A amputação P3 é um modelo pré-clínico para investigar a regeneração epimórfica dos mamíferos e uma poderosa ferramenta para identificar populações e mecanismos de células críticas que controlam a regeneração endógena. O modelo P3 permite a identificação de populações de células explosivas precoces e tardias, o estudo da revascularização durante a regeneração e a investigação da ossificação intramembrana sem requisitos complexos de dispositivo de estabilização óssea. Demonstrando o procedimento comigo estarão Osama Qureshi, Alyssa Falck, e Katherine Zimmel, técnica, e Regina Brunaeur, professora assistente de pesquisa do nosso laboratório.
Depois de confirmar a falta de resposta ao beliscão do dedo do dedo em um mouse CD-1 de oito a 12 semanas de idade, aplique pomada aos olhos do animal e coloque o mouse sob um microscópio de dissecção de 10X. Use iodo de povidona cirúrgica e 70% de etanol para esterilizar os dígitos de cada membro traseiro e usar microscisores para cortar os cabelos longe do local cirúrgico. Aplique um microliter de bupivacaína tópica localmente para anestesiar o local cirúrgico, e levemente jogar uma pata traseira para expor a superfície do dígito medial.
Em seguida, segurando o bisturi em um ângulo paralelo à almofada de gordura, use um bisturi estéril número 10 para amputar a ponta distal da falange terminal de dígitos dois e quatro. Aplique um microliter adicional de bupivacaína localmente a cada dígito amputado e devolva o rato a uma gaiola limpa para permitir que as feridas se curem sem curativo de ferida e com monitoramento até a recumbência total. Para assegurar um plano de amputação P3 bem sucedido, segure o bisturi paralelo à almofada de gordura durante a amputação e realize a varredura micro-CT para confirmar o comprimento correto da amputação.
No ponto final experimental apropriado, use um bisturi para cortar o dígito no meio do osso da falange média aproximadamente no segundo recuo da almofada de gordura ventral. Transfira o tecido para um frasco de cintilação de 20 mililitros contendo 10 mililitros de formalina de zinco tamponada fresca fixativa por 24 a 48 horas. E use um microtome para adquirir seções de quatro a cinco micrômetros de espessura de cada dígito, colocando as fatias em um banho de água de 38 a 41 graus Celsius complementado com uma solução adesiva histológica à medida que são obtidas.
Em seguida, capture as fatias em slides adesivos e coloque os slides em um aquecedor de slides Celsius de 37 graus para secar. Quando os slides tiverem sido desparafinados, mergulhe as amostras em um frasco de coloração de uma solução de recuperação de antígeno apropriada, e aqueça os slides a 95 graus Celsius por 25 minutos, certificando-se de que a ebulição não ocorra. No final da incubação, permita que o frasco chegue à temperatura ambiente, e coloque os slides em uma caixa de slides de plástico coberta de uma polegada com papel de tecido umedecido na base.
Adicione 100 microliters de proteínas pré-armadase K a cada amostra. Cubra cada slide com uma pequena faixa de parafilm para garantir que as seções não fiquem secas. Após 12 minutos a 37 graus Celsius, remova cuidadosamente o filme de parafina e drene suavemente as lâminas em papel de tecido para remover o excesso de solução de bloqueio.
Em seguida, adicione 100 a 200 microliters da solução de anticorpos primária de interesse a cada slide. Devolva os locais à câmara umidificante coberta com filme de parafina para uma incubação noturna a quatro graus Celsius. Na manhã seguinte, depois de lavar os slides em soro fisiológico tamponado tris mais etiqueta TWEEN ou TBST os slides com uma solução de anticorpos secundários apropriada para uma incubação de 45 minutos à temperatura ambiente protegido da luz.
No final da incubação, lave os slides em TBST e deixe-os secar. Em seguida, use 100 microliters de meio de montagem anti-fade para colocar cuidadosamente as tampas nos slides secos e armazenar os slides plano à temperatura ambiente durante a noite protegidos da luz para permitir que o meio de montagem seque. Para a tomografia microcomputante in vivo ou micro-CT, o microcsor com tubos para permitir o fluxo de oxigênio dentro e fora da câmara animal micro-CT, certificando-se de que o oxigênio de saída está equipado com um filtro de carvão ativado para prender o isoflurane.
Defina o Voxelsize para 10,5 micrômetros a 55 quilovoltage de pico e 145 microamps com 1.000 projeções por 180 graus e rotação contínua com um Tempo de Integração de 200 milissegundos, resultando em um máximo de 213 fatias por varredura. Quando o scanner estiver pronto, coloque suavemente o rato anestesiado na câmara animal micro-CT com os dígitos do membro traseiro dispostos em lado ventral de associação plana e próxima para cima com a pata esquerda no lado esquerdo e a direita no lado direito da plataforma de varredura. Em seguida, aplique fita cirúrgica para fixar suavemente os dígitos no lugar.
Aplique pomada oftálmica aos olhos do animal antes de iniciar o exame. Após a varredura, devolva o animal a uma gaiola limpa com monitoramento até a recumbência total, e permita até várias horas para reconstrução de imagens microcS. Para análise da imagem óssea 3D reconstruída, usando o software fornecido com o micro-CT, converta os arquivos de imagem em uma série de arquivos DICOM.
Quando todos os arquivos tiverem sido convertidos, baixe a série DICOM em uma única pasta usando um downloader de arquivos em lote em um navegador da Web. Carregue o plug-in BoneJ na pasta plug-in ImageJ. Arraste e solte a pasta da série de arquivos DICOM na barra ImageJ para abrir os arquivos.
Uma pilha de imagens de 16 bits exibindo todos os valores cinzentos será aberta. Para exibir somente osso, clique em Ajustar e Limiar de imagem. Deslize a barra superior para a extrema direita e ajuste a barra inferior até que apenas o osso seja destacado vermelho.
O menor valor de limiar será de aproximadamente 10.000 a 13.000 a uma intensidade máxima de sinal de 32.767. Clique em Aplicar e na nova caixa de diálogo, clique em Plano de Fundo Preto. Em seguida, clique em OK. Uma imagem de oito bits exibindo valores em preto e branco será gerada.
Com o branco correspondente ao osso. Desenhe um retângulo ao redor do osso P3 para selecioná-lo e duplicar a pilha. Para gerar uma imagem 3D, clique em Plugins e 3D Viewer e use a ferramenta de seleção à mão livre para circular o osso a ser excluído.
Em seguida, clique com o botão direito do mouse e selecione Preencher a seleção para cortar qualquer osso desnecessário da imagem. Para quantificar o volume ósseo da renderização 3D, abra o plug-in BoneJ e selecione a Fração de Volume. Uma janela de resultados aparecerá e o volume ósseo exibido em milímetros cúbicos.
Para quantificar o comprimento do osso da renderização 3D, use a ferramenta ImageJ multipoint. Para capturar uma imagem da renderização 3D, clique em Exibir e tirar uma foto. Em seguida, salve a imagem como um arquivo TIF ou JPEG.
Nestas imagens, seções de um rato adulto regenerando dígito P3 foram imunossuídas com anticorpos para visualizar a regeneração óssea intramembrana e a formação de blastema nos dias seis a sete, nove e 10 pós-amputação. Aqui, são mostradas renderizações representativas de microcsps de dígitos digitalizados antes da amputação e em vários pontos de tempo ao longo da regeneração com marcos utilizados para identificar medidas de comprimento. O modelo de dígito do rato é um sistema poderoso para analisar um ambiente de ferida pró-regenerativa que desencadeia a formação de blastema quando amputado a um nível distal.
Por outro lado, a amputação proximal dos dígitos serve como um sistema modelo para investigar a falha regenerativa, bem como um local para testar estratégias para melhorar a regeneração.
