A vitrificação é tipicamente tratada pela toxicidade dos agentes crioprotetores. E reinserido em pequenas amostras que podem ser resfriadas rapidamente. Este protocolo permite a vitrificação de grandes quantidades celulares enquanto usa uma baixa concentração de CPA durante a pré-incubação.
Usando desidratação osmótica rápida, o CPA inter-adega baixo está concentrado no dispositivo fluido diretamente antes da vitrificação. Isso elimina a necessidade de equilibrar totalmente as concentrações tóxicas de CPA. A vitrificação de gotículas em massa pode fornecer hepatócitos viáveis e metabolicamente ativos para o uso de transplante de hepatócitos e dispositivos hepáticos bio-artificiais que atualmente dificultam por desfechos inadequados após a criopreservação.
Este método pode potencialmente ser adaptado para vitrificação de outros tipos de células que precisam ser preservados em grandes quantidades; como produtos sanguíneos ou células-tronco, entre outros. Para começar, faça a solução de vitrificação 1 adicionando 40 miligramas de BSA a 17,0 mililitros da University of Wisconsin Solution. Use um filtro de 0,22 micrômetro para filtrar a solução e armazenar a quatro graus Celsius.
Faça a solução de vitrificação 2 conforme descrito no protocolo. E filtrar estéril através de um filtro de 0,22 micrômetros. Carregue 3,5 mililitros de solução V2 filtrada estéril em uma seringa de três mililitros e armazene a quatro graus Celsius.
Para preparar o aparelho de vitrificação de gota a granel, primeiro, corte ao longo de um lado da manga cinza exterior das agulhas de mistura. Dobre a manga aberta para removê-la da agulha de mistura. Em seguida, corte a agulha de mistura para um comprimento de 20 milímetros e insira sua saída de corte em uma agulha de injeção de calibre 20.
Deslize duas seções de tubos de silício de 25 milímetros sobre as entradas da agulha de mistura. E garantir sua posição com cola. Esterilize este conjunto autoclaving.
Encha um frasco estéril de Dewar com nitrogênio líquido. E esterilize o exterior com isopropanol antes de colocá-lo em uma estéril capa de cultura laminer. Certifique-se de usar equipamentos de proteção individual adequados, pois o nitrogênio líquido pode causar queimaduras graves.
Para criar o dispositivo de coleta de gotículas, insira um funil com o mesmo diâmetro externo do diâmetro interno do Dewar, em um tubo cônico de 50 mililitros. Usando grandes fórceps, pressione lentamente o dispositivo de coleta de gotículas para baixo no nitrogênio líquido em sua posição vertical final. Certifique-se de que o tubo cônico repousa na posição vertical na parte inferior do Dewar.
E o nível de nitrogênio líquido é um centímetro mais baixo que a borda do funil. Para montar uma bomba de seringa em uma posição vertical na parede do capô de cultura celular, amarre uma corda dos pés da bomba de seringa aos parafusos salientes da parede do capô da cultura celular. Em seguida, coloque o nitrogênio líquido Dewar com o dispositivo de coleta de gotículas sob a bomba de seringa verticalmente montada.
Após a obtenção de hepatócitos de rato recém-isolados, conte a concentração de estoque por exclusão azul tri-pan. E transferir 40 milhões de hepatócitos viáveis para um tubo cônico de 50 mililitros. Centrifugar os hepatócitos a 50 vezes G por cinco minutos sem pausa.
Aspire o supernatante. Suspenda os hepatócitos em 3,4 mililitros da Solução V1. E incubar no gelo por três minutos.
Em seguida, adicione 150 microliters de DMSO e 150 microliters de EG;misture suavemente e incubar no gelo novamente por três minutos. Adicione 150 microliters de DMSO e 150 microliters de EG aos hepatócitos novamente e misture suavemente. Carregue 3,5 mililitros desta mistura em uma seringa de três mililitros.
Insira a seringa com hepatócitos pré-incubados e a seringa com solução V2 no adaptador da bomba de seringa. Conecte dois adaptadores femininos de mangueira-barb Luer Lock às seringas. E deslize a tubulação de silicone do conjunto de agulhas de mistura sobre os encaixes de barb.
Coloque toda essa montagem na bomba de seringa. Três minutos após a última edição de DMSO e EG para os hepatócitos, inicie a bomba a dois mililitros por minuto. Depois de todos os hepatócitos foram adicionados ao nitrogênio líquido parar a bomba.
Usando uma agulha calibre 20, puna 10 pequenos furos na tampa de um tubo cônico de 50 mililitros. E enrole o lado de fora da tampa com um filme flexível, criando uma válvula que permitirá a fuga da evaporação do nitrogênio líquido restante. Para coletar as gotículas de hepatócito vitrificadas, primeiro remova o funil do Dewar com nitrogênio líquido.
Em seguida, com fórceps longos, retire o tubo cônico que contém as gotículas do nitrogênio líquido, e despeje lentamente o excesso de nitrogênio líquido do tubo cônico. Feche o tubo cônico com a tampa perfurada e, em seguida, coloque diretamente o tubo cônico fechado com gotículas de hepatócitas vitrificadas de volta no Dewar com nitrogênio líquido. Finalmente, transfira o tubo cônico do nitrogênio líquido para um criotank de nitrogênio líquido.
Depois de fazer a solução de reaquecimento com sacarose e mídia de cultura hepatócida DMEM, use um filtro de 0,22 micrômetro para filtrar estéril. Em seguida, aqueça-o a 37 graus Celsius. Para reaquecir os hepatócitos remova o tubo cônico com hepatócitos vitrificados do criotank e transporte-o em um nitrogênio líquido Dewar para a subcultura.
Solte levemente a tampa e coloque o tubo cônico de volta no nitrogênio líquido. Trabalhando rapidamente, adicione todas as gotículas de hepatócito vitrificadas a um béquer vazio, em seguida, adicione rapidamente 100 mililitros de solução de reaquecimento quente de 37 graus Celsius enquanto mexe por 10 segundos. Quando as gotículas são removidas do congelamento intra-est de nitrogênio líquido ocorre em segundos se as gotículas não forem rapidamente recasadas.
Portanto, é fundamental adicionar diretamente a mídia de reaquecimento às gotículas enquanto mexe. Divida a solução de reaquecimento com hepatócitos em dois tubos cônicos de 50 mililitros. Centrifugar os tubos por dois minutos a 100 vezes G a quatro graus Celsius sem quebrar.
Aspire os supernantes para deixar um volume total de 12,5 mililitros usando a marca de graduação do tubo como referência. Para diluir a solução de reaquecimento a 50% adicione 12,5 mililitros de DMEM gelado por tubo cônico. Suspenda e incuba no gelo por três minutos.
Para diluir a solução de reaquecimento a 25% adicione 25 mililitros de DMEM gelado por tubo cônico. Depois de centrifugar por cinco minutos a 50 vezes G a quatro graus Celsius sem pausa, aspirar o supernatário e suspender os hepatócitos em dois mililitros do meio de cultura desejado. Quando medido por testes de exclusão azul tri-pan, que determina a integridade da membrana, a vitrificação de gotículas em massa resultou em uma viabilidade hepatócida pós-preservação direta de 79%Esta foi significativamente maior do que a viabilidade de 68% após a criopreservação clássica otimizada.
O rendimento da vitrificação de gotículas a granel foi de 56%, 10% maior e mais consistente que a criopreservação clássica. Usando o ensaio de metabolização de pré-cola em culturas universitárias e sanduíches de longo prazo, a atividade metabólica nos hepatócitos foi medida para ser significativamente maior após a vitrificação de gotículas em massa, em seguida, após a criopreservação clássica. A síntese de albumina, como o parâmetro mais utilizado da função sintética dos hepatocitos, foi maior em quase duas vezes após a vitrificação de gotículas a granel, depois da criopreservação clássica.
A produção de ureia foi usada para medir a função de desintoxicação de hepatócitos em uma cultura de uma semana. Em hepatocitos vitrificados a granel, a produção de ureia foi significativamente maior do que a dos hepatócitos criopreservados clássicos. Para resultados consistentes após a vitrificação de gotículas em massa, é importante acompanhar exatamente o tempo durante a pré-incubação de CPAs e reaquecimento conforme detalhado neste protocolo.
Depois de reaquecimento das gotículas de hepatócitas vitrificadas, você acabará com uma suspensão de tamanho melhor que, portanto, pode ser usada da mesma forma como se estivessem recém-isoladas. Como um método de preservação melhorado, a vitrificação de gotículas em massa pode aumentar a disponibilidade pri-ma para pesquisas e aplicações clínicas.
