Financiamento parcial do projeto de pesquisa USDA multi-estado W-2171 &quot;Células Germinativas e Desenvolvimento e manipulação dos embriões para a Melhoria da Pecuária&quot; é reconhecido agradecimento. Os talentos artísticos de Ryan Callahan, que preparou as ilustrações técnicas para a parte de vídeo do presente artigo, são também reconhecido agradecimento.

1. Avaliar a adequação de embriões para criopreservação 1 <ol><li> Amostras colhidas a partir do trato reprodutivo de fêmeas dadoras indivíduo deve ser colocado em um meio isotônico embrião segurando por 10 minutos antes da avaliação em um estereomicroscópio. Esteja certo de manter os embriões de cada fêmea doadora separados um do outro para permitir a identificação de paternidade de filhos de transferência de embriões. </li><li> Usando baixa ampliação (≤ 10X), as amostras de uma fêmea doadora individual deve ser segregado em grupos separados de óvulos não fertilizados consistindo, embriões degenerados, ou embriões de qualidade transferíveis. Apenas o grau de qualidade 1 ou 2 embriões na mórula compacta através de estágios de blastocisto expandido de desenvolvimento são adequados para a criopreservação, e todos os outros deve ser descartada (a não ser fêmeas receptoras síncronas estão disponíveis para a qualidade de grau 3 embriões e uma taxa de gravidez após a transferência de aproximadamente 25 -30% é considerada aceitável). </li><li> Inspecionar grau de qualidade 1 e 2 mórula compacta através de embriões em estágio de blastocisto expandido, com uma ampliação ≥ 50X para garantir que a zona pelúcida do embrião está intacta e que não há material (por exemplo, células, muco) aderir à zona pelúcida. Qualquer embrião com um rachado ou faltando zona pelúcida ou com uma zona pelúcida ter material aderente devem ser separados dos outros embriões e quer ser descartados ou tratados separadamente. </li></ol> 2. Embriões de lavar para reduzir a probabilidade de transmissão da doença 2 <ol><li> Mova zona pelúcida intacta embriões em um volume médio mínimo de embrião isotônica segurando no primeiro poço do meio de embrião de lavar roupa (por exemplo, tampão fosfato salino aumentou com antibióticos e soro albumina bovina, soro de vitelo recém-nascido, ou álcool de polivinil). Manter os embriões de cada fêmea doadora separadas, e não tentativa de lavar mais de 10 embriões de uma só vez. Mova embriões em um volume mínimo de meio para cada lavagem sucessivos para atingir uma diluição em série ≥ 1:100, e ter a certeza de usar dicas embrião estéril manipulação que são alterados entre cada lavagem sucessivos. </li><li> Mova embriões a 4 lavagens mais como descrito em 2.1. </li><li> Se a transmissão de doenças virais é de preocupação, lave embriões duas vezes em uma solução de tripsina 0,25%, para um tempo de exposição total combinado de tripsina de não mais de 90 segundos. </li><li> Após as duas lavagens de tripsina, lavar 5 vezes mais embriões em meio de embriões de lavagem como descrito em 2.1. </li><li> Após a lavagem embrião final, embriões lugar em embrião isotônica segurando médio. </li></ol> 3. Desidratação Embriões Antes de Criopreservação 3 <ol><li> Embriões devem ser transferidos em um volume mínimo de meio isotônico embrião segurando em uma solução hipertônica (1,4-1,5 concentração Molar) de um agente de crioprotetores (CPA), tais como etilenoglicol ou glicerol. </li><li> Permitir que embriões para sentar-se em meio de congelamento (solução hipertônica CPA) até atingirem o equilíbrio osmótico. Porque o etileno glicol permeia células embrionárias mais rapidamente do que o glicerol, os tempos de equilíbrio são tipicamente menos de embriões em etileno glicol (5 min) do que em glicerol (10 min). Parte deste tempo de equilíbrio pode ser alcançado durante e após os embriões são carregados em canudos (descrito na próxima etapa). </li></ol> 4. Embriões de carga em um canudo de plástico 0,25 ml para Criopreservação <ol><li> Anexar o fim tampão de algodão de um canudo de plástico 0,25 ml (11,5 cm de comprimento de trabalho) a um dispositivo de carga embrião, e aspirar aproximadamente 1,3 cm de solução hipertônica CPA em um canudo devidamente rotulados. Uma variedade de procedimentos de rotulagem existe, incluindo o uso de etiquetas impressas ligado a qualquer tomada de vedação de um canudo ou a outra palha conectado com um adaptador de palha. </li><li> Remover a palha da solução CPA, e aspirar aproximadamente 0,15 cm de ar para criar uma bolha de ar minúsculas dentro do canudo. </li><li> Aspirar um único embrião em aproximadamente 0,8 centímetros de solução hipertônica CPA na palha. </li><li> Remover a palha da solução CPA e aspirado de aproximadamente 0,15 cm de ar para criar uma bolha de ar segunda minúscula dentro da palha (bolhas de ar servem para isolar fisicamente o embrião dentro da palha). </li><li> Aspirar cerca de 9,1 centímetros de solução CPA para encher completamente a palha, sendo certo para atrair um volume suficiente de solução CPA para umedecer o policloreto de vinila (PVC) em pó que existe dentro da end tampão de algodão da palha. A solução faz com que o CPA pó de PVC para gel e selar essa extremidade da palha. </li><li> Selar o outro lado da palha com PVC em pó, tampões de fecho de plástico de palha, ou um aferidor de calor. </li></ol> 5. Colocação de Embriões em uma máquina de congelação controlada Taxa de Embrião <ol><li> Por banho de metanol ou nitrogênio líquido máquinas de congelamento de vapor pode ser programado para criopreservação de embriões pré-implantação. </li><li> Carregar os canudos que contém o Embry<html> OS em uma máquina de congelação cuja temperatura foi resfriado da temperatura ambiente até -6 ° C. Palhas de carga final algodão plug-up (a menos que plugs canudo de plástico de vedação ou placas de palha estão sendo usados, caso em que end tampão de algodão é colocado para baixo). </li><li> Permitir que embriões para sentar-se a esta temperatura durante pelo menos 2 minutos antes de prosseguir. </li></ol> 6. Semeadura <ol><li> Uma vez que os embriões têm arrefecido a -6 ° C, use um par de pinças supercooled em nitrogênio líquido (ou uma vara com ponta de algodão mergulhada em nitrogênio líquido) para induzir a formação de cristais de gelo na solução CPA dentro da palha, tocando as tenazes (ou algodão vara com ponta) para a coluna de solução acima ou abaixo do embrião. </li><li> A água na solução CPA irá se cristalizar na região expostos ao nitrogênio líquido e cristais de gelo vai se espalhar para a coluna de solução CPA imediatamente em torno do embrião. </li><li> Manter os embriões em semeadura temperatura por 10 minutos antes de arrefecimento adicional. </li></ol> 7. A desidratação contínua de Embriões <ol><li> Embriões frescos a uma taxa de 0,5 ° C / min até uma temperatura de -34 ° C. Esta taxa de resfriamento é importante para garantir a desidratação contínua do embrião. </li><li> Manter os embriões em -34 ° C por 10 minutos antes de mergulhar embriões em nitrogênio líquido (-196 ° C). </li><li> Lugar embriões criopreservados em uma taça devidamente rotulados (preenchido com nitrogênio líquido) anexado a um cana devidamente rotulados, e coloque a cana em uma vasilha de um líquido de nitrogênio dewar para armazenamento de curto ou longo prazo. </li></ol> 8. Descongelar embriões criopreservados <ol><li> Puxe a caixinha no pescoço do nitrogênio líquido dewar, garantindo que o recipiente permanece abaixo da linha de geada na dewar. </li><li> Localize a cana que contém o embrião para ser descongeladas, e rapidamente e retire com cuidado a palha do cálice, sendo certo não aquecer demais palhas na taça. </li><li> Segure o canudo no ar por 3-5 segundos (para reduzir a incidência de um rachado zona pelúcida 4), ​​e depois submerge em um banho de água 37 ° C por mais 25-30 segundos. </li><li> Remover a palha do banho de água, limpe a palha (tomando cuidado para não sujar a identificação do embrião na palha), use um dispositivo de corte para a palha cortarei a continuação macho não de algodão da palha (se o calor usando seladas ou PVC em pó ), ou remova cuidadosamente o bujão de plástico, e: <ol type="a"><li> carregar a palha em um dispositivo de transferência de embriões e transferência o mais rápido possível a um destinatário embrião síncrona (mas só se o embrião foi criopreservado utilizando o etilenoglicol como o CPA), ou </li><li> segurar a extremidade aberta da palha sobre um prato contendo uma concentração de 1,0 Molar de sacarose (um composto não-permeando), e usar uma tesoura para cortar o fim tampão de algodão da palha. Conteúdo da palha deve fluir livremente na solução de sacarose, mas empurrando uma pequena coluna de ar através da palha pode ser necessária se qualquer meio residual existe dentro da palha. Permitir que embriões de permanecer em solução de sacarose por 10 minutos, e depois transferir embriões em embrião isotônica segurando médio por 10 minutos. Avaliar embriões pós-descongelamento, a carga em um canudo novo, e transferência para fêmeas receptor adequado. </li></ol></li></ol> 9. Resultados representativos: Uma variedade de fatores pode influenciar a gravidez e viver as taxas de natalidade resultantes da transferência de embriões congelados e descongelados de pré-implantação para fêmeas receptoras síncronas 5. Embriões em estágios de desenvolvimento menos avançados do que mórula compacta ou mais avançada do que blastocisto expandido, muitas vezes não sobrevivem ao processo de criopreservação de embriões, bem como na mórula compacta, blastocisto inicial, blastocisto e blastocisto expandido estágios do desenvolvimento embrionário. Embriões de grau de qualidade 1 e 2 maior rendimento de taxas pós-descongelamento a gravidez do que a qualidade de grau 3 embriões (que normalmente não são criopreservados devido às baixas taxas pós-descongelamento gravidez). Embriões mishandled durante o congelamento de embriões ou embrião descongelamento procedimentos são propensos a apresentar taxas de gravidez reduzida. Embriões transferidos para fêmeas receptoras cujos ciclos estrais não estão sincronizadas com a da fêmea doadora normalmente produzem taxas menores de gravidez. Embriões produzidos in vitro ou manipulados de alguma maneira (por exemplo, biópsia ou dividido) costumam gerar taxas menores de gravidez. Sob condições ótimas, as taxas de gravidez obtidas após a transferência de congelados e descongelados in vivo de embriões derivados é tipicamente 60-70% em bovinos 6,7, 65-75% em ovinos 8,9,10,11, e 60-70% em cabras 12,13,14,15. Da mesma forma, as taxas de gravidez obtidas após a transferência de congelados e descongelados em embriões produzidos in vitro é tipicamente 40-50% em bovinos 6,16, 25-35% em ovinos 17, e 30-40% em cabras 18. ble 1 &quot;/&gt; Tabela 1. Esperado taxas de gravidez após a transferência de embriões congelados e descongelados de espécies de animais domésticos ruminantes para fêmeas receptoras síncronas.

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Não há conflitos de interesse declarados.

Porque os embriões é predominantemente constituído por água, é crucial que os embriões pré-implantação ser adequadamente desidratadas e lentamente resfriado, de acordo com o protocolo descrito aqui para evitar a formação de cristais de gelo intracelular. Uma vez que o processo de resfriamento começou, é importante para manter a mudança de temperatura e unidirecional para evitar flutuações de temperatura. Início da formação de cristais de gelo (&quot;semeadura&quot;) a uma temperatura adequada para a solução CPA específicos é fundamental. Modificações a este resfriamento lento / Método de descongelamento rápido para criopreservação de embriões pré-implantação incluir o método de uma etapa (onde a última coluna do meio carregado na palha é a sacarose, em vez de solução CPA) 19 eo método de transferência direta (onde os embriões congelados em etileno glicol são descongelados e transferidos diretamente para o útero de uma fêmea destinatário sem antes remover o etileno glicol a partir do embrião) 20. Para reduzir o volume de etileno glicol depositados no útero de uma transferência direta (DT) do sexo feminino destinatário, é aconselhável para preencher a palha de 0,25 ml com 6 cm segurando médio antes de continuar como descrito anteriormente. Note-se que existe um padrão voluntário no setor comercial de transferência de embrião pré-implantação de embriões criopreservados que para DT devem ser congeladas em amarelo cor de palha e armazenados em amarelo cor de taças no nitrogênio líquido dewar. O setor comercial também tem exigências específicas de rotulagem para todos os embriões criopreservados que devem ser seguidas. Uma alternativa para esse método é vitrificação 21, um método de não equilíbrio de criopreservação onde uma mais concentrada (6-8 M) solução CPA é resfriado ultra-rapidamente causando a solução CPA para mudar do estado líquido para um estado &quot;vidrados&quot; sem gelo cristal formação. Vitrificação é provável mais adequado para a criopreservação de embriões que são menos avançados do que developmentally mórula compacta devido à sua sensibilidade à temperatura aumentada. Esta técnica tem aplicação para a preservação de germoplasma de recursos exclusivos 22, bem como para a indústria de transferência de embrião comerciais internacionais, onde mais de 55% dos cerca de 500.000 embriões pré-implantação bovina transferidos no ano civil de 2008 foram criopreservados. 23

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários (opcional) </th></tr><tr><td> BioLife médio congelar </td><td> Agtech, Inc. </td><td> C18, C18A </td><td> 1,5 M de etileno glicol </td></tr><tr><td> Emcare etileno glicol solução congelar </td><td> ICPBio Reprodução </td><td> IC8, IC10 </td><td> 1,5 M de etileno glicol </td></tr><tr><td> ViGro congelamento de etilenoglicol mais </td><td> Bioniche Saúde Animal </td><td> EVM835 </td><td> 1,5 M de etileno glicol </td></tr><tr><td> Emcare solução congelar 10% de glicerol </td><td> ICPBio Reprodução </td><td> IC12 </td><td> 1,34 M de glicerol </td></tr><tr><td> Emcare um degelo sacarose M </td><td> ICPBio Reprodução </td><td> IC16 </td><td> 1,0 M de sacarose </td></tr><tr><td> ViGro descongelar um passo </td><td> Bioniche Saúde Animal </td><td> EVM247, EVM847 </td><td> 1,0 M de sacarose </td></tr><tr><td> Descongelar ViGro 1-2-3 mais </td><td> Bioniche Saúde Animal </td><td> EVM248, EVM848 </td><td> 5%, 2,5%, 0% de glicerol com 0,5, 0,5, 0,6% de sacarose </td></tr><tr><td> Emcare CSU descongelamento kit </td><td> ICPBio Reprodução </td><td> IC20 </td><td> 6%, 3%, 0% de glicerol com sacarose 10,3% </td></tr><tr><td> BioLife exploração e meio de transferência </td><td> Agtech, Inc. </td><td> C15, C15A </td><td> modificada PBS com BSA 0,4% (albumina bovina) </td></tr><tr><td> Emcare solução segurando </td><td> ICPBio Reprodução </td><td> IC2, IC4, IC6 </td><td> 0,4% BSA (albumina bovina), tampão MOPS (zwitterions inerte) </td></tr><tr><td> ViGro segurando mais </td><td> Bioniche Saúde Animal </td><td> EVM024, EVM824 </td><td></td></tr><tr><td> SYNGRO Segurando médio </td><td> Bioniche Saúde Animal </td><td> ESM024, ESM224, ESM828 </td><td> contém ácido hialurônico, sem produtos de origem animal </td></tr><tr><td> BioLife modificada D-PBS </td><td> Agtech, Inc. </td><td> C06 </td><td> fosfato modificado Dulbecco solução salina tamponada </td></tr><tr><td> BioLife Fração BSA V </td><td> Agtech, Inc. </td><td> B09 </td><td> liofilizado albumina sérica bovina, fração V </td></tr><tr><td> BioLife antibiótico antimicótico </td><td> Agtech, Inc. </td><td> B01 </td><td> anfotericina-B, penicilina G, sulfato de estreptomicina </td></tr><tr><td> BioLife tripsina kit </td><td> Agtech, Inc. </td><td> C22A </td><td> 25 g liofilizada tripsina, água estéril, estéril D-PBS </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><th> Nome do equipamento </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários (opcional) </th></tr><tr><td> Biol-Cool freezer taxa controlada </td><td> STF Sistemas </td><td> BC-IV -40 </td><td> Freezer banho de metanol </td></tr><tr><td> Controle de congelamento freezer taxa controlada </td><td> Cryologic </td><td> CL2200 </td><td> Freezer de nitrogênio líquido </td></tr></tbody></table>

cryopreservation of preimplantation embryos of cattle, sheep, and goats

Pré-implantação de embriões de bovinos, ovinos e caprinos podem ser criopreservados para armazenamento de curto ou longo prazo. Embriões pré-implantação é predominantemente constituído por água, e evitar a formação intracelular de cristais de gelo durante o processo de criopreservação é de suma importância para manter a viabilidade do embrião. Embriões são colocados em uma solução hipertônica (1,4-1,5 M) de um agente de crioprotetores (CPA), tais como etileno glicol (EG) ou glicerol (Glyc) para criar um gradiente osmótico que facilita a desidratação celular. Após atingir o equilíbrio osmótico de embriões na solução CPA, são individualmente carregados na solução hipertônica CPA em 0,25 ml canudos de plástico para congelar. Embriões são colocados em um freezer taxa controlada a uma temperatura de -6 ° C. Formação de cristais de gelo é induzida na solução CPA em torno do embrião, e cristalização provoca um aumento na concentração de CPA fora do embrião, causando desidratação celular ainda mais. Embriões são resfriados a uma taxa de 0,5 ° C / min, permitindo uma maior desidratação, a uma temperatura de -34 ° C antes de ser mergulhado em nitrogênio líquido (-196 ° C). Embriões criopreservados devem ser descongelados antes da transferência para um destinatário (substituto) do sexo feminino. Palhas contendo os embriões são removidos do nitrogênio líquido dewar, realizado em ar ambiente de temperatura de 3 a 5 seg, e colocados em banho-maria a 37 ° C por 25 a 30 seg. Embriões criopreservados em Glyc são colocados em uma solução de sacarose 1 M por 10 min para a remoção do CPA antes da transferência para um destinatário (substituto) do sexo feminino. Embriões criopreservados em EG, no entanto, podem ser diretamente transferidos para o útero de um destinatário.

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Cryopreservation of Preimplantation Embryos of Cattle, Sheep, and Goats

Embriões pré-implantação pode ser criopreservados após a colocação em uma solução hipertônica crioprotectores para causar desidratação celular. Após atingir o equilíbrio, a formação de cristais de gelo é induzida na solução em torno do embrião. Maior desidratação ocorre quando o embrião é lentamente resfriado a temperaturas abaixo de zero antes de mergulhar em nitrogênio líquido para o armazenamento.

Criopreservação de embriões pré-implantatório de bovinos, ovinos e caprinos

Preimplantation embryos from cattle, sheep, and goats may be cryopreserved for short- or long-term storage.  Preimplantation embryos consist predominantly ...

cryopreservation-of-preimplantation-embryos-of-cattle-sheep-and-goats

Research

JoVE Journal

Biology

30.5K visualizações.  Iowa State University. Embriões pré-implantação pode ser criopreservados após a colocação em uma solução hipertônica crioprotectores para causar desidratação celular. Após atingir o equilíbrio, a formação de cristais de gelo é induzida na solução em torno do embrião. Maior desidratação ocorre quando o embrião é lentamente resfriado a temperaturas abaixo de zero antes de mergulhar em nitrogênio líquido para o armazenamento.

Vídeo: Cryopreservation of Preimplantation Embryos of Cattle, Sheep, and Goats

Dissection of 6.5 dpc Mouse Embryos

Analysis of gene expression patterns during early stages of mammalian embryonic development can provide important clues about gene function, cell-cell interaction and signaling mechanisms that guide embryonic patterning. However, dissection of the mouse embryo from the decidua shortly after implantation can be a challenging procedure, and detailed step-by-step documentation of this process is lacking.

Here we demonstrate how post-implantation (6.5 dpc) embryos are isolated by first dissecting the uterus of a pregnant mouse (detection of the vaginal plug was designated day 0.5 poist coitum) and subsequently dissecting the embryo from maternal decidua. The dissection of Reichert's membrane is described as well as the removal of the ectoplacental cone.

Isolation of postimplantation-stage embryos allows one to study gene patterning and analyze cell-lineage decision making processes during embryonic development, but proper dissection of the early embryo can be challenging. This protocol describes a method for isolating early primitive-streak-stage embryos (~6.5 days post coitum [dpc]).

Dissecção de 6,5 embriões de camundongos dpc

Analysis of gene expression patterns during early stages of mammalian embryonic development can provide important clues about gene function, cell-cell ...

Biologia

Plastic Embedding and Sectioning of Xenopus laevis Embryos

Plastic sections maintain true tissue morphology in thin sections of tissue that can be immunostained with fluorescent secondary antibodies, making this method more useful than paraffin-embedded or frozen sections for many types of tissue. The method for staining, plastic embedding, and sectioning is demonstrated in this video.

Incorporação de plástico e secção de embriões Xenopus laevis

Collection and Cryopreservation of Hamster Oocytes and Mouse Embryos

Embryos and oocytes were first successfully cryopreserved more than 30 years ago, when Whittingham et al. 1 and Wilmut 2 separately described that mouse embryos could be frozen and stored at -196 &deg;C and, a few years later, Parkening et al. 3 reported the birth of live offspring resulting from in vitro fertilization (IVF) of cryopreserved oocytes. Since then, the use of cryopreservation techniques has rapidly spread to become an essential component in the practice of human and animal assisted reproduction and in the conservation of animal genetic resources. Currently, there are two main methods used to cryopreserve oocytes and embryos: slow freezing and vitrification. A wide variety of approaches have been used to try to improve both techniques and millions of animals and thousands of children have been born from cryopreserved embryos. However, important shortcomings associated to cryopreservation still have to be overcome, since ice-crystal formation, solution effects and osmotic shock seem to cause several cryoinjuries in post-thawed oocytes and embryos. Slow freezing with programmable freezers has the advantage of using low concentrations of cryoprotectants, which are usually associated with chemical toxicity and osmotic shock, but their ability to avoid ice-crystal formation at low concentrations is limited. Slow freezing also induces supercooling effects that must be avoided using manual or automatic seeding 4. In the vitrification process, high concentrations of cryoprotectants inhibit the formation of ice-crystals and lead to the formation of a glasslike vitrified state in which water is solidified, but not expanded. However, due to the toxicity of cyroprotectants at the concentrations used, oocytes/embryos can only be exposed to the cryoprotectant solution for a very short period of time and in a minimum volume solution, before submerging the samples directly in liquid nitrogen 5. In the last decade, vitrification has become more popular because it is a very quick method in which no expensive equipment (programmable freezer) is required. However, slow freezing continues to be the most widely used method for oocyte/embryo cryopreservation. In this video-article we show, step-by-step, how to collect and slowly freeze hamster oocytes with high post-thaw survival rates. The same procedure can also be applied to successfully freeze and thaw mouse embryos at different stages of preimplantation development.

In this video-article we present a step-by-step demonstration on how to collect and cryopreserve hamster oocytes with high post-thaw survival rates. The same procedure can also be applied to successfully freeze and thaw mouse embryos at different stages of preimplantation development.

Recolha e criopreservação de óvulos e embriões de camundongos Hamster

Embryos and oocytes were first successfully cryopreserved more than 30 years ago, when Whittingham et al. 1 and Wilmut 2 separately described that mouse ...

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current techniques used to view such processes are somewhat limited. The following protocol describes a new technique for mounting fixed and labeled Drosophila embryos for coronal viewing with confocal imaging. This method consists of embedding embryos between two layers of glycerin jelly mounting media, and imaging jelly strips positioned upright. The first step for sandwiching the embryos is to make a thin bedding of glycerin jelly on a slide. Next, embryos are carefully aligned on this surface and covered with a second layer of jelly. After the second layer is solidified, strips of jelly are cut and flipped upright for imaging. Alternatives are described for visualizing the embryos depending upon the type of microscope stand to be used. Since all cells along the dorsal-ventral axis are imaged within a single confocal Z-plane, our method allows precise measurement and comparison of fluorescent signals without photobleaching or light scattering common to 3D reconstructions of longitudinally mounted embryos.

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Here we present a mounting protocol for stained Drosophila embryos in an upright position that allows imaging of cross-sections using Confocal microscopy.

Imagem vertical de Drosophila Os embriões

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current ...

Cryopreservation of Mouse Embryos by Ethylene Glycol-Based Vitrification

Cryopreservation of mouse embryos is a technological basis that supports biomedical sciences, because many strains of mice have been produced by genetic modifications and the number is consistently increasing year by year. Its technical development started with slow freezing methods in the 1970s1, then followed by vitrification methods developed in the late 1980s2. Generally, the latter technique is advantageous in its quickness, simplicity, and high survivability of recovered embryos. However, the cryoprotectants contained are highly toxic and may affect subsequent embryo development. Therefore, the technique was not applicable to certain strains of mice, even when the solutions are cooled to 4&deg;C to mitigate the toxic effect during embryo handling. At the RIKEN BioResource Center, more than 5000 mouse strains with different genetic backgrounds and phenotypes are maintained3, and therefore we have optimized a vitrification technique with which we can cryopreserve embryos from many different strains of mice, with the benefits of high embryo survival after vitrifying and thawing (or liquefying, more precisely) at the ambient temperature4.
Here, we present a vitrification method for mouse embryos that has been successfully used at our center. The cryopreservation solution contains ethylene glycol instead of DMSO to minimize the toxicity to embryos5. It also contains Ficoll and sucrose for prevention of devitrification and osmotic adjustment, respectively. Embryos can be handled at room temperature and transferred into liquid nitrogen within 5 min. Because the original method was optimized for plastic straws as containers, we have slightly modified the protocol for cryotubes, which are more easily accessible in laboratories and more resistant to physical damages. We also describe the procedure of thawing vitrified embryos in detail because it is a critical step for efficient recovery of live mice. These methodologies would be helpful to researchers and technicians who need preservation of mouse strains for later use in a safe and cost-effective manner.

An ethylene glycol-based vitrification method for mouse embryos is described. It is advantageous to other methods in its simplicity and low embryonic toxicity, and therefore can be broadly applicable to many strains of mice, including inbred and gene-modified mice.

Criopreservação de embriões de camundongos por Vitrificação Etileno Glicol-Based

Cryopreservation of mouse embryos is a technological basis that supports biomedical sciences, because many strains of mice have been produced by genetic ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a variety of neurodegenerative diseases, understanding microtubule based motor transport and its regulation will likely ultimately lead to improved therapeutic approaches. Kinesin-1 is a eukaryotic motor protein which moves in an anterograde (plus-end) direction along microtubules (MTs), powered by ATP hydrolysis. Here we report a detailed purification protocol to isolate active full length kinesin from Drosophila embryos, thus allowing the combination of Drosophila genetics with single-molecule biophysical studies. Starting with approximately 50 laying cups, with approximately 1000 females per cup, we carried out overnight collections. This provided approximately 10 ml of packed embryos. The embryos were bleach dechorionated (yielding approximately 9 grams of embryos), and then homogenized. After disruption, the homogenate was clarified using a low speed spin followed by a high speed centrifugation. The clarified supernatant was treated with GTP and taxol to polymerize MTs. Kinesin was immobilized on polymerized MTs by adding the ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate at room temperature. After kinesin binding, microtubules were sedimented via high speed centrifugation through a sucrose cushion. The microtubule pellet was then re-suspended, and this process was repeated. Finally, ATP was added to release the kinesin from the MTs. High speed centrifugation then spun down the MTs, leaving the kinesin in the supernatant. This kinesin was subjected to a centrifugal filtration using a 100 KD cut off filter for further purification, aliquoted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 &deg;C. SDS gel electrophoresis and western blotting was performed using the purified sample. The motor activity of purified samples before and after the final centrifugal filtration step was evaluated using an in vitro single molecule microtubule assay. The kinesin fractions before and after the centrifugal filtration showed processivity as previously reported in literature. Further experiments are underway to evaluate the interaction between kinesin and other transport related proteins.

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

This is a protocol to isolate active full length Kinesin from Drosophila embryos for single-molecule biophysical studies. We show how to collect embryos, make the embryo lysate, and then polymerize microtubules (MTs). Kinesin is purified by immobilizing it on the MTs, spinning down the Kinesin-MT complexes, and then releasing the kinesin from the MTs via ATP addition.

Isolamento e Purificação de cinesina partir Drosophila Os embriões

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&middot;Cryo Kit

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies. Many of these valuable animals exist only as live animals, with no backup plan in case of emergency. Cryopreservation of embryos can provide this backup, but is costly, can be a lengthy procedure, and generally requires a large number of animals for success. Since the discovery that mouse sperm can be successfully cryopreserved with a basic cryoprotective agent (CPA) consisting of 18&#37; raffinose and 3&#37; skim milk, sperm cryopreservation has become an acceptable and cost-effective procedure for archiving, distributing and recovery of these valuable strains.
 Here we demonstrate a newly developed I&bull;Cryo kit for mouse sperm cryopreservation. Sperm from five commonly-used strains of inbred mice were frozen using this kit and then recovered. Higher protection ratios of sperm motility (&gt; 60&#37;) and rapid progressive motility (&gt; 45&#37;) compared to the control (basic CPA) were seen for sperm frozen with this kit in 5 inbred mouse strains. Two cell stage embryo development after IVF with the recovered sperm was improved consistently in all 5 mouse strains examined. Over a 1.5 year period, 49 GM mouse lines were archived by sperm cryopreservation with the I&bull;Cryo kit and later recovered by IVF.

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&amp;middot;Cryo Kit

Here we demonstrate the newly developed I&#x2022;Cryo kit for mouse sperm cryopreservation. Two-cell stage embryo development with frozen-thawed sperm was improved consistently in 5 mouse strains with the use of this kit. Over a 1.5 year period, 49 genetically modified mouse lines were archived by sperm cryopreservation with the I&#x2022;Cryo kit and later successfully recovered by IVF.

Criopreservação do mouse Sperm and Recovery utilizando o I · Cryo Kit

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies.  Many of these ...

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes oxidation of molecules (lipid, DNA, protein) and leads to cell death. Oxidative stress also impacts the progression of several pathological conditions such as diabetes, retinopathies, neurodegeneration, and cancer. Thus, it is important to define tools to investigate oxidative stress conditions not only at the level of single cells but also in the context of whole organisms. Here, we consider the zebrafish embryo as a useful in vivo system to perform such studies and present a protocol to measure in vivo oxidative stress. Taking advantage of fluorescent ROS probes and zebrafish transgenic fluorescent lines, we develop two different methods to measure oxidative stress in vivo: i) a &#8220;whole embryo ROS-detection method&#8221; for qualitative measurement of oxidative stress and ii) a &#8220;single-cell&#160;ROS detection method&#8221; for quantitative measurements of oxidative stress. Herein, we demonstrate the efficacy of these procedures by increasing oxidative stress in tissues by oxidant agents and physiological or genetic methods. This protocol is amenable for forward genetic screens and it will help address cause-effect relationships of ROS in animal models of oxidative stress-related pathologies such as neurological disorders and cancer.

Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses.

Análise do estresse oxidativo em embriões Zebrafish

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

Ticks are important ectoparasites that can vector multiple pathogens. The salivary glands of ticks are essential for feeding as their saliva contains many effectors with pharmaceutical properties that can diminish host immune responses and enhance pathogen transmission. One group of such effectors are microRNAs (miRNAs). miRNAs are short non-coding sequences that regulate host gene expression at the tick-host interface and within the organs of the tick. These small RNAs are transported in the tick saliva via extracellular vesicles (EVs), which serve inter-and intracellular communication. Vesicles containing miRNAs have been identified in the saliva of ticks. However, little is known about the roles and profiles of the miRNAs in tick salivary vesicles and glands. Furthermore, the study of vesicles and miRNAs in tick saliva requires tedious procedures to collect tick saliva. This protocol aims to develop and validate a method for isolating miRNAs from purified extracellular vesicles produced by ex vivo organ cultures. The materials and methodology needed to extract miRNAs from extracellular vesicles and tick salivary glands are described herein.

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

The present protocol describes the isolation of microRNAs from tick salivary glands and purified extracellular vesicles. This is a universal procedure that combines commonly used reagents and supplies. The method also allows the use of a small number of ticks, resulting in quality microRNAs that can be readily sequenced.

Isolamento de microRNAs de Tick Ex Vivo Culturas de Glândulas Salivares e Vesículos Extracelulares

Ticks are important ectoparasites that can vector multiple pathogens. The salivary glands of ticks are essential for feeding as their saliva contains many ...

<meta charset="utf8"></head><body>Otimizando a criopreservação de espermatozóides de corais de espécies de corais ameaçadas

A Semi-Automated Workflow for the Cryopreservation of Coral Sperm to Support Biobanking and Aquaculture

Coral reefs are facing a crisis as the frequency of bleaching events caused by ocean warming increases, resulting in the death of corals on reefs around the world. The subsequent loss of genetic diversity and biodiversity can diminish the ability of coral to adapt to the changing climate, so efforts to preserve existing diversity are essential to maximize the resources available for reef restoration now and in the future. The most effective approach to secure genetics long-term is cryopreservation and biobanking, which permits the frozen storage of living samples at cryogenic temperatures in liquid nitrogen indefinitely. Cryopreservation of coral sperm has been possible since 2012, but the seasonal nature of coral reproduction means that biobanking activities are restricted to just a few nights per year when spawning occurs. Improving the efficiency of coral sperm processing and cryopreservation workflows is therefore essential to maximizing these limited biobanking opportunities. To this end, we set out to optimize cryopreservation processing pathways for coral sperm by building on existing technologies and creating a semi-automated approach to streamline the assessment, handling, and cryopreservation of coral sperm. The process, which combines computer-assisted sperm analysis, barcoded cryovials, and a series of linked auto-datasheets for simultaneous editing by multiple users, improves the efficiency of both sample processing and metadata management in the field. Through integration with cross-cutting research programs such as the Reef Restoration and Adaptation Program in Australia, cryopreservation can play a crucial role in large-scale reef restoration programs by facilitating the genetic management of aquaculture populations, supporting research to enhance thermal tolerance, and preventing the extinction of coral species. The described procedures will be utilized for coral cryopreservation and biobanking practitioners on reefs worldwide and will provide a model for the transition of cryopreservation technologies from research laboratories to large-scale applications.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor em destaque: Desenvolvendo tecnologias eficientes de criopreservação e biobanco para restauração global de recifes

This protocol describes a semi-automated pathway to improve the efficiency and capacity of processing and cryopreservation of sperm from threatened coral species, aiming to secure genetic diversity and support reef restoration efforts.

Um fluxo de trabalho semiautomatizado para a criopreservação de espermatozóides de coral para apoiar biobancos e aquicultura

Coral reefs are facing a crisis as the frequency of bleaching events caused by ocean warming increases, resulting in the death of corals on reefs around ...