Este protocolo foi concebido para abordar uma questão muito importante e não resolvida sobre como substâncias microbianas presentes e alérgenos ambientais podem regular o desenvolvimento de inflamações alérgicas. Especificamente, os métodos aqui apresentados podem ajudar a responder se as espécies de RNA de duplar encalhadas em ácaros domésticos são imunogênicas in vivo e capazes de modular a inflamação pulmonar eosinofílica. As principais vantagens dessas técnicas são que elas são simples, eficientes, altamente reprodutíveis e podem ser realizadas usando ferramentas e equipamentos comumente usados.
Esses métodos também podem ser utilizados para avaliar doenças pulmonares causadas por infecções virais respiratórias. Li She, uma estudante de pós-graduação no meu laboratório, ajudará a demonstrar o procedimento. Comece isolando o RNA total de alérgenos, insetos e alérgenos não-insetos.
Transfira uma quantidade adequada de espécime para um tubo de dois mililitros contendo 1,4 milímetros de contas cerâmicos, e congele os tubos em um recipiente de nitrogênio líquido por aproximadamente 10 minutos. Adicione um mililitro de reagente de isolamento RNA à base de tiocianato de guanidinium em cada tubo. Em seguida, quebre os animais pequenos insetos e não-insetos com um disruptor de células de alta energia em velocidade máxima por 45 segundos.
Esfrie a amostra no gelo e repita esse processo duas vezes. Transfira a solução para um novo tubo de 1,5 mililitro. Adicione 200 microlitadores de clorofórmio a cada tubo, e vórtice da amostra.
Centrifugar os tubos a 14.000 vezes g por 14 minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, transfira a fase aquosa superior para um novo tubo contendo 500 microliters de isopropanol. Misture a amostra.
Em seguida, centrifuá-lo a 14.000 vezes g por 14 minutos a quatro graus Celsius. Aspire cuidadosamente o supernascida. Em seguida, lave a pelota de RNA com 500 microliters de 75% de etanol, e centrífuga-a a 7.500 vezes g por 10 minutos a quatro graus Celsius.
Remova cuidadosamente todo o líquido. Seque a pelota e dissolva o RNA com 20 a 50 microliters de água sem RNase. Para detectar as estruturas de RNA de duplar encalhadas no RNA total, localmente dois microlitres da amostra de RNA de 200 nanogramas por microliter na membrana de nylon carregada positivamente.
Cruze as amostras para a membrana a 1.200 microjoules por 100 em um crosslinker UV. Repita a mancha e o crosslinking mais duas vezes, o que resultará em um total de 1,2 microgramas de RNA por mancha. Bloqueie a ligação não específica com 5% de leite em TBS-T durante uma hora enquanto treme à temperatura ambiente.
Em seguida, remova a solução de bloqueio e adicione o anticorpo RNA J2 anti-duplo-encalhado em uma diluição de 1 a 1.000 em 1% de leite em TBS-T. Incubar a membrana durante a noite com tremor a quatro graus Celsius. No dia seguinte, lave a membrana três vezes com TBS-T por cinco minutos por lavagem.
Adicione o anticorpo secundário e incubar a membrana por uma hora em temperatura ambiente. Em seguida, repita as lavagens com TBS-T. Adicione o substrato e incubar a membrana por cinco a 15 minutos até que um sinal desejado seja visível.
Pare a reação enxaguando a membrana com água duplamente destilada. Para coletar as amostras de pulmão, coloque os pulmões em papéis de tecido, e extirbe um pequeno pedaço de cada lobo pulmonar. Coloque cada peça em um tubo de dois mililitros contendo contas.
Para coletar lavagem broncoalveolar, desinfetar um rato eutanizado com 70% de etanol, e usar uma tesoura para cortar a pele da área superior do abdômen até o pescoço. Puxe suavemente as glândulas salivares e o músculo esternoide com fórceps para expor a traqueia. Em seguida, coloque uma corda de nylon sob ele.
Faça uma incisão na traqueia aproximadamente dois mililitros sob a laringe apenas o suficiente para inserir uma cânula, e nó a corda em torno da traqueia e cânula. Coloque uma seringa na extremidade da cânula e carregue-a com PBS-EDTA fresco. Em seguida, injete e aspire um mililitro da solução no pulmão.
Retire a seringa da cânula e ejete a solução em um tubo de 15 mililitros. Repita este processo para gelo com PBS-EDTA fresco, e acumule o lavage. Centrifugar o tubo a 500 vezes g por sete minutos a quatro graus Celsius.
Em seguida, registe o volume e transfira o supernante para dois tubos de 1,5 mililitro sem perturbar a pelota. Depois de reutilizar a pelota, transfira 150 microliters em uma placa de 96 poços, e centrifugar a placa por sete minutos a 500 vezes g e quatro graus Celsius. Em seguida, inverta rapidamente a placa em papel de tecido para remover o supernante.
Manche as células com anticorpos no tampão FACS na presença de anticorpos bloqueadores de 2,4G2 e incubar a placa em temperatura ambiente por 30 minutos no escuro. Após a coloração, centrifufique a placa para pelotar as células a 500 vezes g por sete minutos a quatro graus Celsius. Remova a solução de coloração invertendo a placa em papel de tecido.
Adicione 100 microliters de tampão FACS para lavar as células e, em seguida, repita a centrifugação. Resuspenha as amostras em 150 microliters de tampão FACS e, em seguida, transfira-as para tubos FACS contendo 350 microliters adicionais de buffer. Adicione 25 microliters de contas de contagem a cada amostra e proceda com a análise de citometria de fluxo.
A presença de longas estruturas de RNA de dois fios em ácaros, insetos e animais pequenos não-insetos foi examinada por mancha de ponto usando um anticorpo monoclonal de camundongos de dois fios, específico do RNA. RNase III foi usado para digerir o RNA de dois fios em fragmentos de par de base de 12 a 15, que eram indetectáveis por J2. A capacidade do RNA total de ácaros de poeira doméstica para estimular uma resposta imune inata nos pulmões do camundongo foi demonstrada pelo RT-qPCR. O tratamento RNase III aboliu a atividade imunoestimulatória do RNA total de ácaros de poeira doméstica, indicando que as estruturas de RNA de duplar encalhadas são essenciais para a atividade imunológica inata nos pulmões.
O efeito inibidor do rna total de ácaros de poeira doméstica no desenvolvimento de uma inflamação pulmonar grave tipo dois foi avaliado com a análise FACS. A inflamação pulmonar eosinofílica foi induzida por extratos de ácaros, que foram tratados com ou sem RNase III. A degradação de longas espécies de RNA de dois fios resultou em inflamação pulmonar grave tipo dois, refletida pelo aumento do número de eosinófilos na lavagem broncoalveolar e nos pulmões.
Notavelmente, o número de eosinófilos no grupo total tratado de RNA de ácaros é comparável ao grupo tratado com o extrato original de ácaro de poeira que continha endógenamente a longa espécie de RNA de duas cadeias. Ao tentar este protocolo, tenha muito cuidado ao injetar e recolher o fluido BAL, pois qualquer dano aos pulmões nesta fase pode alterar os resultados finais. Além desse procedimento, outros métodos como o ELISA podem ser realizados para analisar conteúdos solúveis não celulares presentes no fluido BAL.
Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para os pesquisadores explorarem outras substâncias microbianas presentes em alérgenos ambientais, como fatores de RNA não duplamente encalhados que podem regular o desenvolvimento de inflamação pulmonar alérgica.
