Name: modified microsecure vitrification: a safe, simple and highly effective cryopreservation procedure for human blastocysts
Uploaded: 2017-03-02T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Modified MicroSecure Vitrification: A Safe, Simple and Highly Effective Cryopreservation Procedure for Human Blastocysts at JoVE.com

MC Schiewe gostaria de agradecer ao Sr. Floresta Garner no Centro de Fertilidade de Las Vegas para sua perícia estatística na análise e avaliação dos dados anuais do CDC e SART. Além disso, os autores gostariam de agradecer o seu diretor médico, Dr. Robert E. Anderson, por seu apoio dedicado e fé nas nossas capacidades e conhecimentos técnicos.

<ol>
	<li>Edgar, D. H., Gook, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+appraisal+of+cryopreservation+(slow+cooling+versus+vitrification)+of+human+oocytes+and+embryos.">A critical appraisal of cryopreservation (slow cooling versus vitrification) of human oocytes and embryos.</a> Hum. Reprod. Update. 16, 536-554 (2012).</li><li>Schiewe, M. C., Whitney, J. B., Anderson, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+risk+of+monochorionic+dizygotic+twin+blastocyst+formation+associated+with+early+laser+zona+dissection+of+group+cultured+embryos.">Potential risk of monochorionic dizygotic twin blastocyst formation associated with early laser zona dissection of group cultured embryos.</a> Fertil. Steril. 103, 417-421 (2015).</li><li>Schiewe, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+historic+development+and+incorporation+of+four+assisted+reproductive+technologies+shaping+today's+IVF+industry.">The historic development and incorporation of four assisted reproductive technologies shaping today's IVF industry.</a> J. Fertil. In Vitro Reprod. Med. Genet. 4, 2-9 (2016).</li><li>Rall, W. F., Fahy, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ice-free+cryopreservation+of+mouse+embryos+at+-196+degrees+C+by+vitrification.">Ice-free cryopreservation of mouse embryos at -196 degrees C by vitrification.</a> Nature. 313, 573-575 (1985).</li><li>Rall, W. F., Wood, M. J., Kirby, C., Whittingham, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+mouse+embryos+cryopreserved+by+vitrification.">Development of mouse embryos cryopreserved by vitrification.</a> J. Reprod. Fertil. 80, 499-504 (1987).</li><li>Schiewe, M. C., Rall, W. F., Stuart, L. D., Wildt, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cryoprotectant,+cooling+rate+and+in+situ+straw+dilution+using+conventional+freezing+or+vitrification+for+cryopreserving+sheep+embryos.">Analysis of cryoprotectant, cooling rate and in situ straw dilution using conventional freezing or vitrification for cryopreserving sheep embryos.</a> Theriogenology. 36, 279-293 (1991).</li><li>Lane, M., Schoolcraft, W. B., Gardner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitrification+of+mouse+and+human+blastocysts+using+a+novel+cryoloop+container-less+technique.">Vitrification of mouse and human blastocysts using a novel cryoloop container-less technique.</a> Fertil. Steril. 72, 1073-1078 (1999).</li><li>Mukaida, T., Oka, C., Goto, T., Takahashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+shrinkage+of+blastocoeles+using+either+a+micro-needle+or+a+laser+pulse+prior+to+the+cooling+steps+of+vitrification+improves+survival+rate+and+pregnancy+outcome+of+vitrified+human+blastocysts.">Artificial shrinkage of blastocoeles using either a micro-needle or a laser pulse prior to the cooling steps of vitrification improves survival rate and pregnancy outcome of vitrified human blastocysts.</a> Hum. Reprod. 21, 3246-3252 (2006).</li><li>Kuwayama, M., Vatja, G., Ieda, S., Kato, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+open+and+closed+methods+for+vitrification+of+human+embryos+and+elimination+of+potential+contamination.">Comparison of open and closed methods for vitrification of human embryos and elimination of potential contamination.</a> Reprod. Biomed. Online. 11, 608-614 (2005).</li><li>Vanderzwalmen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Births+after+vitrification+at+morula+and+blastocyst+stages:+effect+of+artificial+reduction+of+the+blastocoelic+cavity+before+vitrification.">Births after vitrification at morula and blastocyst stages: effect of artificial reduction of the blastocoelic cavity before vitrification.</a> Hum. Reprod. 17, 744-751 (2002).</li><li>Schiewe, M. C., Marco-Jim&#233;nez, F., AkdemirKo&#231;, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quality+control+factors+influencing+the+successful+and+reliable+implementation+of+oocyte+and+embryo+vitrification.">Quality control factors influencing the successful and reliable implementation of oocyte and embryo vitrification.</a> Cryopreservation. , (2016).</li><li>Stachecki, J. J., Garrisi, J., Sabino, S., Caetano, J. P. J., Wiemer, K., Cohen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+safe,+simple,+and+successful+vitrification+method+for+bovine+and+human+blastocysts.">A new safe, simple, and successful vitrification method for bovine and human blastocysts.</a> Reprod. Biomed. Online. 17, 360-367 (2008).</li><li>Panagiotidis, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open+versus+closed+vitrification+of+blastocysts+from+an+oocyte-donation+programme:+a+prospective+randomized+study.">Open versus closed vitrification of blastocysts from an oocyte-donation programme: a prospective randomized study.</a> Reprod. Biomed. Online. 26, 470-476 (2013).</li><li>Papatheodorou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open+versus+closed+oocyte+vitrification+system:+a+prospective+randomized+study.">Open versus closed oocyte vitrification system: a prospective randomized study.</a> Reprod. Biomed. Online. 26, 595-602 (2013).</li><li>Schiewe, M. C., Zozula, S., Anderson, R. E., Fahy, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+microSecure+vitrification+(&#181;S-VTF)+for+the+effective+cryopreservation+of+human+embryos+and+oocytes.">Validation of microSecure vitrification (&#181;S-VTF) for the effective cryopreservation of human embryos and oocytes.</a> Cryobiology. 71, 264-272 (2015).</li><li>Schiewe, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroSecure+vitrification+for+oocytes+and+embryos:+optimum+simplicity,+security+and+cost+and+effectiveness+combining+FDA-approved+products.">MicroSecure vitrification for oocytes and embryos: optimum simplicity, security and cost and effectiveness combining FDA-approved products.</a> J. Clin. Embryol. 13, 33-51 (2010).</li><li>Rall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+affecting+the+survival+of+mouse+embryos+cryopreserved+by+vitrification.">Factors affecting the survival of mouse embryos cryopreserved by vitrification.</a> Cryobiology. 24, 387-402 (1987).</li><li>Seki, S., Mazur, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+warming+rate+on+the+survival+of+vitrified+mouse+oocytes+and+on+the+recrystallization+of+intracellular+ice.">Effect of warming rate on the survival of vitrified mouse oocytes and on the recrystallization of intracellular ice.</a> Biol. Reprod. 79, 727-737 (2008).</li><li>Schiewe, M. C., Stringfellow, D. A., Givens, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+hygiene+and+quality+control+practices+in+an+embryo-production+laboratory.">General hygiene and quality control practices in an embryo-production laboratory.</a> Manual of the International Embryo Transfer Society: A Procedural Guide and General Information for the Use of Embryo Transfer Technology, Emphasizing Sanitary Precautions. , (2008).</li><li>Whitney, J. B., Nugent, N. L., Anderson, R. E., Schiewe, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+center+validation+of+routine+blastocyst+biopsy+implementation.">Single center validation of routine blastocyst biopsy implementation.</a> J. Asst. Reprod. Genet. , (2016).</li><li>Liebermann, L., Conaghan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+collapse+prior+blastocyst+vitrification:+improvement+of+clinical+outcomes.">Artificial collapse prior blastocyst vitrification: improvement of clinical outcomes.</a> J. Clin. Embryol. 16, 107-118 (2014).</li><li>Parmegiani, L., Tatone, C., Cognigni, G. E., Bernardi, S., Troilo, E., Arnone, A., Maccarini, A. M., Di Emidio, G., Vitti, M., Filicori, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+warming+increases+survival+of+slow-frozen+sibling+oocytes:+a+step+towards+a+single+warming+procedure+irrespective+of+the+freezing+protocol.">Rapid warming increases survival of slow-frozen sibling oocytes: a step towards a single warming procedure irrespective of the freezing protocol.</a> Reprod Biomed Online. , (2014).</li></ol>

MC Schiewe atua como membro do conselho científico para inovadoras Cryo Empresas e como Director Técnico da California Cryobank. A produção deste vídeo-artigo tenha sido pago por Ovation fertilidade. Os autores não têm acordos ou conflitos de interesses financeiros concorrentes a revelar sobre a vitrificação de gametas e embriões.

Hoje em dia, existe uma elevada expectativa de alcançar a sobrevivência blastocisto completa (&gt; 95%) e alcançar o sucesso semelhante ao implante de embriões frescos. Alguns grupos têm sugerido que as taxas de nascidos vivos de ciclos de transferência de embriões vitrificadas são talvez ainda mais elevados do que os blastocistos fresco quando o embrião criopreservado intacta é transplantado para um útero saudável, não-estimulada hormonalmente. Os nossos dados indicam claramente que a vitrificação eficaz e fiável mantém a viabilidade do embrião fresco. Além disso, provámos que a nossa asséptica, método fechado, chamado MicroSecure de vitrificação (uS-VTF), pode conseguir uma optimização dos resultados comparáveis ou superiores aos padrões comerciais (isto é, sistemas de dispositivo abertos) utilizados na indústria de FIV. Variação está associada com repetibilidade técnica e confiabilidade entre os indivíduos usando uma infinidade de vitrificação dispositivos / métodos. Por sua vez, isso resultou em inconsistencies entre os programas de aplicação de vitrificação. Portanto, não é surpreendente que dispositivo de familiaridade é um fator importante a respeito de proficiência laboratorial e resultados bem sucedidos. É este conceito de &quot;assinatura técnica&quot; 11 que explica por que a repetibilidade entre programas pode ser problemático. Não só o desenvolvimento de mais do que uma dúzia de dispositivos comerciais complicado este fenómeno, que criou preocupações de controle de qualidade. Felizmente, fechou sistemas de vitrificação, como uS-VTF, Rapid-I, e VitriSafe, estão agora a revelar-se igualmente eficaz para abrir sistemas de dispositivo de 12, 13, 14. MicroSecure VTF é um romance, técnica de vitrificação asséptica desenvolvida com facilidade técnica, confiabilidade e crio-segurança em mente. Ao combinar a utilização de dois dispositivos previamente aprovados pela FDA,-compatíveis, que é um sistema de vitrificação não comercial Wom a vantagem de ter um baixo custo estabelecido, em contraste com dispositivos especializados. Além disso, sua inviolável única e sistema de rotulagem de duas cores internalizado, bem como inúmeras outras vantagens de controle de qualidade, fizeram uS-VTF uma opção global atraente 11. Como um dispositivo de VTF não-comercial, no entanto, a sua aplicação generalizada indústria está evoluindo lentamente. Só através da publicação contínua da sua segurança, segurança e eficácia clínica vai ganhar uS-VTF utilização crescente. Em agosto de 2014, quando confrontados com a incapacidade de adquirir o original palha embrião de 0,3 mL fabricado com um non-wicking plugue interior, hidrofóbico, fomos capazes de modificar de forma confiável o método uS-VTF. Em suma, os novos sêmen de 0,3 mL / palhas embrião com seus tampões de algodão-PVP foram efetivamente adaptada. Isto foi simplesmente alcançado através da criação de um selo interno antes do tampão de algodão, evitando assim o contacto e fluido de drenagem com oponta VTF aberto (ou seja, o flexipette contendo o embrião ou ovos). Além disso, se 40-mm hastes de identificação não são acessíveis, o problema associado com a flutuabilidade das hastes mais leves de 30 mm pode ser counterweighted usando dois rolamentos de esferas. Estes passos adicionais fizeram a técnica um pouco menos simples, mas ainda altamente eficaz. Hoje, economia e eficácia estão se tornando cada vez mais preocupações importantes, como blastocistos biopsiados são tipicamente vitrificados individualmente até o seu estado euploidy é confirmado em um relatório genética. Blastocistos com um estatuto de aneuploidia não viáveis ​​confirmou normalmente descartadas, com o consentimento do paciente, dentro de algumas semanas. Assim, a maioria (&gt; 50%) dos dispositivos de VTF são descartados após um armazenamento de curto termo, causando um custo anual crescente na utilização de dispositivos comerciais. No geral, uS-VTF é um procedimento altamente eficaz, confiável e repetível para a criopreservação de blastocistos humanos. O securel projeto de controle de qualidade superioretiquetas y e segura armazena embriões / ovócitos ao eliminar a falha de recuperação e otimizar a sobrevivência pós-aquecimento e viabilidade, o que justifica o uso do sistema como uma abordagem universal para a vitrificação de embriões.

A vitrificação é a tecnologia assistida maior impacto único reprodutiva na indústria de fertilização in vitro (FIV) desde o desenvolvimento da injeção intracitoplasmática de espermatozóides. Hoje, os blastocistos são criopreservadas sem a perda na viabilidade do embrião anteriormente associado com métodos slow-congelação convencionais 1. Com sobrevivência embrionária pós-aquecimento confiável, a indústria da infertilidade está se transformando em o uso preferencial de ciclos de transferência de embriões criopreservados, que produzem os resultados da gravidez semelhantes ou mais elevados do que a transferência de embrião tradicional fresco. Em associação com a biópsia do blastocisto e rastreio genético pré-implantação (PGS), vitrificação tornou-se uma ferramenta clínica vital para otimizar os resultados de nascidos vivos saudáveis através euploid única transferência do embrião 2, 3. Vitrificação embrião murino foi desenvolvido em meados dos anos 1980 4, </sup&gt; 5 e adaptado para agricultura animal até 1990 6. Com base na premissa de que as soluções de vitrificação formar um estado metaestável glasseous, livre de danificar a formação de cristais de gelo, que tem provado mais eficientemente preservar a integridade celular completa de embriões. Curiosamente, a aceitação promissora de vitrificação em embriologia humana não começou a ser realizado até o século 21. Publicações antigas que promovem o uso de vitrificação coincidiu com o desenvolvimento de originais &quot;abertos&quot; os dispositivos do sistema 7, 8, 9. No entanto, a adoção de vitrificação para a prática clínica foi lento, como veio num momento em que melhorias no congelamento lento blastocisto foram ocorrendo também. Bem sucedido convencional de congelamento de taxa lenta, em adição à vitrificação, foram alinhadas com melhoramentos em sistemas de cultura de embriões, assim como com a incorion de abordagens blastocele-colapso, o que aumentou tanto a sobrevida global dos trofectoderma e, posteriormente, o implante 10. Na última década, a tecnologia de vitrificação suplantou rapidamente práticas de congelamento convencionais. Em grande medida, isso deveu-se ao desenvolvimento de dispositivos de vitrificação especializados. Alguns destes dispositivos têm prejudicado a segurança global, eficiência e eficácia da vitrificação clínica através da introdução de falhas de projeto inerentes aos dispositivos utilizados na indústria de fertilização in vitro 11. Na verdade, as nuances de diferentes dispositivos introduzir variação técnico significativo entre os programas, comumente referido como &quot;assinaturas técnicas&quot; 12. Assim, revistas científicas, como o Journal of Experiments visualizados (JoVE), pode servir como um recurso valioso para demonstrar detalhes técnicos, o que ajudará a reduzir a variação resultado. Outro problema permanente é que éome embriologistas continuam a ser mal informado, ainda hoje, com base em alegações de que o &quot;arrefecimento ultra-rápida de embriões ou ovócitos em um&quot; sistema de vitrificação aberto &quot;(ou seja, o contato embrião direto com azoto líquido (LN 2)) é um pré-requisito para otimizar taxas de sucesso. &quot; Claramente, esta crença é impreciso, com base no sucesso comprovado de asséptica sistemas 13, 14, 15 fechado. Com base nos princípios cryobiological de vitrificação, a eficácia da vitrificação é mais altamente dependente taxas de aquecimento do que sobre as taxas de 16, 17, 18 de arrefecimento. De um modo geral, independente do dispositivo de vitrificação utilizado, a taxa de aquecimento deve exceder a taxa de arrefecimento para assegurar altas taxas de sobrevivência. Taxas de aquecimento elevadas minimizar a oportunidade para qualquer crescimento do gelo (ou seja, o recrystallization de impurezas nucleadas em crio soluções) durante a fase de devitrification do aquecimento. Concedida, a estabilidade da solução de vitrificação (ou seja, o tipo e concentração de agentes crioprotectores utilizados) podem ter um efeito de confusão, mas esta é tratada em uma publicação separada 11. Considerando as questões de taxa de refrigeração-aquecimento, MicroSecure de vitrificação (uS-VTF) foi desenvolvido em 2008 como um método barato, não-comercial, FDA-compliant que otimizou os aspectos da vitrificação de controle de qualidade. Era o único que ofereceu à prova de violação, internalizado, a rotulagem de duas cores. Além disso, através do carregamento e o armazenamento dos embriões directamente no flexipette estéril usada para pipetagem (isto é, sem pipetagem para uma superfície de dispositivo secundário) e usando palhetas ionomérico-resina que vedam completamente solda utilizando um aferidor automatizado, variação técnica tem sido eficazmente eliminada. Ao avaliar a completeness de dispositivos de vitrificação para uso potencial, existem vários fatores de controle de qualidade que devem ser levadas em consideração, incluindo: 1) A rotulagem potenciais etiquetas -Pode ser firmemente aderido? elas são à prova de falsificação? Será que eles oferecem duas cores potencial de identificação? Ele exige um rótulo secundário, e pode o rótulo ser facilmente removido para fins de manutenção de registros (ou seja, o paciente verificação) pós-aquecimento? 2) facilidade técnica embriões -Pode ser facilmente carregado no / para o dispositivo de uma forma atempada e simplesmente identificadas e rastreadas pós-aquecimento? 3) Processo simplicidade / repetibilidade -Será que o método de vitrificação oferta simplicidade e confiabilidade que facilmente permite a repetibilidade, o que minimiza a variação entre técnicos (internos) e programas (externos)? 4) LN 2 capacidade de armazenamento -Pode os dispositivos ser facilmente e com segurança tratadas e identificadas? É sua storaiva espaço potencial eficiente? Será que o dispositivo de oferta de segurança e protecção contra danos físicos ou possíveis contaminantes como um sistema fechado asséptica? 5) Potencial de Recuperação / sobrevivência -É o projeto do dispositivo propenso a potenciais problemas na recuperação garantida de embriões, e que de forma confiável vitrificar e manter completa integridade celular pós-aquecimento? A última preocupação determinada qualidade, a taxa de recuperação, foi efectivamente surpreendentemente minimizado em relatórios publicados; isso é feito geralmente escondendo o desfecho desfavorável (ou seja, embrião perdido ou ovo) em tipicamente boas taxas de sobrevivência. Qualquer dispositivo propenso a recuperação inconsistente (&lt;99%) está seriamente errado e constitui um passivo processual. Nossa asséptica, fechou método uS-VTF foi estrategicamente desenvolvido para explicar cada medida de controle de qualidade. No entanto, após 5 anos de sucesso clínico superior e validação 14, o procedimento teve to ser modificado. As palhetas de embrião de 0,3 mL originais (que possuem um tampão hidrofóbico) foram removidos da indústria de FIV e substituído com um canudo de sémen 0,3 mL possuindo um tampão de algodão / PVP padrão (isto é, sémen renomeado como uma palha / embrião). Este artigo descreve as etapas processuais e estratégias específicas necessárias para implementar uS-VTF de forma segura, simples e eficaz. Além disso, destaca-se a modificação (s) necessária para dar conta de forma confiável por limitações de fornecimento, até o momento em um recipiente de palha alternativa ideal é reintroduzido de volta para o laboratório clínico.

<table><tbody><tr><td>Aluminum Cane</td><td>IVM</td><td>XC055</td><td></td></tr><tr><td>Ball bearings, 3/32&quot;</td><td>VXB.com</td><td>KIT15977</td><td>stainless steel</td></tr><tr><td>CBS semen/embryo straw, 0.3 mL</td><td>CryoBioSystems</td><td>25292</td><td>individual sterile</td></tr><tr><td>Color, ID rods, 30 mm</td><td>CryoBioSystems</td><td>019021-26</td><td>weighted</td></tr><tr><td>Culture tubes, 15 mL</td><td>Falcon</td><td>352099</td><td>Conical</td></tr><tr><td>Culture tubes, 10 mL</td><td>Falcon</td><td>352057</td><td>Snap-cap</td></tr><tr><td>Cryosleeves</td><td>Nalgene</td><td>5016-001</td><td></td></tr><tr><td>Filter, 250 mL</td><td>Fisher Sci.</td><td>09-740-2A</td><td>0.22 &amp;mu;m</td></tr><tr><td>Flasks, Tissue Culture 50 mL</td><td>Falcon</td><td>353014</td><td></td></tr><tr><td>Flexipettes, 300 &amp;mu;m ID</td><td>Cook Med.</td><td>K-FPIP-1300-10BS-5</td><td>Sterile, 20/pack</td></tr><tr><td>Forcep, Large</td><td>Miltex</td><td>6-30TC</td><td></td></tr><tr><td>Forcep, Splinter - fine</td><td>Miltex</td><td>17-305</td><td></td></tr><tr><td>Goblet</td><td>IVM</td><td>PA003</td><td></td></tr><tr><td>Heat Sealer, SYMS 1</td><td>CryoBioSystems</td><td>16399</td><td>110 V or 220 V with adapter</td></tr><tr><td>Hepes-buffered media&amp;nbsp;</td><td>Life Global or</td><td>LGGH-100; 100&amp;nbsp;mL, or</td><td>stored at 2 - 8 &amp;ordm;C</td></tr><tr><td></td><td>Irvine Scientific</td><td>H-HTF; 90126; 100 mL</td><td>with non-essential AA&#039;s</td></tr><tr><td>Labels, Cryo</td><td>GA International</td><td>CL-23T1</td><td>Various colors</td></tr><tr><td>Liquid Nitrogen Tank, 40&amp;nbsp;L</td><td>MVE or Taylor Warton</td><td>various</td><td>liquid storage&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>LN&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;; Dewar flask, 0.5&amp;nbsp;L</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-695</td><td>Stainless steel</td></tr><tr><td>6-well Custer Dishes</td><td>Biogenics</td><td>015/020</td><td>plasticware by case</td></tr><tr><td>Pipette Bulb, Micro Cap</td><td>Drummond</td><td>Fisher#13681451</td><td>Hole on bulb apex</td></tr><tr><td>Petri Dishes, 35 mm</td><td>Falcon</td><td>351006</td><td></td></tr><tr><td>Petri Dishes, 58 mm</td><td>Nunc</td><td>150288</td><td></td></tr><tr><td>Petri Dishes, 100 mm</td><td>Falcon</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Tips, ART long</td><td>Fisher Sci.</td><td>02-707-80</td><td>10 - 100 &amp;mu;L</td></tr><tr><td>Pipet Aid</td><td>Drummond or Falcon</td><td>various</td><td>rechargeable</td></tr><tr><td>Pipetting Device, Stripper</td><td>Cooper Surgical</td><td>MXL3-STR</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes, Serological 1&amp;nbsp;mL</td><td>Falcon</td><td>357521</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes, Serological 2&amp;nbsp;mL</td><td>Falcon</td><td>357507</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes, Serological 5&amp;nbsp;mL</td><td>Falcon</td><td>357543</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes, Serological 10&amp;nbsp;mL</td><td>Falcon</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>Scissors, Surgical Mayo</td><td>Miltex</td><td>5-SC-16</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Nikon, Olympus, Leica</td><td>various</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Gauze pads, 4&quot; x 4&quot;</td><td>Kendall Healthcare</td><td>6939</td><td></td></tr><tr><td>Synthetic serum</td><td>Life Global, or</td><td>LGPS-20; 20 mL, or</td><td>stored at 2 - 8 &amp;ordm;C</td></tr><tr><td></td><td>Irvine Scientific</td><td>SS-99193; 12 x 10 mL</td><td>purchase low endotoxin lot</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma Chemical Co.</td><td>#S9378</td><td>Aliquot into 50&amp;nbsp;mL flasks, 1 year;&lt;br/&gt;
17.1 g/flask + Medium to 50 mL;&lt;br/&gt;
makes a 1 M solution;&lt;br/&gt;
Filter with 0.22 &amp;micro;m unit</td></tr><tr><td>Timer</td><td>Nalgene</td><td>5016-001</td><td></td></tr><tr><td>Thawing Solution</td><td>Innovative Cryo Enterprises</td><td>BL-TS (&amp;le;1.0 M Sucrose)</td><td>T1, T2, T3, T4; tored at 2 - 8 &amp;ordm;C for &amp;le;1 month after opening</td></tr><tr><td>Vitrification Solution*,**</td><td>Innovative Cryo Enterprises</td><td>BL-VS (&amp;ge;7.9 M [Glycerol/EG])</td><td>V1, V2, V3; stored at 2 - 8 &amp;ordm;C for &amp;le;1 month after opening</td></tr><tr><td colspan="4">* Non-permeating cryoprotective additives may include: sucrose, ficoll and sodium hyaluronate&amp;nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">** Other commercial preparations are typically ethylene glycol (EG)/dimethyl sulfoxide (DMSO; 30% v/v; 4.8 M), but could be EG/propylene glycol (32% v/v; 5.2 M). Mixed solutions are typically used to reduce cryo-toxicity concerns of a high molar solution. Commercial solutions typically include an ES and VS solution. The formulation of commercial preparation is typically proprietary property.</td></tr></tbody></table>

modified microsecure vitrification: a safe, simple and highly effective cryopreservation procedure for human blastocysts

Clínica vitrificação embrião evoluiu com o desenvolvimento de dispositivos de vitrificação únicas no século 21 e com o equívoco de que o resfriamento ultra-rápida em um sistema &quot;aberto&quot; (ou seja, direta LN 2 contato) era uma necessidade para otimizar o sucesso vitrificação. O dogma em torno da importância de taxas de resfriamento levou a práticas inseguras sujeitas à variação técnica e à criação de dispositivos de vitrificação, que desrespeitam importantes fatores de controle de qualidade (por exemplo, facilidade de uso, repetibilidade, a fiabilidade, segurança rotulagem, segurança e armazenamento). Compreender as falhas de outros dispositivos permitidos para o desenvolvimento de um método de uS-VTF segura, segura, repetível e confiável teve como objetivo minimizar a variação intra e inter-técnico de controle de qualidade. Igualmente importante, ele combinou a disponibilidade de dois dispositivos FDA compatíveis existentes: 1) a ionomï¿½ico palha resina embrião de 0,3 mL com internalizado, de duas cores, adulterar-protulagem telhado com potencial de solda da vedação repetível; e 2) encurtado, comumente utilizado, de 300 uM ID flexipettes estéreis para carregar directamente o embrião (s), a fim de criar um dispositivo de vitrificação global altamente eficaz. À semelhança de outros asséptica, fechou sistemas de vitrificação (por exemplo, alta Vitrificação de Segurança (HSV), Rapid-i, e VitriSafe) efetivamente usada na medicina reprodutiva, microSecure Vitrificação (uS-VTF) provou que ele pode atingir uma alta de sobrevivência pós-aquecimento e gravidez resultados com a sua atenção para a simplicidade, e reduziu a variação técnica. Embora a palha embrião 0,3 ml, contendo uma ficha interna hidrofóbica foi comercialmente substituído com uma palha sémen padrão possuindo pirrolidona algodão de polivinil (PVP) plugs, manteve a sua composição de resina ionomï¿½ico para garantir a vedação de solda. No entanto, os tampões de algodão pode pavio o conteúdo fluido-embrião do flexipettes em cima do contato. Um método uS-VTF modificado foi adaptado para incluir uma soldadura interna adicionalselar antes de o bujão no lado do dispositivo de carregamento. A etapa técnica adicionado ao procedimento de uS-VTF não afetou sua aplicação bem-sucedida, as taxas de sobrevivência tão elevadas (&gt; 95%) e as taxas de gravidez continuam até hoje.

1.341 blastocistos vitrificados foram aquecidos entre 2012 a junho de 2014, e 1.341 embriões recuperados (100%), enquanto 1.316 sobreviveram (98,1%). blastocistos biopsiados experimentado ao longo de sobrevivência de 99,5%. Ao transferir predominantemente única, geneticamente testados, euploid, embriões vitrificados, fomos capazes de alcançar algumas das mais altas taxas de implantação e taxas de nascidos vivos nos EUA, independentemente da idade (Figura 3) 20, de acordo com recentes estatísticas nacionais notificados pelo Centro de Controle de Doenças e da Sociedade para Tecnologias de reprodução assistida (Tabelas 1 e 2). Avaliando um paciente população bom prognóstico (menos de 35 anos) para os ciclos criopreservados sozinho (Tabela 1), nosso laboratório superou a média nacional para ambas as taxas de implantação (ou seja, a eficiência de um embrião para estabelecer uma gravidez) e, finalmente, viver taxas de natalidade<html> mais de 30%. Além disso, a validação / verificação inicial dos nossos palhas de armazenamento modificados em meados de 2014 usando 70, blastocistos aneuploides re-vitrificados investigação de consentida resultou na recuperação de 100% e 100% de sobrevivência. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54871/54871fig1.jpg" /> Figura 1. Configuração MicroSecure VTF. O prato VTF (A) é montado com 3 linhas distintas de soluções de vitrificação, que utilizam 3 gotas de lavagem antes da colocação em distintas, gotículas de retenção numerados. Além disso, as pipetas com pontas individuais VTF encurtadas (isto é, flexipettes 300 mícrons ID) são protegidas e organizados num suporte de tubos de isopor (B), que pode ser rodado para a utilização adequada. Note-se que um conjunto descartável representante pipetagem micropipeta lâmpada está descansando na prateleira de isopor.<html> arget = &quot;_ blank&quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54871/54871fig2.jpg" /> Figura 2. Modificado Blastocyst Grading System. Nosso sistema de blastocisto classificação Gardner modificado explica a hérnia induzida de células TE para facilitar a biópsia do blastocisto. A modificação considera a eclosão prematura de blastocistos completos (A: Grau 3 = menos de 10% hérnia) e blastocistos expandidos (B: Grau 4 = até 50% hérnia), enquanto um blastocisto incubação (C) tem mais de 50% hérnia 16. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54871/54871fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> 54871fig3.jpg &quot;/&gt; Figura 3. gravidez resultados comparativos. Ao longo de um intervalo cumulativa de 1,5 anos, os dados de gravidez foram comparados para avaliar os efeitos de transferência de blastocistos euplóides vitrificados-aquecido (n = 172 ciclos / 144 transferências) em comparação com os ciclos não-PGS (n = 160 ciclos / 153 transferências) que envolvem predominantemente fresco transfere 18. Para os nossos propósitos experimentais, estes dados revelam claramente que blastocistos biopsiados vitrificados pelo procedimento uS-VTF manter a sua viabilidade. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54871/54871fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Fonte de dados </td><td> # Cycles </td><td> A média de # de embriões transferidos </td><td> Implantação de taxas (%) </td><td> Taxas de nascidos vivos (%) </td></tr><tr><td> Lab NB * </td><td> 144 </td><td> 1.2 </td><td> 74.00% </td><td> 74.50% </td></tr><tr><td> Média nacional </td><td> 20423 </td><td> 1.7 </td><td> 39.60% </td><td> 44.10% </td></tr><tr><td colspan="5"> * Os dados foram calculados com base no desempenho dos 2014 Orange County Fertilidade, sul da Califórnia Centro de Fertilidade e do California Centro Southern para clínicas de medicina reprodutiva usando o laboratório de fertilidade Ovation atual (NB Lab), que fundou o procedimento microSecure vitrificação em 2008. </td></tr></tbody></table> Tabela 1. 2014 CDC Assistida Estatísticas Reprodutivos. dados gravidez transferência de embriões congelados de mulheres com menos de 35 anos de idade de três relatórios clínicas médicas usando o nosso Lab NB comparação com a média nacional dos EUA 2013, de mais de 450 clínicas de relatórios. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2"> Médias SART Nacionais </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Clinic - Estado </td><td> Mulheres </td><td> Mulheres </td><td> Mulheres </td><td> Mulheres </td></tr><tr><td></td><td> &lt;35 anos </td><td> 35-37 anos </td><td> 38-40 anos </td><td> 41-42 anos </td></tr><tr><td> SCCRM-CA * </td><td> 63,1% </td><td> 58,3% </td><td> 40,6% </td><td> 32,3% </td></tr><tr><td> CCRM-CO * </td><td> 64,7% </td><td> 61,5% </td><td> 40,4% </td><td> 32,2% </td></tr><tr><td> RMA-NJ * </td><td> 63,2% </td><td> 59,7% </td><td> 34,6% </td><td> 18,7% </td></tr><tr><td> Média nacional </td><td> 48,6% </td><td> 38,3% </td><td> 24,3% </td><td> 12,3% </td></tr><tr><td colspan="5"> SCCRM-sul da Califórnia Centro de Medicina Reprodutiva; Centro CCRM-Colorado por de Medicina Reprodutiva; e RMA-Reproductive Medicine Associates </td></tr><tr><td colspan="5"> * Estas clínicas principais foram todos predominantemente implementado ciclos de transferência de embriões vitrificados, em associação com o teste genético pré-implantação, em sua prática padrão de atendimento para otimizar o sucesso de nascidos vivos por embrião transplantado. </td></tr></tbody></table> Tabela 2. 2014 taxas de nascidos vivos cumulativos, como relatado pela Sociedade de Tecnologias de Reprodução Assistida (SART), para a Clínica SCCRM usando o nosso Ovation Fertilidade Lab em Newport Beach, CA, em contraste com vários outros programas respeitados, bem como com o SART médias nacionais.

Watch this Scientific Journal Video about Modified MicroSecure Vitrification: A Safe, Simple and Highly Effective Cryopreservation Procedure for Human Blastocysts at JoVE.com

Modified MicroSecure Vitrification: A Safe, Simple and Highly Effective Cryopreservation Procedure for Human Blastocysts

MicroSecure Vitrification was developed as a non-commercial, aseptic closed vitrification device system that is compliant with FDA good manufacturing and tissue-handling practices. Due to the withdrawal of hydrophobic plugged embryo straws from the industry, the vitrification procedure was modified to include an inner seal before the standard internal cotton plug.

Modificada Vitrificação MicroSecure: Um Altamente procedimento seguro, simples e eficaz para Criopreservação blastócitos humanos

Clinical embryo vitrification evolved with the development of unique vitrification devices in the 21st century and with the misconception that ultra-rapid ...

modified-microsecure-vitrification-safe-simple-highly-effective

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

11.9K visualizações.  Ovation Fertility. MicroSecure Vitrification was developed as a non-commercial, aseptic closed vitrification device system that is compliant with FDA good manufacturing and tissue-handling practices. Due to the withdrawal of hydrophobic plugged embryo straws from the industry, the vitrification procedure was modified to include an inner seal before the standard internal cotton plug.

Vídeo: Modified MicroSecure Vitrification: A Safe, Simple and Highly Effective Cryopreservation Procedure for Human Blastocysts

Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal and postnatal consequences. To ensure the innocuousness of ART applications, studies in animal models are necessary. In addition, as a last step, embryo development studies require evaluation of their capacity to develop full-term healthy offspring. Here, embryo transfer to the uterus is indispensable to perform any ARTs-related experiment.
The rabbit has been used as a model organism to study mammalian reproduction for over a century. In addition to its phylogenetic proximity to the human species and its small size and low maintenance cost, it has important reproductive characteristics such as induced ovulation, a chronology of early embryonic development similar to humans and a short gestation that allow us to study the consequences of ART application easily. Moreover, ARTs (such as intracytoplasmic sperm injection, embryo culture, or cryopreservation) are applied with suitable efficiency in this species.
Using the laparoscopic embryo transfer technique and the cryopreservation protocol presented in this article, we describe 1) how to transfer embryos through an easy, minimally invasive technique and 2) an effective protocol for long-term storage of rabbit embryos to provide time-flexible logistical capacities and the ability to transport the sample. The outcomes obtained after transferring rabbit embryos at different developmental stages indicate that morula is the ideal stage for rabbit embryo recovery and transfer. Thus, an oviductal embryo transfer is required, justifying the surgical procedure. Furthermore, rabbit morulae are successfully vitrified and laparoscopically transferred, proving the effectiveness of the described techniques.

Assisted reproductive techniques (ARTs) are in continuous evaluation to improve outcomes and reduce the associated risks. This manuscript describes a minimally invasive embryo transfer procedure with an efficient cryopreservation protocol that allows the use of rabbits as an ideal animal model of human reproduction.

Transferência de embriões minimamente invasivos e vitrificação embrionária na fase de embrião ideal em modelo de coelho

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal ...

Biologia do Desenvolvimento

Human Blastocyst Biopsy and Vitrification

Blastocyst biopsy is performed to obtain a reliable genetic diagnosis during IVF cycles with preimplantation genetic testing. Then, the ideal workflow entails a safe and efficient vitrification protocol, due to the turnaround time of the diagnostic techniques and to transfer the selected embryo(s) on a physiological endometrium in a following natural cycle. A biopsy approach encompassing the sequential opening of the zona pellucida and retrieval of 5-10 trophectoderm cells (ideally 7-8) limits both the number of manipulations required and the exposure of the embryo to sub-optimal environmental conditions. After proper training, the technique was reproducible across different operators in terms of timing of biopsy (~8 min, ranging 3-22 min based on the number of embryos to biopsy per dish), conclusive diagnoses obtained (~97.5%) and live birth rates after vitrified-warmed euploid blastocyst transfer (&#62;40%). The survival rate after biopsy, vitrification and warming was as high as 99.8%. The re-expansion rate at 1.5 h from warming was as high as 97%, largely dependent on the timing between biopsy and vitrification (ideally &#8804;30 min), blastocyst morphological quality and day of biopsy. In general, it is better to vitrify a collapsed blastocyst; therefore, in non-PGT cycles, laser-assisted artificial shrinkage might be performed to induce embryo collapse prior to cryopreservation. The most promising future perspective is the non-invasive analysis of the IVF culture media after blastocyst culture as a putative source of embryonic DNA. However, this potential avant-garde is still under investigation and a reliable protocol yet needs to be defined and validated.

Blastocyst biopsy and vitrification are required to efficiently conduct preimplantation genetic testing. An approach entailing the sequential opening of the zona pellucida and retrieval of 7-8 trophectoderm cells in day 5-7 post-insemination limits both the number of manipulations required and the exposure of the embryo to sub-optimal environmental conditions.

Biópsia e vitrificação humana do Blastocyst

Blastocyst biopsy is performed to obtain a reliable genetic diagnosis during IVF cycles with preimplantation genetic testing. Then, the ideal workflow ...

Minimum Volume Vitrification of Immature Feline Oocytes

In wild animals&#8217; conservation programs, gamete banking is crucial to safeguard genetic resources of valuable individuals and rare species and to promote biodiversity preservation. In felids, most species are threatened with extinction, and domestic breeds are used as a model to increase the efficiency of protocols for germplasm banking. Among oocyte cryopreservation techniques, vitrification is more and more popular in human and veterinary assisted reproduction. Cryotop vitrification, which was at first developed for human oocytes and embryos, has demonstrated to be well-suited for cat oocytes. This method offers several advantages, such as the feasibility in field conditions and the speed of the procedure, which can be helpful when several samples need to be processed. However, the efficiency is strongly dependent on the operator&#8217;s skills, and intra- and inter-laboratory standardization are needed, as well as personnel training. This protocol describes minimum volume vitrification of immature feline oocytes on a commercial support in a step by step field-friendly protocol, from oocyte collection to warming. Following the protocol, preservation of oocyte integrity and viability at warming (as high as 90%) can be expected, although there is still room for improvement in post-warming maturation and embryonic development outcomes.

This manuscript describes a protocol for the minimum volume vitrification of immature cat oocytes with laboratory-made media on commercial supports. It covers every step from oocyte isolation from ex vivo gonads to vitrification and warming.

Vitrificação de Volume Mínimo de Oócitos Felinos Imaturos

In wild animals&#8217; conservation programs, gamete banking is crucial to safeguard genetic resources of valuable individuals and rare species and to ...

Vitrification of In Vitro Matured Oocytes Collected from Adult and Prepubertal Ovaries in Sheep

In livestock, in vitro embryo production systems can be developed and sustained thanks to the large number of ovaries and oocytes that can be easily obtained from a slaughterhouse. Adult ovaries always bear several antral follicles, while in pre-pubertal donors the maximal numbers of oocytes are available at 4 weeks of age, when ovaries bear peak numbers of antral follicles. Thus, 4 weeks old lambs are considered good donors, even if the developmental competence of prepubertal oocytes is lower compared to their adult counterpart. 
Basic research and commercial applications would be boosted by the possibility of successfully cryopreserving vitrified oocytes obtained from both adult and prepubertal donors. The vitrification of oocyte collected from prepubertal donors would also allow shortening the generation interval and thus increasing the genetic gain in breeding programs. However, the loss of developmental potential after cryopreservation makes mammalian oocytes probably one of the most difficult cell types to cryopreserve. Among the available cryopreservation techniques, vitrification is widely applied to animal and human oocytes. Despite recent advancements in the technique, exposures to high concentrations of cryoprotective agents as well as chilling injury and osmotic stress still induce several structural and molecular alterations and reduce the developmental potential of mammalian oocytes. Here, we describe a protocol for the vitrification of sheep oocytes collected from juvenile and adult donors and matured in vitro prior to cryopreservation. The protocol includes all the procedures from oocyte in vitro maturation to vitrification, warming and post-warming incubation period. Oocytes vitrified at the MII stage can indeed be fertilized following warming, but they need extra time prior to fertilization to restore damage due to cryopreservation procedures and to increase their developmental potential. Thus, post-warming culture conditions and timing are crucial steps for the restoration of oocyte developmental potential, especially when oocyte are collected from juvenile donors.

The protocol aims at providing a standard method for the vitrification of adult and juvenile sheep oocytes. It includes all the steps from the preparation of the in vitro maturation media to the post-warming culture. Oocytes are vitrified at the MII stage using Cryotop to ensure the minimum essential volume.

Vitrificação de Oócitos Maduros In Vitro coletados de ovários adultos e prepubertais em ovelhas

In livestock, in vitro embryo production systems can be developed and sustained thanks to the large number of ovaries and oocytes that can be easily ...

Morphometric Protocol for the Objective Assessment of Blastocyst Behavior During Vitrification and Warming Steps

This article describes the noninvasive method of blastocyst morphometry based on time-lapse microphotography for the accurate monitoring of a blastocyst&#39;s volume changing during individual phases before and after vitrification. The method can be useful in searching for the most optimal timing of blastocyst exposure to different concentrations of cryoprotectants by observing blastocyst shrinkage and re-expansion in different pre- and post-vitrification phases. With this methodology, the blastocyst vitrification protocol can be optimized. For a better demonstration of the usefulness of this morphometric method, two different blastocyst preparation protocols for vitrification are compared; one with using an artificial blastocoel collapsing and one without this intervention before vitrification. Both blastocysts&#39; volume changes are followed by time-lapse microphotography and measured by photo-editing software tools. The measurements are taken every 20 seconds in previtrification phases and every 5 minutes in the post-warming period. The changes of the blastocyst dimensions per time unit are presented graphically in line diagrams. The results show a long equilibration previtrification phase in which the intact blastocyst first shrinks and then slowly refills the blastocoel, entering vitrification with a fluid-filled blastocoel. The artificially collapsed blastocyst remains in its shrunken stage through the entire equilibration phase. During the vitrification phase, it also does not change its volume. Since the blastocyst morphometry shows a constant volume of the artificially collapsed blastocysts during the previtrification step, it seems that this stage could be shorter. The described protocol provides many additional comparative parameters of blastocyst behavior during and after cryopreservation on the basis of the speed and intensity of the volume changes, the number of partial blastocoel contractions or total blastocyst collapses, and the time to a total blastocoel re-expansion or the time to hatching.

Here we present a time-lapse morphometric protocol to follow the intensity of blastocyst shrinkage and re-expansion during previtrification interventions and post-warming recovery. The application of the protocol is possible in in vitro fertilization laboratories equipped with time-lapse microscopes and is recommended in the development of an optimal blastocyst vitrification method.

Morfométricos protocolo para a avaliação objetiva do comportamento de blastocisto durante a vitrificação e aquecimento passos

This article describes the noninvasive method of blastocyst morphometry based on time-lapse microphotography for the accurate monitoring of a ...

Bioengenharia

Cryopreservation of Preimplantation Embryos of Cattle, Sheep, and Goats

Preimplantation embryos from cattle, sheep, and goats may be cryopreserved for short- or long-term storage. Preimplantation embryos consist predominantly of water, and the avoidance of intracellular ice crystal formation during the cryopreservation process is of paramount importance to maintain embryo viability. Embryos are placed into a hypertonic solution (1.4 &#x2013; 1.5 M) of a cryoprotective agent (CPA) such as ethylene glycol (EG) or glycerol (GLYC) to create an osmotic gradient that facilitates cellular dehydration. After embryos reach osmotic equilibrium in the CPA solution, they are individually loaded in the hypertonic CPA solution into 0.25 ml plastic straws for freezing. Embryos are placed into a controlled rate freezer at a temperature of -6&deg;C. Ice crystal formation is induced in the CPA solution surrounding the embryo, and crystallization causes an increase in the concentration of CPA outside of the embryo, causing further cellular dehydration. Embryos are cooled at a rate of 0.5&deg;C/min, enabling further dehydration, to a temperature of -34&deg;C before being plunged into liquid nitrogen (-196&deg;C). Cryopreserved embryos must be thawed prior to transfer to a recipient (surrogate) female. Straws containing the embryos are removed from the liquid nitrogen dewar, held in room temperature air for 3 to 5 sec, and placed into a 37&deg;C water bath for 25 to 30 sec. Embryos cryopreserved in GLYC are placed into a 1 M solution of sucrose for 10 min for removal of the CPA before transfer to a recipient (surrogate) female. Embryos cryopreserved in EG, however, may be directly transferred to the uterus of a recipient.

Preimplantation embryos may be cryopreserved after placement into a hypertonic cryoprotective solution to cause cellular dehydration. After equilibration, ice crystal formation is induced in the solution surrounding the embryo. Further dehydration occurs as the embryo is slowly cooled to subzero temperatures before plunging into liquid nitrogen for storage.

Criopreservação de embriões pré-implantatório de bovinos, ovinos e caprinos

Preimplantation embryos from cattle, sheep, and goats may be cryopreserved for short- or long-term storage.  Preimplantation embryos consist predominantly ...

Biologia

Cryopreservation of Mouse Embryos by Ethylene Glycol-Based Vitrification

Cryopreservation of mouse embryos is a technological basis that supports biomedical sciences, because many strains of mice have been produced by genetic modifications and the number is consistently increasing year by year. Its technical development started with slow freezing methods in the 1970s1, then followed by vitrification methods developed in the late 1980s2. Generally, the latter technique is advantageous in its quickness, simplicity, and high survivability of recovered embryos. However, the cryoprotectants contained are highly toxic and may affect subsequent embryo development. Therefore, the technique was not applicable to certain strains of mice, even when the solutions are cooled to 4&deg;C to mitigate the toxic effect during embryo handling. At the RIKEN BioResource Center, more than 5000 mouse strains with different genetic backgrounds and phenotypes are maintained3, and therefore we have optimized a vitrification technique with which we can cryopreserve embryos from many different strains of mice, with the benefits of high embryo survival after vitrifying and thawing (or liquefying, more precisely) at the ambient temperature4.
Here, we present a vitrification method for mouse embryos that has been successfully used at our center. The cryopreservation solution contains ethylene glycol instead of DMSO to minimize the toxicity to embryos5. It also contains Ficoll and sucrose for prevention of devitrification and osmotic adjustment, respectively. Embryos can be handled at room temperature and transferred into liquid nitrogen within 5 min. Because the original method was optimized for plastic straws as containers, we have slightly modified the protocol for cryotubes, which are more easily accessible in laboratories and more resistant to physical damages. We also describe the procedure of thawing vitrified embryos in detail because it is a critical step for efficient recovery of live mice. These methodologies would be helpful to researchers and technicians who need preservation of mouse strains for later use in a safe and cost-effective manner.

An ethylene glycol-based vitrification method for mouse embryos is described. It is advantageous to other methods in its simplicity and low embryonic toxicity, and therefore can be broadly applicable to many strains of mice, including inbred and gene-modified mice.

Criopreservação de embriões de camundongos por Vitrificação Etileno Glicol-Based

Cryopreservation of mouse embryos is a technological basis that supports biomedical sciences, because many strains of mice have been produced by genetic ...

Bulk Droplet Vitrification for Primary Hepatocyte Preservation

Vitrification is a promising ice-free alternative for classic slow-freezing (at approximately 1 &#176;C/min) cryopreservation of biological samples. Vitrification requires extremely fast cooling rates to achieve transition of water into the glass phase while avoiding injurious ice formation. Although pre-incubation with cryoprotective agents (CPA) can reduce the critical cooling rate of biological samples, high concentrations are generally needed to enable ice-free cryopreservation by vitrification. As a result, vitrification is hampered by CPA toxicity and restricted to small samples that can be cooled fast. It was recently demonstrated that these inherent limitations can be overcome by bulk droplet vitrification. Using this novel method, cells are first pre-incubated with a low intracellular CPA concentration. Leveraging rapid osmotic dehydration, the intracellular CPA is concentrated directly ahead of vitrification, without the need to fully equilibrate toxic CPA concentrations. The cellular dehydration is performed in a fluidic device and integrated with continuous high throughput generation of large sized droplets that are vitrified in liquid nitrogen. This ice-free cryopreservation method with minimal CPA toxicity is suitable for large cell quantities and results in increased hepatocyte viability and metabolic function as compared to classical slow-freezing cryopreservation. This manuscript describes the methods for successful bulk droplet vitrification in detail.

This manuscript describes an ice-free cryopreservation method for large quantities of rat hepatocytes whereby primary cells are pre-incubated with cryoprotective agents at a low concentration and vitrified in large droplets.

Vitrificação de gotículas em massa para preservação primária de hepatócitos

Vitrification is a promising ice-free alternative for classic slow-freezing (at approximately 1 &#176;C/min) cryopreservation of biological samples. ...

Fertility Preservation Through Oocyte Vitrification: Clinical and Laboratory Perspectives

Preserving female fertility is crucial in a multifunctional healthcare system that takes care of patients' future quality of life. Oocyte cryopreservation is recognized by several international scientific societies as the gold standard for fertility preservation in postpubertal women, for both medical and non-medical indications. The main medical indications are oncologic diseases, gynecologic diseases such as severe endometriosis, systemic diseases compromising the ovarian reserve, and genetic conditions involving premature menopause. This paper describes the whole clinical and laboratory work-up of a fertility preservation treatment by outlining recommendations for objective and evidence-based counseling. Furthermore, it focuses on the effectiveness of the procedure and describes the most appropriate strategies to fully exploit the ovarian reserve and maximize the number of oocytes retrieved in the shortest possible time. The evaluation of the ovarian reserve, the definition of an ideal stimulation protocol, as well as oocyte retrieval, denudation, and vitrification procedures have been detailed along with approaches to maximize their efficacy, efficiency, and safety.

Oocyte cryopreservation is recognized by several international scientific societies as the gold standard for fertility preservation in postpubertal women. Appropriate clinical and laboratory strategies ensure maximum efficacy, efficiency, and safety of fertility preservation treatments.

Preservação da Fertilidade Através da Vitrificação de Oócitos: Perspectivas Clínicas e Laboratoriais

Preserving female fertility is crucial in a multifunctional healthcare system that takes care of patients' future quality of life. Oocyte cryopreservation ...

Medicina

<meta charset="utf8"></head><body>Avaliação da viabilidade folicular em tecidos de córtex ovariano humano vitrificado

Vitrification of Ovarian Cortex Tissue to Achieve a Glassy State of Aggregation

Ovarian tissue cryopreservation (OTC) is an important option for fertility preservation. For patients whose gonadotoxic treatments cannot be postponed or for pre-pubertal girls, it is often the only option for fertility protection. Cryopreservation can be performed either by vitrification or by slow freezing. Slow freezing is currently the standard approach. An increasing number of studies indicate that vitrification can replace slow freezing in the state-of-the-art in vitro fertilization (IVF) laboratories, significantly improving thawing survival rates and simplifying the technical aspects of cryopreservation. A metal grid-based, high-throughput protocol for rapid vitrification of ovarian cortex tissue, suitable for clinical routine, is described. The sterilization of metal grids and liquid nitrogen ensures high quality, meeting good manufacturing practice (GMP) standards. Vitrification was conducted to ensure ultra-rapid cooling rates. Instead of slowly thawing, samples were rapidly warmed. To assess follicular viability, calcein staining was performed both prior to cryopreservation and after rapid warming. The successful application of vitrification and rapid warming using metal grids is reported. No significant differences in follicular viability were observed prior to vitrification and after rapid warming. These results substantiate the high capacity of tissue vitrification for clinical routine applications as a potential substitute for the widely used slow-freezing method.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor em destaque: Avançando na preservação da fertilidade em pacientes jovens com câncer por meio da vitrificação do tecido ovariano e do crescimento folicular in

A protocol for the vitrification of ovarian tissue, as an alternative cryopreservation method to the widely used slow freezing protocol, is presented.

Vitrificação do tecido do córtex ovariano para atingir um estado vítreo de agregação

Ovarian tissue cryopreservation (OTC) is an important option for fertility preservation. For patients whose gonadotoxic treatments cannot be postponed or ...