDL) are transiently transfected into human 293 cells. After at least a 48-hour incubation period, the virus containing supernatant is harvested and concentrated. Finally, virus titer is determined by reporter (fluorescent) expression with a flow cytometer.

To make lentiviruses, DNA vectors are transfected into human 293 cells. After harvest and concentrating the supernatant, virus titer is determined by fluorescence expression with a flow cytometer.

Produção lentivírus

RNA interference (RNAi) is a system of gene silencing in living cells. In RNAi, genes homologous in sequence to short interfering RNAs (siRNA) are ...

A Protocol for the Production of KLRG1 Tetramer

Killer cell lectin-like receptor G1 (KLRG1) is a type II transmembrane glycoprotein inhibitory receptor belonging to the C type lectin-like superfamily. KLRG1 exists both as a monomer and as a disulfide-linked homodimer. This well-conserved receptor is found on the most mature and recently activated NK cells as well as on a subset of effector/memory T cells.
Using KLRG1 tetramer as well as other methods, E-, N-, and R-cadherins were identified as KLRG1 ligands. These Ca2+-dependent cell-cell adhesion molecules comprises of an extracellular domain containing five cadherin repeats responsible for cell-cell interactions, a transmembrane domain and a cytoplasmic domain that is linked to the actin cytoskeleton. 
Generation of the KLRG1 tetramer was essential to the identification of the KLRG1 ligands. KLRG1 tetramer is also a unique tool to elucidate the roles cadherin and KLRG1 play in regulating the immune response and tissue integrity.

This protocol describes the production of KLRG1 tetramer, which is a powerful tool for the analysis of KLRG1 ligands.

Um protocolo para a Produção de KLRG1 tetrâmero

Killer cell lectin-like receptor G1 (KLRG1) is a type II transmembrane glycoprotein inhibitory receptor belonging to the C type lectin-like superfamily. ...

DNA Extraction from Paraffin Embedded Material for Genetic and Epigenetic Analyses

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number gains and losses and DNA methylation. Advances in high-throughput, genome-wide profiling technologies, such as microarrays, have significantly improved our ability to identify and detect these specific alterations. However as technology continues to improve, a limiting factor remains sample quality and availability. Furthermore, follow-up clinical information and disease outcome are often collected years after the initial specimen collection. Specimens, typically formalin-fixed and paraffin embedded (FFPE), are stored in hospital archives for years to decades. DNA can be efficiently and effectively recovered from paraffin-embedded specimens if the appropriate method of extraction is applied. High quality DNA extracted from properly preserved and stored specimens can support quantitative assays for comparisons of normal and diseased tissues and generation of genetic and epigenetic signatures 1. To extract DNA from paraffin-embedded samples, tissue cores or microdissected tissue are subjected to xylene treatment, which dissolves the paraffin from the tissue, and then rehydrated using a series of ethanol washes. Proteins and harmful enzymes such as nucleases are subsequently digested by proteinase K. The addition of lysis buffer, which contains denaturing agents such as sodium dodecyl sulfate (SDS), facilitates digestion 2. Nucleic acids are purified from the tissue lysate using buffer-saturated phenol and high speed centrifugation which generates a biphasic solution. DNA and RNA remain in the upper aqueous phase, while proteins, lipids and polysaccharides are sequestered in the inter- and organic-phases respectively. Retention of the aqueous phase and repeated phenol extractions generates a clean sample. Following phenol extractions, RNase A is added to eliminate contaminating RNA. Additional phenol extractions following incubation with RNase A are used to remove any remaining enzyme. The addition of sodium acetate and isopropanol precipitates DNA, and high speed centrifugation is used to pellet the DNA and facilitate isopropanol removal. Excess salts carried over from precipitation can interfere with subsequent enzymatic assays, but can be removed from the DNA by washing with 70% ethanol, followed by centrifugation to re-pellet the DNA 3. DNA is re-suspended in distilled water or the buffer of choice, quantified and stored at -20&deg;C. Purified DNA can subsequently be used in downstream applications which include, but are not limited to, PCR, array comparative genomic hybridization 4 (array CGH), methylated DNA Immunoprecipitation (MeDIP) and sequencing, allowing for an integrative analysis of tissue/tumor samples.

This video demonstrates the protocol for DNA extraction from formalin-fixed paraffin-embedded material. This is a multi-day procedure in which tissue sections are deparaffinized with xylene, rehydrated with ethanol and treated with proteinase K to purify and isolate DNA for subsequent gene-specific or genome-wide analysis.

Extração de DNA de material parafinado Embedded para análises genéticas e epigenéticas

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number ...

High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing a biorefinery. These raw materials would constitute a new industrial platform, which is both sustainable and carbon neutral, to replace 
the current dependency on fossil fuel. The recalcitrance to deconstruction observed in lignocellulosic materials is produced by several intrinsic properties 
of plant cell walls. Crystalline cellulose is embedded in matrix polysaccharides such as xylans and arabinoxylans, and the whole structure is encased by the 
phenolic polymer lignin, that is also difficult to digest 1. In order to improve the digestibility of plant materials we need to discover the main bottlenecks 
for the saccharification of cell walls and also screen mutant and breeding populations to evaluate the variability in saccharification 2. These tasks require 
a high throughput approach and here we present an analytical platform that can perform saccharification analysis in a 96-well plate format. This platform has 
been developed to allow the screening of lignocellulose digestibility of large populations from varied plant species. We have scaled down the reaction volumes 
for gentle pretreatment, partial enzymatic hydrolysis and sugar determination, to allow large numbers to be assessed rapidly in an automated system.
This automated platform works with milligram amounts of biomass, performing ball milling under controlled conditions to reduce the plant 
materials to a standardised particle size in a reproducible manner. Once the samples are ground, the automated formatting robot dispenses specified and recorded 
amounts of material into the corresponding wells of 96 deep well plate (Figure 1). Normally, we dispense the same material into 4 wells to have 4 replicates for 
analysis. Once the plates are filled with the plant material in the desired layout, they are manually moved to a liquid handling station (Figure 2). In this 
station the samples are subjected to a mild pretreatment with either dilute acid or alkaline and incubated at temperatures of up to 90&deg;C. The pretreatment solution 
is subsequently removed and the samples are rinsed with buffer to return them to a suitable pH for hydrolysis. The samples are then incubated with an enzyme
mixture for a variable length of time at 50&deg;C. An aliquot is taken from the hydrolyzate and the reducing sugars are automatically determined by the MBTH 
colorimetric method.

A simple, rapid method for determining the saccharification potential of large numbers of plant biomass samples is described. The automated platform for this analysis involves the preparation of the plant biomass for analysis in 96 well plates and the subsequent performance of pretreatment, hydrolysis and quantification of the sugars released.

Alto rendimento Assay Sacarificação para materiais lignocelulósicos

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing ...

Small-scale Nuclear Extracts for Functional Assays of Gene-expression Machineries

A great deal of progress in understanding gene expression has been made using in vitro systems. For most studies, functional assays are carried out using extracts that are prepared in bulk from 10-50 or more liters of cells grown in suspension. However, these large-scale preparations are not amenable to rapidly testing in vitro effects that result from a variety of in vivo cellular treatments or conditions. This journal video article shows a method for preparing functional small-scale nuclear extracts, using HeLa cells as an example. This method is carried out using as few as three 150 mm plates of cells grown as adherent monolayers. To illustrate the efficiency of the small-scale extracts, we show that they are as active as bulk nuclear extracts for coupled RNA Polymerase II transcription/splicing reactions. To demonstrate the utility of the extract protocol, we show that splicing is abolished in extracts prepared from HeLa cells treated with the splicing inhibitor drug E7107. The small-scale protocol should be generally applicable to any process or cell type that can be investigated in vitro using cellular extracts. These include patient cells that are only available in limited quantities or cells exposed to numerous agents such as drugs, DNA damaging agents, RNAi, or transfection, which require the use of small cell populations. In addition, small amounts of freshly grown cells are convenient and/or required for some applications.

A protocol for preparation of robust, small-scale HeLa nuclear extracts is described. This protocol is valuable for assays that require use of small populations of cells, such as cells treated with drugs or RNAi. The method should be applicable to a wide variety of gene expression assays and other cell types, including patient cells.

Os pequenos extratos nucleares para ensaios funcionais da expressão gênica Machineries

A great deal of progress in understanding gene expression has been made using in vitro systems.  For most studies, functional assays are carried out using ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial respirometric assays from isolated mitochondrial preparations allow for the assessment of mitochondrial function, as well as determination of the mechanism(s) of action of drugs and proteins that modulate metabolism. Current isolation procedures often require large quantities of tissue to yield high quality mitochondria necessary for respirometric assays. The methods presented herein describe how high quality purified mitochondria (~ 450 &#181;g) can be isolated from minimal quantities (~75-100 mg) of mouse skeletal muscle for use in high throughput respiratory measurements. We determined that our isolation method yields 92.5&#177; 2.0% intact mitochondria by measuring citrate synthase activity spectrophotometrically. In addition, Western blot analysis in isolated mitochondria resulted in the faint expression of the cytosolic protein, GAPDH, and the robust expression of the mitochondrial protein, COXIV. The absence of a prominent GAPDH band in the isolated mitochondria is indicative of little contamination from non-mitochondrial sources during the isolation procedure. Most importantly, the measurement of O2 consumption rate with micro-plate based technology and determining the respiratory control ratio (RCR) for coupled respirometric assays shows highly coupled (RCR; &#62;6 for all assays) and functional mitochondria. In conclusion, the addition of a separate mincing step and significantly reducing motor driven homogenization speed of a previously reported method has allowed the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle that results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Here, we present a modification of a previously reported method that allows for the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle. This procedure results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Isolamento de mitocôndrias de quantidades mínimas de Rato Músculo Esquelético para medições High Throughput Microplate respiratórias

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both mitochondrial (respiration) and non-mitochondrial (other redox) reactions consume oxygen, but these reactions can be easily distinguished by chemical inhibition of mitochondrial respiration. However, while mitochondrial oxygen consumption is an unambiguous and direct measurement of respiration rate2, the same is not true for extracellular acid production and its relationship to glycolytic rate 3-6. Extracellular acid produced by cells is derived from both lactate, produced by anaerobic glycolysis, and CO2, produced in the citric acid cycle during respiration. For glycolysis, the conversion of glucose to lactate- + H+ and the export of products into the assay medium is the source of glycolytic acidification. For respiration, the export of CO2, hydration to H2CO3 and dissociation to HCO3- + H+ is the source of respiratory acidification. The proportions of glycolytic and respiratory acidification depend on the experimental conditions, including cell type and substrate(s) provided, and can range from nearly 100% glycolytic acidification to nearly 100% respiratory acidification 6. Here, we demonstrate the data collection and calculation methods needed to determine respiratory and glycolytic contributions to total extracellular acidification by whole cells in culture using C2C12 myoblast cells as a model.

Glycolysis is a defining metabolic marker in multiple biological systems. Monitoring glycolysis by measuring the extracellular flux of H+ is common, but requires correction to be quantitative and unambiguous. Here, we demonstrate how to gather and correct extracellular flux data to distinguish between respiratory and glycolytic sources of extracellular acidification.

Medição e Análise de Produção de Ácido Extracelular determinar Glicosidases Classificação

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both ...

A Multi-hole Cryovial Eliminates Freezing Artifacts when Muscle Tissues are Directly Immersed in Liquid Nitrogen

Studies on skeletal muscle physiology face the technical challenge of appropriately processing the specimens to obtain sections with clearly visible cytoplasmic compartments. Another hurdle is the tight apposition of myofibers to the surrounding tissues. Because the process of tissue fixation and paraffin embedding leads to the shrinkage of muscle fibers, freezing is an optimal means of hardening muscle tissue for sectioning. However, a commonly encountered issue, the formation of ice crystals, occurs during the preparation of frozen sections because of the high water content of muscle. The protocol presented here first describes a simple and efficient method for properly freezing muscle tissues by immersing them in liquid nitrogen. The problem with using liquid nitrogen alone is that it causes the formation of a nitrogen gas barrier next to the tissue, which acts as an insulator and inhibits the cooling of the tissues. To avoid this "vapor blanket" effect, a new cryovial was designed to increase the speed of liquid flow around the tissue surface. This was achieved by punching a total of 14 inlet holes in the wall of the vial. According to bubble dynamics, a higher rate of liquid flow results in smaller bubbles and fewer chances to form a gas barrier. When liquid nitrogen flows into the cryovial through the inlet holes, the flow velocity around the tissue is fast enough to eliminate the gas barrier. Compared to the method of freezing muscle tissues using pre-chilled isopentane, this protocol is simpler and more efficient and can be used to freeze muscle in a throughput manner. Furthermore, this method is optimal for institutions that do not have access to isopentane, which is extremely flammable at room temperature.

This protocol describes a procedure to freeze muscle tissues by plunging them directly into liquid nitrogen. This protocol also highlights a new cryovial that can avoid the &#34;blanket effect&#34; of nitrogen gas when liquid nitrogen contacts the tissue surface of a specimen.

Um multi-furo criotubo Elimina congelação Artifacts quando tecidos musculares são directamente Imerso em azoto líquido

Studies on skeletal muscle physiology face the technical challenge of appropriately processing the specimens to obtain sections with clearly visible ...