Name: transient middle cerebral artery occlusion model of neonatal stroke in p10 rats
Uploaded: 2017-04-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transient Middle Cerebral Artery Occlusion Model of Neonatal Stroke in P10 Rats at JoVE.com

Funding was provided by the NIH K08 NS064094 and UCSF REAC grants. The authors would like to acknowledge Nikita Derguin, Zinalda Vexler, and Joel Faustino for their assistance in the development of this technique.

Toda a pesquisa animal foi aprovado pela Universidade da Califórnia, o Comitê de San Francisco em Pesquisa Animal e foi realizada de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (Departamento de Saúde e Serviços Humanos, Publicação No. 85-23, 1985 EUA ). Os animais foram acompanhados de perto por veterinários da Comissão de UCSF Institucional animal Cuidado e Uso (IACUC), credenciado pela AAALAC. Obteve-se uma fêmea Sprague-Dawley com uma maca oito dias de idade (10 filhotes por ninhada). A mãe e seus filhotes receberam comida e água ad libitum e alojados em uma instalação de cuidados de animais com temperatura e luz controlada com o enriquecimento diário, por protocolo IACUC, até que os filhotes foram 10 dias de idade. Todos os instrumentos cirúrgicos utilizados neste procedimento foram autoclavados para garantir a esterilidade. Sterility de dicas de instrumento é mantida durante toda a cirurgia. 1. Oriente oclusão da artéria cerebral <ol><li> Pesar o filhote e assegue que é o peso adequado (19-21 g). Anestesiar a cinzento em 3% de isoflurano em 100% de O2 e assegurar que não há resposta a uma pitada pé. Manter a temperatura da superfície do corpo entre 35,5 ° C e 37 ° C com o uso de uma almofada de aquecimento sob o estrado cirúrgico. </li><li> Garantir o animal em decúbito dorsal com fita adesiva em todas as regiões do ombro. Usando cotonetes estéreis, pincelar a área cervical anterior com uma solução de povidona-iodo seguido por uma haste de 70% de etanol em água destilada duas vezes, alternando entre cada solução durante quatro cotonetes totais. </li><li> Localmente infiltrar bupivacaína a 0,25% para o local da incisão planeada. Usando um estereoscópio, fazer uma linha média incisão cervical de 5 a 7 mm anterior para expor a artéria carótida comum (ACC). Coloque 2-4 retratores para manter a cavidade aberta ea artéria exposta. </li><li> Localizar a artéria carótida interna (ICA), artéria occipital (OA), e a artéria carótida externa (ECA). Noivo artérias para obter uma visão clara. Seja de carroeful para não perturbar o nervo vago. NOTA: Para filhotes sham-operado, o inicision é deixada em aberto e as artérias estão expostos, após o qual a incisão é suturada fechada. O tempo total de anestesia é equivalente ao da cirurgia de oclusão. </li><li> Cortar 1,5 cm de seda 6-0 fio trançado de sutura. Unbraid a sutura, puxando cadeias simples. Certifique-se de que as cadeias simples são puros e não desgastado. NOTA: Se necessário, alisar as extremidades desgastadas por imersão a cadeia simples em ua estil e preparar o filamento com pontas fórceps. </li><li> Enquanto segura o fio de sutura com uma pinça de 45 graus, mova a pinça em um movimento de arco varrendo para ir ao abrigo do AIC para que as pontas fórceps emergir entre o ICA e OA. NOTA: Se a dissecção é bem feito, esta etapa será relativamente fácil. Se o ICA e OA se tocam, ter cuidado para não romper as artérias ao usar a pinça para isolar o ICA. Se ocorre sangramento, aplicar pressão à artéria com a pinça atéo sangramento pára. Absorver o sangue com uma zaragatoa estéril. </li><li> Agarre o fim do fio de sutura que é realizada pelas pinças e puxá-lo para que o final é de fácil acesso. Libertar a cadeia a partir dos fórceps e voltar a pinça para fora de debaixo da AIC, invertendo o movimento no passo 1.5 (Figura 1A). </li><li> Amarrar uma ligadura temporária em torno do ACI na base, mais próxima de onde ele se separa do CCA. NOTA: É importante para o nó de modo a que a extremidade do fio que irá ser puxada para remover o nó é o tempo suficiente (superior a 1 mm, menos do que 3 mm) para agarrar facilmente com uma pinça, assegurando ao mesmo tempo que há uma quantidade apropriada de fio de sutura sobre o outro lado do nó para retracção. </li><li> Cuidadosamente retrair o ICA lateralmente e usar um grampo para prender o fio para o excesso de pele perto da região da axila do lado oposto ao da incisão. Certifique-se de que esta cadeia de retracção é tenso suficiente para parar o fluxo de sangue antes de prosseguir para o próximo passo, aminimizar o risco de sangramento descontrolado. Observa-se que a artéria é plana e pálido. NOTA: Não excesso de retração, pois pode causar uma ruptura parcial ou total do ICA. A retracção pode ser ajustado apenas antes de fazer a arteriotomia puxando sobre o fio, no lado oposto ao grampo. </li><li> Usar 45 ° pinça para agarrar um outro fio de sutura soltos e ciclo-lo sob e em torno do ACI, como no passo 1.5. Posicionar este cordão lateralmente à cadeia de retracção (Figura 1B). NOTA: Este passo também pode ser feito antes de retração. Se não tiver certeza sobre a qualidade da retração, este nó pode ser muito vagamente amarrado antes da próxima etapa. </li><li> Cortar uma arteriotomia a meio caminho entre os 0,2 milímetros e amarradas ligaduras não ligados, erring mais perto da ligadura amarrado. NOTA: O sangue restante na artéria amarrado-off pode esvaziar por meio da arteriotomia, mas não deve ser superior a 5 mL. Se a hemorragia persistir, puxar cuidadosamente o fio de retracção para aumentar a retracção, com o cuidado de umvazio danificar a artéria a partir de uma tensão excessiva. </li><li> Usando uma régua métrica, medir a sutura de oclus e cortar o fio de sutura com uma redução adicional de 2-3 mm para a remoção do oclusor durante a reperfusão. Segure o oclusor com uma pinça de 45 graus e utilize uma pinça reta para criar uma curva no comprimento adequado para chegar ao MCA, marcando um ponto de parada para o avanço. NOTA: Um comprimento de oclus 10 mm a partir da extremidade da ponta de silicone para a curvatura é usado para P10 Sprague Dawley ou ratos Long Evans crias nesta gama de peso. </li><li> Usando fórceps 45 °, alimentar a sutura oclusão de nylon revestido a silicone para o arteriotomia e avançar o fio de sutura para a curvatura que marca a distância pré-determinada para a MCA (Figura 1C). Certifique-se de que o avanço é suave; parar imediatamente o avanço se sentir resistência. Durante o avanço, o objectivo da sutura numa direcção que é paralela ao CC / CEA, para a cabeça. NOTA: Se a sutura é dorsalmente avançado, em direçãoespinha do animal, ele pode ser executado na artéria pterigopalatina (PTA). Se houver resistência depois de 3-5 mm de avanço, a sutura tenha atingido a junção PTA. Cópias do oclusor para fora da artéria até que a cabeça de silicone é perto da arteriotomia antes de ajustar a direcção do avanço. Não é necessário para remover completamente o oclusor da arteriotomia. </li><li> Fixar o oclusor atando uma ligadura temporária, utilizando o filamento a partir do passo 1.10 (Figura 1D). </li><li> Remova o clipe afastador. Aparar os fios de ambas as ligaduras temporárias de modo que a cadeia do nó que é puxada para remover o nó é fácil de agarrar com fórceps rectas e é mais longo do que o cordão que é puxada para apertar o nó. NOTA: Os fios devem ser curto o suficiente para que eles não se enredar na cavidade após o encerramento. </li><li> Retire os retratores e fechar a cavidade utilizando seda 6-0 trançado para criar três a quatro suturas interrompidas. </li><li> Remover o filhote deanestesia e colocá-lo em uma almofada de aquecimento em ar ambiente. Monitorar o filhote até que ele recuperou a consciência suficiente para manter decúbito esternal e garantir que ele está totalmente recuperado antes de voltar para a represa. Certifique-se de que o cachorro mantém uma temperatura da superfície do corpo entre 35,5 ° C e 37 ° C. </li><li> Durante a oclusão, imagens de ressonância magnética ponderadas por difusão (DW-MRI) sob anestesia com isoflurano pode ser utilizado para verificar a iniciação adequada de lesão. A Figura 2 demonstra a lesão isquémica em curso detectada por DW-MRI durante tMCAO 9. NOTA: A difusão ponderada rotação de imagem planar eco é realizada 10-15 minutos antes da reperfusão. Todo o cérebro é representada por imagem com secções coronais de 2 mm de espessura em série usando as seguintes configurações de sequências de pulso: TR / TE = 5000/60 ms, 4 médias, campo de visão = 35 mm, matriz de dados = 128x128, duração gradiente de difusão = 20 ms, a separação = 29,7 ms, de amplitude = 70mT / m, e b-factor = 1,045 s / mm 2.Os animais que exibem uma falta de envolvimento cortical ou lesão isquémica atípica, tal como na base do cérebro, estão excluídos. </li></ol> 2. A reperfusão NOTA: A oclusão é realizada durante 3 horas para fazer com que uma quantidade moderada a grave de lesões envolvendo o corpo estriado e ctex. <ol><li> Em cerca de 2 h e 50 min após a oclusão da MCA, anestesiar a cinzento em 3% de isoflurano em 100% de O2. Manter uma temperatura de superfície corporal entre 35,5 ° C e 37 ° C com o uso de uma almofada de aquecimento sob o estrado cirúrgico. </li><li> Retirar as suturas interrompidas a partir do passo 1.16 e localizar a junção, que é marcada por as duas ligaduras e a extremidade de cauda da sutura de oclus. NOTA: animais sham-operados são induzidas e permanecem sob anestesia por um período de tempo equivalente ao dos animais obstruídos. A incisão é novamente aberta e suturada fechada. Para os animais sham-operado, vá para o passo 2.11. </li><li> cuidadosamente desataro nó mais lateral previamente amarrados no passo 1.14, puxando o fio mais longo. NOTA: Se houver resistência em desatar o nó, pare para garantir que o fio correto do nó está sendo puxado. Se a resistência continua, aumentar a ampliação para uma melhor visualização. Seja cauteloso quando desatar, como é possível danificar a artéria durante esta etapa. </li><li> Remover o fio de sutura a partir da cavidade. </li><li> No exactamente 3 h após a oclusão MCA, lentamente para trás a sutura de oclus para fora da artéria. Não haverá resistência. NOTA: Na maioria dos casos, não haverá sangramento. Se uma pequena quantidade de hemorragia ocorre, aplicar pressão com a artéria no local da arteriotomia. </li><li> Utilizar uma pinça para aplicar pressão à arteriotomia, como o passo seguinte restaura o fluxo de sangue para ICA reperfusão. </li><li> Cuidadosamente desatar o nó medial utilizando o mesmo método que no passo 2.3. </li><li> Remover o fio de sutura a partir do corpo e aplicar um agente hemostático para o arteriotomia para parar a hemorragia. </li&gt; <li> Certifique-se de que o sangramento parou. NOTA: O Retorno de forma original da artéria e cor vermelha confirma que o fluxo sanguíneo ICA foi restaurado. </li><li> Retire os retratores e fechar a cavidade com três a quatro suturas interrompidas de seda 6-0 trançado. </li><li> Remover o filhote da anestesia e colocá-lo em uma almofada de aquecimento em ar ambiente. Monitorá-lo até que tenha recuperado a consciência suficiente para manter decúbito esternal e garantir a recuperação total antes de voltar para a represa. Certifique-se de que o cachorro mantém uma temperatura da superfície do corpo entre 35,5 ° C e 37 ° C. </li><li> Inspeccionar os filhotes por dia durante 5 dias. Recprd seus pesos e inspecionar os locais de incisão de perto para a cura apropriada. Retirar as suturas após 7-14 dias. Lesão pós-tMCAO pode ser trabalhada com MRI, se desejado 9. NOTA: Os animais podem perder até 1 g de peso no primeiro dia, mas normalmente recuperar o peso sem intervenção e estar dentro de um semelhante pesart gama de controlos por dia 4-5. Raramente, um cachorro pode perder o excesso de peso ou têm dificuldades de alimentação, o que requer sonda oral alimenta durante 2-3 dias. </li><li> Em P21, as lesões podem ser fiavelmente avaliada com testes comportamentais sensório-motores, tais como a criação de rotarod ou cilindro. Testes cognitivos pode ser realizado tão cedo quanto 4-6 semanas de idade usando avaliações tal como novo reconhecimento de objectos ou do labirinto de água de Morris 13. </li><li> Eutanásia os ratos por injecção intraperitoneal de Euthasol (50 mg / kg) para a colheita cérebro 11, 12. </li><li> A análise histológica para avaliar o volume da lesão ou resposta a intervenções podem ser realizadas com violeta de cresilo ou coloração de H &amp; E (Figura 3) 10. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

passos críticos dentro do protocolo Em primeiro lugar, é importante para manutenção da temperatura a partir do início da anestesia até à recuperação total, como não são conhecidos os efeitos de ambos hipotermia 17 e hipertermia 18 sobre a progressão da lesão cerebral, tanto em animais imaturos e maduros. Em segundo lugar, ao mesmo tempo garantir o animal e retracção da incisão, o posicionamento ideal para monitorizar a respiração e para assegurar que a traqueia é livre de compressão é essencial. Terceiro, evite espremer ou esticar o nervo vago, pois isso pode causar alterações na frequência cardíaca com a estimulação vagal. Em quarto lugar, porque a retracção da ICA é necessário para controlar a hemorragia durante a arteriotomia, deve ser dada atenção ao grau de tensão durante a retracção para evitar danificar a artéria. Se a artéria se rasgue de retracção, ou se existe um mau incisão arteriotomia, o animal deve ser excluída da análise devido ao riscode hemorragia e pobre reperfusão. Modificações e solução de problemas Usando MRI como um guia, o comprimento do fio de sutura pode ser optimizada para garantir que a ponta de silicone oclui adequadamente a MCA para criar a isquemia focal. Se MRI não está disponível, os filhotes podem ser sacrificados antes da reperfusão para dissecação para visualizar a colocação da sutura. Ajustar o comprimento de fio de sutura, conforme necessário. O peso das crias altamente correlacionado com os requisitos de comprimento de sutura de oclus. O tempo de oclusão pode ser modificado para ajustar o grau de severidade da lesão. Além disso, a forma e comprimento da sutura são críticos. Para P10 ratos Sprague-Dawley e Long Evans pesando 19-21 g, 10 mm é o comprimento óptimo da inserção na nossa experiência. Além disso inserção da sutura de oclus pode resultar na perfuração da MCA. Além disso, a consistência da forma do filamento de oclus em cada cirurgia irá resultar num aumento da consistência da lesão pattern 19, 20. Por este motivo, recomendamos utilizando suturas profissionalmente-fabricados para esse fim específico. Também é importante notar que o padrão de lesão podem diferir entre os profissionais, devido às diferenças aparentemente hora em técnica. Limitações da técnica Realizar esta técnica em uma pequena, desenvolvendo roedor requer experiência significativa. Se realizada corretamente, o cirurgião é capaz de causar um padrão de lesão muito consistente entre animais de diferentes tamanhos e atingir uma taxa de sobrevivência superior a 95%. Além disso, ferramentas cirúrgicas adequadas são essenciais. Os instrumentos cirúrgicos devem ser bem conservado para garantir que todas as dicas de instrumentos aproximar corretamente. Significado desta técnica no que diz respeito aos métodos existentes ou alternativos Enquanto a hipóxia-isquémia, ou o arroz-Vannucci modelo dois </sup&gt;, é mais comummente utilizado para estudar lesão hipóxico-isquémica no cérebro em desenvolvimento, é importante notar que este modelo de tMCAO é distinto de HI em que não é a isquemia focal transiente sem hipoxia global, seguido de uma fase de reperfusão, quando o obstrução seja removida e o fluxo sanguíneo é restaurado. Isto provoca uma lesão mais consistente e reprodutível e é mais clinicamente translação, fazendo com que um padrão de lesão similar à observada em acidente vascular cerebral neonatal a termo. Isto permite o estudo de padrões de danos focais e respostas compensadoras em tecido não lesado. As aplicações futuras Depois de dominar esta técnica Este modelo é semelhante ao a causa mais comum de acidente vascular cerebral em recém-nascidos humanos, um trombo oclusiva transitória que ocorre durante o período perinatal 11, 21. A etiologia não é totalmente clara e é mais provável multifatorial, mas presume-se, na maioria dos casos tO resultado de êmbolos que passam a partir da placenta 11. Além disso, muitos recém-nascidos com AVC perinatal presume frequentemente presentes com actividade convulsiva ou posterior exame neurológico focal subtil anormalidades 22. Isso faz com que o uso de um modelo de lesão consistente, translacional para identificar mecanismos de progressão de lesões e possíveis estratégias terapêuticas cruciais.

Acidente vascular cerebral durante o período neonatal é uma importante causa de morte e incapacidade, ocorrendo em até 1 em 2.300 nascidos vivos 1. Isto leva ao desenvolvimento do sistema nervoso central alterada e o aumento da morbidade a longo prazo, incluindo o aumento da incidência da epilepsia, da paralisia cerebral, retardo mental cerebral, e outros tipos de motor ou disfunção cognitiva. Os efeitos ao longo da vida de acidente vascular cerebral precoce fazer modelos animais translacionais essencial para examinar os mecanismos de lesão e reparação nesta população, incluindo estratégias para proteger o cérebro ferido ou para melhorar a reparação. Diferentes modelos de isquemia têm sido utilizados para estudar a lesão cerebral em animais adultos, e enquanto o arroz-Vannucci (modificação Levine) 2 procedimento é comummente utilizado para estudar lesão hipóxico-isquémica no cérebro em desenvolvimento, focal isquemia-reperfusão é um mecanismo distinto da lesão causando lesão focal, com um núcleo de feridos e Penumbra e tecido remoto ileso. Os Koizumi 3 e 4 Longa modelos foram desenvolvidos em ratos adultos para atingir a oclusão da artéria cerebral média transiente através da artéria carótida comum (ACC) e a artéria carótida externa (ECA), respectivamente. Em ambos os modelos, a ligação permanente e cauterização dos ramos da artéria são importantes para minimizar o sangramento e para agilizar o procedimento cirúrgico, o que também provoca efeitos adversos sobre a capacidade do animal para se alimentar e ganho de peso após a lesão. Por outro lado, existem mecanismos de lesão distintos no cérebro imaturo e padrões específicos de lesão vistos como um resultado. Mais recentemente, acidente vascular cerebral photothrombotic (método de Rose Bengal-) 5 e permanente ligadura MCA 6 têm sido usados para estudar acidente vascular cerebral neonatal e adulto. Ambos acidente vascular cerebral photothrombotic e MCA ligadura criar alterações permanentes no fluxo sanguíneo cerebral que resultam numa falta de reperfusíon. A reperfusão é um componente crítico no desenvolvimento e progressão da lesão focal, com o aumento da excitotoxicidade, formação de radicais livres, e produção de óxido nítrico, levando à morte celular retardada que envolve a cascata de sinalização que são distintas a partir da fase isquémica 7. Hipóxia-isquemia envolve permanente ligação da carótida unilateral seguido por hipoxia global, que também difere da causa de lesão hipóxico-isquêmica em seres humanos e não causa um padrão de lesão focal consistente, fazer estudo do núcleo ferido e penumbra mais desafiador. Foi anteriormente descrito um modelo de acidente vascular cerebral isquemia-reperfusão não-hemorrágica no rato imaturo usando a oclusão da artéria cerebral média transiente (MCAO) 8, 9, 10. Este é um método menos invasivo que acede e provoca a oclusão da ACM através da artéria carótida interna sem ligati permanenteon ou cauterização. Isto fornece um modelo de lesão semelhante à causa mais comum de acidente vascular cerebral no período perinatal 11, 12. Este modelo de isquemia-reperfusão dos resultados de lesão em danos para o corpo estriado ipsilateral e córtex parietal e temporal. Este modelo de tMCAO também permite o controle sobre a gravidade da lesão através da variação da duração da oclusão. O exame das vias de sinalização e alterações histológicas no núcleo lesionado e penumbra e no tecido não lesionado contralateral e ipsilateral pode adicionalmente elucidar os mecanismos de lesão e reparação no cérebro imaturo. Este estudo irá demonstrar este modelo lesão importante para o desenvolvimento cerebral.

<table><tbody><tr><td>Isoflourane</td><td>Henry Schein</td><td>50033</td><td>anesthetic, at 3%&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Trinocular Surgioscope</td><td>World Precision Instruments</td><td>PSMT5N</td><td></td></tr><tr><td>Heating pad</td><td>Sunbeam</td><td>000731-500-000</td><td>low to medium setting</td></tr><tr><td>IR Thermometer</td><td>Extech Instruments</td><td>72-5270</td><td></td></tr><tr><td>Retraction kit for small animals&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>18200-20</td><td></td></tr><tr><td>CermaCut Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14958-09</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5SF Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>112522-00</td><td>2x</td></tr><tr><td>Dumont #5/45 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td>2x</td></tr><tr><td>B-2 Micro Clamp</td><td>Fine Science Tools</td><td>00398-02</td><td></td></tr><tr><td>Forcepts for Clamp Application</td><td>Fine Science Tools</td><td>00072-14</td><td></td></tr><tr><td>Micro Vannas Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-03</td><td>2mm cutting edge</td></tr><tr><td>Occlusion Sutures</td><td>Doccol</td><td>602123PK10</td><td>701712PK5Re</td></tr><tr><td>Ruler</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hemostatic Agent&amp;nbsp;</td><td>Avitene</td><td>DVL1010590</td><td></td></tr><tr><td>6-0 Perma-Hand Silk Reverse CuttingSuture</td><td>Ethicon</td><td>769G</td><td></td></tr><tr><td>Euthasol</td><td>Virbac</td><td>710101</td><td>0.22 mL/kg</td></tr><tr><td>Cotton Tipped Applicators</td><td>Henry Schein</td><td>100-9249</td><td></td></tr><tr><td>Laboratory Tape</td><td>VWR</td><td>89097-990</td><td></td></tr></tbody></table>

transient middle cerebral artery occlusion model of neonatal stroke in p10 rats

A number of animal models have been used to study hypoxic-ischemic injury, traumatic injury, global hypoxia, or permanent ischemia in both the immature and mature brain. Stroke occurs commonly in the perinatal period in humans, and transient ischemia-reperfusion is the most common form of stroke in neonates. The reperfusion phase is a critical component of injury progression, which occurs over a period of days to weeks, and of the endogenous response to injury. This postnatal day 10 (p10) rat model of transient middle cerebral artery occlusion (tMCAO) creates a unilateral, non-hemorrhagic focal ischemia-reperfusion injury that can be utilized to study the mechanisms of focal injury and repair in the full-term-equivalent brain. The injury pattern that is produced by tMCAO is consistent and highly reproducible and can be confirmed with MRI or histological analyses. The severity of injury can be manipulated through changes in occlusion time and other methods that will be discussed.

A gravidade da lesão causada por tMCAO é altamente dependente tanto o tempo de oclusão e da experiência do cirurgião. A 90-minutos de oclusão, muitas vezes produz um padrão de lesão ligeira a moderada, enquanto 3 h produz uma lesão moderada a grave. A gravidade da lesão pode ser avaliada através de uma variedade de métodos, incluindo ressonância magnética, histologia, ou análises de comportamento de curto ou de longo prazo. Figura 2 demonstra um exemplo de DW-RM realizada 75 min para uma oclusão de 90 minutos, confirmando a lesão isquémica envolvendo o hemisfério ipsilateral. Difusão de imagem ponderada demonstra um aumento da difusão no estriado ipsilateral e a maior parte do córtex ipsilateral, sem alterações contralateral, durante a fase aguda isquémica. Isso se correlaciona com um nível moderado de danos a longo prazo que envolve tanto o córtex ea substância cinzenta profunda. Oclusão dos resultados da ACM emmorte celular que começa no striatum de lesão menos grave e desenvolve agravamento lesões corticais e do hipocampo para tempos de oclusão mais longos e lesão mais grave. Durante a optimização da técnica cirúrgica, tal como a determinação do comprimento de inserção da sutura, RM é altamente recomendada, uma vez que permite a confirmação da colocação do fio de sutura adequado e visualização de edema e progressão da lesão durante a oclusão 14, 15, 16. Se IRM não está disponível, H &amp; E ou coloração com violeta de cresilo são métodos histológicos simples e fiáveis ​​para determinar a morfologia lesão e pode ser usado em ambos os pontos de tempo precoces e tardios após a tMCAO. Figura 3 demonstra um padrão de lesão moderada a grave no exame histopatológico após uma oclusão 3 h, demonstrando a formação de cistos e o volume do corpo estriado ipsilateral e córtex. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="1"&gt; Quantificação estereologia imparcial de secções de cresilo-violeta-coradas para calcular a relação de ipsilateral ao volume hemisférico contralateral confirma a lesão isquémica e reperfusão ipsilateral. Especificamente, após anestesiar os animais com Euthasol, o cérebro foi colhido por perfusão transcardíaca em 0,1 M de PBS com 4% paraformaldeído. Seguindo postfixation durante a noite e de equilíbrio em 30% de sacarose, todo o cérebro foram seccionados a 50 um intervalos, e cada secção XII foi seleccionado, montadas e coradas com violeta de cresilo 10. Mesmo com lesão leve, alterações do aparelho locomotor, tal como circulando e hemiparesia, são observadas durante o período de oclusão. Com lesão mais grave, estas mudanças irão persistir após a reperfusão. teste comportamental adicional pode ser usado para avaliar a gravidade da lesão, incluindo rotarod ou cilindro testes de criao para função sensório-motora e o labirinto de água de Morris parafunção cognitiva 13. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54830/54830fig1.jpg" /> Figura 1: Imagens cirúrgicas ao vivo do Procedimento tMCAO. (A) A primeira cadeia de sutura está enrolado em torno do ACI, como detalhado no passo 1.6. (B) A primeira ligadura temporária está ligado e o ICA é retraído. O segundo fio de sutura está enrolado em torno do ACI, lateral para o primeiro fio de sutura, tal como descrito na etapa 1.9. (C) O silicone revestido sutura oclusão é alimentado para o local da arteriotomia, como detalhado no passo 1.12. (D) A segunda ligadura temporária está ligado para assegurar a oclusão no lugar, tal como detalhado no passo 1.14. Escala da barra = 1 mm. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54830/54830fig2.jpg" /> Figura 2: RM Durante OCCLusion Demonstra o apropriado lesão unilateral. Anterior para posterior, as fatias de imagem coronais do DW-MRI, realizados durante um 90 minutos de oclusão, demonstram o aumento de difusão envolvendo o hemisfério ipsilateral (setas), o que é consistente com a lesão isquémica em curso na fase aguda. Reproduzido com permissão do curso 11. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54830/54830fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54830/54830fig3.jpg" /> Figura 3: unilateral lesão envolvendo o estriado e córtex em 4 semanas seguintes tMCAO. Posterior para anterior, cresilo-coradas com violeta secções cerebrais coronais (cada 50 um) colhidos a partir de P38 animais demonstram lesão bastante grave (as setas mostram a formação de cistos ipsilateral e reduzida e corticalo volume do corpo estriado) na sequência de um 3 h tMCAO em P10. O orifício redondo no lado esquerdo representa um identificador hemisfério contralateral. Barra de escala = 5 mm. Reproduzido com permissão do Neurobiology of Disease 12. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54830/54830fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Transient Middle Cerebral Artery Occlusion Model of Neonatal Stroke in P10 Rats

Neonatal stroke is a significant cause of early brain injury requiring a translational model with consistent focal injury patterns and high reproducibility in order to enable study. This study describes the detailed surgical procedure for creating a non-hemorrhagic, unilateral focal ischemia-reperfusion injury in full-term-equivalent rodents.

Transiente Artéria Cerebral Média Oclusão Modelo de AVC neonatal em ratos P10

A number of animal models have been used to study hypoxic-ischemic injury, traumatic injury, global hypoxia, or permanent ischemia in both the immature ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

10.5K visualizações.  University of California, San Francisco. Neonatal stroke is a significant cause of early brain injury requiring a translational model with consistent focal injury patterns and high reproducibility in order to enable study. This study describes the detailed surgical procedure for creating a non-hemorrhagic, unilateral focal ischemia-reperfusion injury in full-term-equivalent rodents.

Vídeo: Transient Middle Cerebral Artery Occlusion Model of Neonatal Stroke in P10 Rats

Focal Cerebral Ischemia Model by Endovascular Suture Occlusion of the Middle Cerebral Artery in the Rat

Stroke is the leading cause of disability and the third leading cause of death in adults worldwide1. In human stroke, there exists a highly variable clinical state; in the development of animal models of focal ischemia, however, achieving reproducibility of experimentally induced infarct volume is essential. The rat is a widely used animal model for stroke due to its relatively low animal husbandry costs and to the similarity of its cranial circulation to that of humans2,3. In humans, the middle cerebral artery (MCA) is most commonly affected in stroke syndromes and multiple methods of MCA occlusion (MCAO) have been described to mimic this clinical syndrome in animal models. Because recanalization commonly occurs following an acute stroke in the human, reperfusion after a period of occlusion has been included in many of these models. In this video, we demonstrate the transient endovascular suture MCAO model in the spontaneously hypertensive rat (SHR). A filament with a silicon tip coating is placed intraluminally at the MCA origin for 60 minutes, followed by reperfusion. Note that the optimal occlusion period may vary in other rat strains, such as Wistar or Sprague-Dawley. Several behavioral indicators of stroke in the rat are shown. Focal ischemia is confirmed using T2-weighted magnetic resonance images and by staining brain sections with 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) 24 hours after MCAO.

Surgical induction of ischemic brain damage in the rat is a widely used model for stroke research. Here we demonstrate the induction of focal cerebral ischemia by occlusion of the middle cerebral artery. Visualization of the resulting infarct by histological staining and magnetic resonance imaging is also shown.

Modelo de isquemia focal cerebral por oclusão Suture Endovascular da artéria cerebral média no Rat

Stroke is the leading cause of disability and the third leading cause of death in adults worldwide1. In human stroke, there exists a highly variable ...

Neurociência

Mouse Model of Middle Cerebral Artery Occlusion

Stroke is the most common fatal neurological disease in the United States 1. The majority of strokes (88%) result from blockage of blood vessels in the brain (ischemic stroke) 2. Since most ischemic strokes (~80%) occur in the territory of middle cerebral artery (MCA) 3, many animal stroke models that have been developed have focused on this artery. The intraluminal monofilament model of middle cerebral artery occlusion (MCAO) involves the insertion of a surgical filament into the external carotid artery and threading it forward into the internal carotid artery (ICA) until the tip occludes the origin of the MCA, resulting in a cessation of blood flow and subsequent brain infarction in the MCA territory 4. The technique can be used to model permanent or transient occlusion 5. If the suture is removed after a certain interval (30 min, 1 h, or 2 h), reperfusion is achieved (transient MCAO); if the filament is left in place (24 h) the procedure is suitable as a model of permanent MCAO. This technique does not require craniectomy, a neurosurgical procedure to remove a portion of skull, which may affect intracranial pressure and temperature 6. It has become the most frequently used method to mimic permanent and transient focal cerebral ischemia in rats and mice 7,8. To evaluate the extent of cerebral infarction, we stain brain slices with 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) to identify ischemic brain tissue 9. In this video, we demonstrate the MCAO method and the determination of infarct size by TTC staining.

We demonstrate in the video a method for producing a middle cerebral artery occlusion in adult mice using an intraluminal monofilament. We also show how to evaluate the extent of cerebral infarction by 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) staining.

Modelo do rato de Oclusão da Artéria Cerebral Média

Stroke is the most common fatal neurological disease in the United States 1. The majority of strokes (88%) result from blockage of blood vessels in the ...

Medicina

Modeling Stroke in Mice: Permanent Coagulation of the Distal Middle Cerebral Artery

Stroke is the third most common cause of death and a main cause of acquired adult disability in developed countries. Only very limited therapeutical options are available for a small proportion of stroke patients in the acute phase. Current research is intensively searching for novel therapeutic strategies and is increasingly focusing on the sub-acute and chronic phase after stroke because more patients might be eligible for therapeutic interventions in a prolonged time window. These delayed mechanisms include important pathophysiological pathways such as post-stroke inflammation, angiogenesis, neuronal plasticity and regeneration. In order to analyze these mechanisms and to subsequently evaluate novel drug targets, experimental stroke models with clinical relevance, low mortality and high reproducibility are sought after. Moreover, mice are the smallest mammals in which a focal stroke lesion can be induced and for which a broad spectrum of transgenic models are available. Therefore, we describe here the mouse model of transcranial, permanent coagulation of the middle cerebral artery via electrocoagulation distal of the lenticulostriatal arteries, the so-called &#8220;coagulation model&#8221;. The resulting infarct in this model is located mainly in the cortex; the relative infarct volume in relation to brain size corresponds to the majority of human strokes. Moreover, the model fulfills the above-mentioned criteria of reproducibility and low mortality. In this video we demonstrate the surgical methods of stroke induction in the &#8220;coagulation model&#8221; and report histological and functional analysis tools.

Various murine models of middle cerebral artery occlusion (MCAO) are widely used in experimental brain research. Here, we demonstrate the model of transcranial permanent distal MCAO which produces consistent cortical infarction of a size corresponding to damage imposed by the majority of human ischemic strokes.

Curso de modelagem em Ratos: Coagulação permanente da artéria distal Cerebral Média

Stroke is the third most common cause of death and a main cause of acquired adult disability in developed countries. Only very limited therapeutical ...

A Thrombotic Stroke Model Based On Transient Cerebral Hypoxia-ischemia

Stroke research has endured many setbacks in translating neuroprotective therapies into clinical practice. In contrast, the real-world therapy (tPA thrombolysis) rarely produces benefits in mechanical occlusion-based experimental models, which dominate preclinical stroke research. This split between the bench and bedside suggests the need to employ tPA-responsive models in preclinical stroke research. To this end, a simple and tPA-reactive thrombotic stroke model is invented and described here. This model consists of transient occlusion of the unilateral common carotid artery and delivery of 7.5% oxygen through a face mask in adult mice for 30 min, while maintaining the animal rectal temperature at 37.5 &#177; 0.5 &#176;C. Although reversible ligation of the unilateral carotid artery or hypoxia each suppressed cerebral blood flow only transiently, the combination of both insults caused lasting reperfusion deficits, fibrin and platelet deposition, and large infarct in the middle cerebral artery-supplied territory. Importantly, tail-vein injection of recombinant tPA at 0.5, 1, or 4 hr post-tHI (10 mg/kg) provided time-dependent reduction of the mortality rate and infarct size. This new stroke model is simple and can be standardized across laboratories to compare experimental results. Further, it induces thrombosis without craniectomy or introducing pre-formed emboli. Given these unique merits, the tHI model is a useful addition to the repertoire of preclinical stroke research.

Thromboembolic stroke models are vital tools for optimizing the recanalization therapy. Here we report a murine thrombotic stroke model based on transient cerebral hypoxic-ischemic (tHI) insult, which triggers thrombosis and infarction, and responds favorably to tissue plasminogen activator (tPA)-mediated fibrinolysis in a therapeutic window similar to those in stroke patients.

Um Modelo de acidente vascular cerebral trombótico Baseado em Transient isquemia-hipoxia cerebral

Stroke research has endured many setbacks in translating neuroprotective therapies into clinical practice. In contrast, the real-world therapy (tPA ...

Establishment of Acute Pontine Infarction in Rats by Electrical Stimulation

Pontine infarction is the most common stroke subtype in the posterior circulation, while there lacks a rodent model mimicking pontine infarction. Provided here is a protocol for successfully establishing a rat model of acute pontine infarction. Rats weighing about 250 g are used, and a probe with an insulated sheath is injected into the pons using a stereotaxic apparatus. A lesion is produced by the electrical stimulation with a single pulse. The Longa score, Berderson score, and beam balance test are used to assess neurological deficits. Additionally, the adhesive-removal somatosensory test is used to determine sensorimotor function, and the limb placement test is used to evaluate proprioception. MRI scans are then used to assess the infarction in vivo, and TTC staining is used to confirm the infarction in vitro. Here, a successful infarction is identified that is located in the anterolateral basis of the rostral pons. In conclusion, a new method is described to establish an acute pontine infarction rat model.

Presented here is a protocol for establishing acute pontine infarction in a rat model via electrical stimulation with a single pulse.

Estabelecimento de Infarto Agudo de Pontina em Ratos por Estimulação Elétrica

Pontine infarction is the most common stroke subtype in the posterior circulation, while there lacks a rodent model mimicking pontine infarction. Provided ...

Modeling Stroke in Mice: Transient Middle Cerebral Artery Occlusion via the External Carotid Artery

Stroke is the third most common cause of mortality and the leading cause of acquired adult disability in developed countries. To date, therapeutic options are limited to a small proportion of stroke patients within the first hours after stroke. Novel therapeutic strategies are being extensively investigated, especially to prolong the therapeutic time window. These current investigations include the study of important pathophysiological pathways after stroke, such as post-stroke inflammation, angiogenesis, neuronal plasticity, and regeneration. Over the last decade, there has been increasing concern about the poor reproducibility of experimental results and scientific findings among independent research groups. To overcome the so-called &#8220;replication crisis&#8221;, detailed standardized models for all procedures are urgently needed. As an effort within the &#8220;ImmunoStroke&#8221; research consortium (https://immunostroke.de/), a standardized mouse model of transient middle cerebral artery occlusion (MCAo) is proposed. This model allows the complete restoration of the blood flow upon removal of the filament, simulating the therapeutic or spontaneous clot lysis that occurs in a large proportion of human strokes. The surgical procedure of this &#8220;filament&#8221; stroke model and tools for its functional analysis are demonstrated in the accompanying video.

Different models of middle cerebral artery occlusion (MCAo) are used in experimental stroke research. Here, an experimental stroke model of transient MCAo via the external carotid artery (ECA) is described, which aims to mimic human stroke, in which the cerebrovascular thrombus is removed due to spontaneous clot lysis or therapy.

Modelagem de AVC em Camundongos: Oclusão da Artéria Cerebral Média Transitória através da Artéria Carótida Externa

Stroke is the third most common cause of mortality and the leading cause of acquired adult disability in developed countries. To date, therapeutic options ...

Estabelecendo um modelo de camundongos com oclusão transcraniana da artéria cerebral média

A Modified Transcranial Middle Cerebral Artery Occlusion Model to Study Stroke Outcomes in Aged Mice

In experimental stroke research, middle cerebral artery occlusion (MCAO) with an intraluminal filament is widely used to model ischemic stroke in mice. The filament MCAO model typically exhibits a massive cerebral infarction in C57Bl/6 mice that sometimes includes brain tissue in the territory supplied by the posterior cerebral artery, which is largely due to a high incidence of posterior communicating artery atresia. This phenomenon is considered a major contributor to the high mortality rate observed in C57Bl/6 mice during long-term stroke recovery after filament MCAO. Thus, many chronic stroke studies exploit distal MCAO models. However, these models usually produce infarction only in the cortex area, and consequently, the assessment of post-stroke neurologic deficits could be a challenge. This study has established a modified transcranial MCAO model in which the MCA at the trunk is partially occluded either permanently or transiently via a small cranial window. Since the occlusion location is relatively proximal to the origin of the MCA, this model generates brain damage in both the cortex and striatum. Extensive characterization of this model has demonstrated an excellent long-term survival rate, even in aged mice, as well as readily detectable neurologic deficits. Therefore, the MCAO mouse model described here represents a valuable tool for experimental stroke research.

Autor em destaque: técnicas inovadoras e direções futuras na pesquisa de AVC 

This protocol demonstrates a unique mouse stroke model with a medium-sized infarct and an excellent survival rate. This model allows preclinical stroke researchers to extend the ischemia duration, use aged mice, and assess long-term functional outcomes.

Modelo de Oclusão Transcraniana da Artéria Cerebral Média Modificada para Estudo de Resultados de Acidente Vascular Cerebral em Camundongos Idosos

In experimental stroke research, middle cerebral artery occlusion (MCAO) with an intraluminal filament is widely used to model ischemic stroke in mice. ...

Um modelo de isquemia cerebral transitória por oclusão da artéria cerebral média

Transient Middle Cerebral Artery Occlusion Model of Stroke

Stroke stands as a major cause of death or chronic disability globally. Nevertheless, existing optimal treatments are limited to reperfusion therapies during the acute phase of ischemic stroke. To gain insights into stroke physiopathology and develop innovative therapeutic approaches, in vivo rodent models of stroke play a fundamental role. The availability of genetically modified animals has particularly propelled the use of mice as experimental stroke models.
In stroke patients, occlusion of the middle cerebral artery (MCA) is a common occurrence. Consequently, the most prevalent experimental model involves intraluminal occlusion of the MCA, a minimally invasive technique that doesn't require craniectomy. This procedure involves inserting a monofilament through the external carotid artery (ECA) and advancing it through the internal carotid artery (ICA) until it reaches the branching point of the MCA. After a 45 min arterial occlusion, the monofilament is removed to allow reperfusion. Throughout the process, cerebral blood flow is monitored to confirm the reduction during occlusion and subsequent recovery upon reperfusion. Neurological and tissue outcomes are evaluated using behavioral tests and magnetic resonance imaging (MRI) studies.

Autor em destaque: Avaliando o dano isquêmico do AVC por meio do modelo de oclusão da artéria cerebral média 

This protocol describes the model of transient focal cerebral ischemia in mice through intraluminal occlusion of the middle cerebral artery. Additionally, examples of outcome assessment are shown using magnetic resonance imaging and behavioral tests.

Modelo de Oclusão Transitória da Artéria Cerebral Média do Acidente Vascular Encefálico

Stroke stands as a major cause of death or chronic disability globally. Nevertheless, existing optimal treatments are limited to reperfusion therapies ...

Transiente Artéria Cerebral Média Oclusão Modelo de AVC neonatal em ratos P10

Resumo

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Modelo de Oclusão Transcraniana da Artéria Cerebral Média Modificada para Estudo de Resultados de Acidente Vascular Cerebral em Camundongos Idosos

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