Financiamento parcial do projeto de pesquisa USDA multi-estado W-2171 &quot;Células Germinativas e Desenvolvimento e manipulação dos embriões para a Melhoria da Pecuária&quot; é reconhecido agradecimento. Os talentos artísticos de Ryan Callahan, que preparou as ilustrações técnicas para a parte de vídeo do presente artigo, são também reconhecido agradecimento.

1. Avaliar a adequação de embriões para criopreservação 1 <ol><li> Amostras colhidas a partir do trato reprodutivo de fêmeas dadoras indivíduo deve ser colocado em um meio isotônico embrião segurando por 10 minutos antes da avaliação em um estereomicroscópio. Esteja certo de manter os embriões de cada fêmea doadora separados um do outro para permitir a identificação de paternidade de filhos de transferência de embriões. </li><li> Usando baixa ampliação (≤ 10X), as amostras de uma fêmea doadora individual deve ser segregado em grupos separados de óvulos não fertilizados consistindo, embriões degenerados, ou embriões de qualidade transferíveis. Apenas o grau de qualidade 1 ou 2 embriões na mórula compacta através de estágios de blastocisto expandido de desenvolvimento são adequados para a criopreservação, e todos os outros deve ser descartada (a não ser fêmeas receptoras síncronas estão disponíveis para a qualidade de grau 3 embriões e uma taxa de gravidez após a transferência de aproximadamente 25 -30% é considerada aceitável). </li><li> Inspecionar grau de qualidade 1 e 2 mórula compacta através de embriões em estágio de blastocisto expandido, com uma ampliação ≥ 50X para garantir que a zona pelúcida do embrião está intacta e que não há material (por exemplo, células, muco) aderir à zona pelúcida. Qualquer embrião com um rachado ou faltando zona pelúcida ou com uma zona pelúcida ter material aderente devem ser separados dos outros embriões e quer ser descartados ou tratados separadamente. </li></ol> 2. Embriões de lavar para reduzir a probabilidade de transmissão da doença 2 <ol><li> Mova zona pelúcida intacta embriões em um volume médio mínimo de embrião isotônica segurando no primeiro poço do meio de embrião de lavar roupa (por exemplo, tampão fosfato salino aumentou com antibióticos e soro albumina bovina, soro de vitelo recém-nascido, ou álcool de polivinil). Manter os embriões de cada fêmea doadora separadas, e não tentativa de lavar mais de 10 embriões de uma só vez. Mova embriões em um volume mínimo de meio para cada lavagem sucessivos para atingir uma diluição em série ≥ 1:100, e ter a certeza de usar dicas embrião estéril manipulação que são alterados entre cada lavagem sucessivos. </li><li> Mova embriões a 4 lavagens mais como descrito em 2.1. </li><li> Se a transmissão de doenças virais é de preocupação, lave embriões duas vezes em uma solução de tripsina 0,25%, para um tempo de exposição total combinado de tripsina de não mais de 90 segundos. </li><li> Após as duas lavagens de tripsina, lavar 5 vezes mais embriões em meio de embriões de lavagem como descrito em 2.1. </li><li> Após a lavagem embrião final, embriões lugar em embrião isotônica segurando médio. </li></ol> 3. Desidratação Embriões Antes de Criopreservação 3 <ol><li> Embriões devem ser transferidos em um volume mínimo de meio isotônico embrião segurando em uma solução hipertônica (1,4-1,5 concentração Molar) de um agente de crioprotetores (CPA), tais como etilenoglicol ou glicerol. </li><li> Permitir que embriões para sentar-se em meio de congelamento (solução hipertônica CPA) até atingirem o equilíbrio osmótico. Porque o etileno glicol permeia células embrionárias mais rapidamente do que o glicerol, os tempos de equilíbrio são tipicamente menos de embriões em etileno glicol (5 min) do que em glicerol (10 min). Parte deste tempo de equilíbrio pode ser alcançado durante e após os embriões são carregados em canudos (descrito na próxima etapa). </li></ol> 4. Embriões de carga em um canudo de plástico 0,25 ml para Criopreservação <ol><li> Anexar o fim tampão de algodão de um canudo de plástico 0,25 ml (11,5 cm de comprimento de trabalho) a um dispositivo de carga embrião, e aspirar aproximadamente 1,3 cm de solução hipertônica CPA em um canudo devidamente rotulados. Uma variedade de procedimentos de rotulagem existe, incluindo o uso de etiquetas impressas ligado a qualquer tomada de vedação de um canudo ou a outra palha conectado com um adaptador de palha. </li><li> Remover a palha da solução CPA, e aspirar aproximadamente 0,15 cm de ar para criar uma bolha de ar minúsculas dentro do canudo. </li><li> Aspirar um único embrião em aproximadamente 0,8 centímetros de solução hipertônica CPA na palha. </li><li> Remover a palha da solução CPA e aspirado de aproximadamente 0,15 cm de ar para criar uma bolha de ar segunda minúscula dentro da palha (bolhas de ar servem para isolar fisicamente o embrião dentro da palha). </li><li> Aspirar cerca de 9,1 centímetros de solução CPA para encher completamente a palha, sendo certo para atrair um volume suficiente de solução CPA para umedecer o policloreto de vinila (PVC) em pó que existe dentro da end tampão de algodão da palha. A solução faz com que o CPA pó de PVC para gel e selar essa extremidade da palha. </li><li> Selar o outro lado da palha com PVC em pó, tampões de fecho de plástico de palha, ou um aferidor de calor. </li></ol> 5. Colocação de Embriões em uma máquina de congelação controlada Taxa de Embrião <ol><li> Por banho de metanol ou nitrogênio líquido máquinas de congelamento de vapor pode ser programado para criopreservação de embriões pré-implantação. </li><li> Carregar os canudos que contém o Embry<html> OS em uma máquina de congelação cuja temperatura foi resfriado da temperatura ambiente até -6 ° C. Palhas de carga final algodão plug-up (a menos que plugs canudo de plástico de vedação ou placas de palha estão sendo usados, caso em que end tampão de algodão é colocado para baixo). </li><li> Permitir que embriões para sentar-se a esta temperatura durante pelo menos 2 minutos antes de prosseguir. </li></ol> 6. Semeadura <ol><li> Uma vez que os embriões têm arrefecido a -6 ° C, use um par de pinças supercooled em nitrogênio líquido (ou uma vara com ponta de algodão mergulhada em nitrogênio líquido) para induzir a formação de cristais de gelo na solução CPA dentro da palha, tocando as tenazes (ou algodão vara com ponta) para a coluna de solução acima ou abaixo do embrião. </li><li> A água na solução CPA irá se cristalizar na região expostos ao nitrogênio líquido e cristais de gelo vai se espalhar para a coluna de solução CPA imediatamente em torno do embrião. </li><li> Manter os embriões em semeadura temperatura por 10 minutos antes de arrefecimento adicional. </li></ol> 7. A desidratação contínua de Embriões <ol><li> Embriões frescos a uma taxa de 0,5 ° C / min até uma temperatura de -34 ° C. Esta taxa de resfriamento é importante para garantir a desidratação contínua do embrião. </li><li> Manter os embriões em -34 ° C por 10 minutos antes de mergulhar embriões em nitrogênio líquido (-196 ° C). </li><li> Lugar embriões criopreservados em uma taça devidamente rotulados (preenchido com nitrogênio líquido) anexado a um cana devidamente rotulados, e coloque a cana em uma vasilha de um líquido de nitrogênio dewar para armazenamento de curto ou longo prazo. </li></ol> 8. Descongelar embriões criopreservados <ol><li> Puxe a caixinha no pescoço do nitrogênio líquido dewar, garantindo que o recipiente permanece abaixo da linha de geada na dewar. </li><li> Localize a cana que contém o embrião para ser descongeladas, e rapidamente e retire com cuidado a palha do cálice, sendo certo não aquecer demais palhas na taça. </li><li> Segure o canudo no ar por 3-5 segundos (para reduzir a incidência de um rachado zona pelúcida 4), ​​e depois submerge em um banho de água 37 ° C por mais 25-30 segundos. </li><li> Remover a palha do banho de água, limpe a palha (tomando cuidado para não sujar a identificação do embrião na palha), use um dispositivo de corte para a palha cortarei a continuação macho não de algodão da palha (se o calor usando seladas ou PVC em pó ), ou remova cuidadosamente o bujão de plástico, e: <ol type="a"><li> carregar a palha em um dispositivo de transferência de embriões e transferência o mais rápido possível a um destinatário embrião síncrona (mas só se o embrião foi criopreservado utilizando o etilenoglicol como o CPA), ou </li><li> segurar a extremidade aberta da palha sobre um prato contendo uma concentração de 1,0 Molar de sacarose (um composto não-permeando), e usar uma tesoura para cortar o fim tampão de algodão da palha. Conteúdo da palha deve fluir livremente na solução de sacarose, mas empurrando uma pequena coluna de ar através da palha pode ser necessária se qualquer meio residual existe dentro da palha. Permitir que embriões de permanecer em solução de sacarose por 10 minutos, e depois transferir embriões em embrião isotônica segurando médio por 10 minutos. Avaliar embriões pós-descongelamento, a carga em um canudo novo, e transferência para fêmeas receptor adequado. </li></ol></li></ol> 9. Resultados representativos: Uma variedade de fatores pode influenciar a gravidez e viver as taxas de natalidade resultantes da transferência de embriões congelados e descongelados de pré-implantação para fêmeas receptoras síncronas 5. Embriões em estágios de desenvolvimento menos avançados do que mórula compacta ou mais avançada do que blastocisto expandido, muitas vezes não sobrevivem ao processo de criopreservação de embriões, bem como na mórula compacta, blastocisto inicial, blastocisto e blastocisto expandido estágios do desenvolvimento embrionário. Embriões de grau de qualidade 1 e 2 maior rendimento de taxas pós-descongelamento a gravidez do que a qualidade de grau 3 embriões (que normalmente não são criopreservados devido às baixas taxas pós-descongelamento gravidez). Embriões mishandled durante o congelamento de embriões ou embrião descongelamento procedimentos são propensos a apresentar taxas de gravidez reduzida. Embriões transferidos para fêmeas receptoras cujos ciclos estrais não estão sincronizadas com a da fêmea doadora normalmente produzem taxas menores de gravidez. Embriões produzidos in vitro ou manipulados de alguma maneira (por exemplo, biópsia ou dividido) costumam gerar taxas menores de gravidez. Sob condições ótimas, as taxas de gravidez obtidas após a transferência de congelados e descongelados in vivo de embriões derivados é tipicamente 60-70% em bovinos 6,7, 65-75% em ovinos 8,9,10,11, e 60-70% em cabras 12,13,14,15. Da mesma forma, as taxas de gravidez obtidas após a transferência de congelados e descongelados em embriões produzidos in vitro é tipicamente 40-50% em bovinos 6,16, 25-35% em ovinos 17, e 30-40% em cabras 18. ble 1 &quot;/&gt; Tabela 1. Esperado taxas de gravidez após a transferência de embriões congelados e descongelados de espécies de animais domésticos ruminantes para fêmeas receptoras síncronas.

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Não há conflitos de interesse declarados.

Porque os embriões é predominantemente constituído por água, é crucial que os embriões pré-implantação ser adequadamente desidratadas e lentamente resfriado, de acordo com o protocolo descrito aqui para evitar a formação de cristais de gelo intracelular. Uma vez que o processo de resfriamento começou, é importante para manter a mudança de temperatura e unidirecional para evitar flutuações de temperatura. Início da formação de cristais de gelo (&quot;semeadura&quot;) a uma temperatura adequada para a solução CPA específicos é fundamental. Modificações a este resfriamento lento / Método de descongelamento rápido para criopreservação de embriões pré-implantação incluir o método de uma etapa (onde a última coluna do meio carregado na palha é a sacarose, em vez de solução CPA) 19 eo método de transferência direta (onde os embriões congelados em etileno glicol são descongelados e transferidos diretamente para o útero de uma fêmea destinatário sem antes remover o etileno glicol a partir do embrião) 20. Para reduzir o volume de etileno glicol depositados no útero de uma transferência direta (DT) do sexo feminino destinatário, é aconselhável para preencher a palha de 0,25 ml com 6 cm segurando médio antes de continuar como descrito anteriormente. Note-se que existe um padrão voluntário no setor comercial de transferência de embrião pré-implantação de embriões criopreservados que para DT devem ser congeladas em amarelo cor de palha e armazenados em amarelo cor de taças no nitrogênio líquido dewar. O setor comercial também tem exigências específicas de rotulagem para todos os embriões criopreservados que devem ser seguidas. Uma alternativa para esse método é vitrificação 21, um método de não equilíbrio de criopreservação onde uma mais concentrada (6-8 M) solução CPA é resfriado ultra-rapidamente causando a solução CPA para mudar do estado líquido para um estado &quot;vidrados&quot; sem gelo cristal formação. Vitrificação é provável mais adequado para a criopreservação de embriões que são menos avançados do que developmentally mórula compacta devido à sua sensibilidade à temperatura aumentada. Esta técnica tem aplicação para a preservação de germoplasma de recursos exclusivos 22, bem como para a indústria de transferência de embrião comerciais internacionais, onde mais de 55% dos cerca de 500.000 embriões pré-implantação bovina transferidos no ano civil de 2008 foram criopreservados. 23

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários (opcional) </th></tr><tr><td> BioLife médio congelar </td><td> Agtech, Inc. </td><td> C18, C18A </td><td> 1,5 M de etileno glicol </td></tr><tr><td> Emcare etileno glicol solução congelar </td><td> ICPBio Reprodução </td><td> IC8, IC10 </td><td> 1,5 M de etileno glicol </td></tr><tr><td> ViGro congelamento de etilenoglicol mais </td><td> Bioniche Saúde Animal </td><td> EVM835 </td><td> 1,5 M de etileno glicol </td></tr><tr><td> Emcare solução congelar 10% de glicerol </td><td> ICPBio Reprodução </td><td> IC12 </td><td> 1,34 M de glicerol </td></tr><tr><td> Emcare um degelo sacarose M </td><td> ICPBio Reprodução </td><td> IC16 </td><td> 1,0 M de sacarose </td></tr><tr><td> ViGro descongelar um passo </td><td> Bioniche Saúde Animal </td><td> EVM247, EVM847 </td><td> 1,0 M de sacarose </td></tr><tr><td> Descongelar ViGro 1-2-3 mais </td><td> Bioniche Saúde Animal </td><td> EVM248, EVM848 </td><td> 5%, 2,5%, 0% de glicerol com 0,5, 0,5, 0,6% de sacarose </td></tr><tr><td> Emcare CSU descongelamento kit </td><td> ICPBio Reprodução </td><td> IC20 </td><td> 6%, 3%, 0% de glicerol com sacarose 10,3% </td></tr><tr><td> BioLife exploração e meio de transferência </td><td> Agtech, Inc. </td><td> C15, C15A </td><td> modificada PBS com BSA 0,4% (albumina bovina) </td></tr><tr><td> Emcare solução segurando </td><td> ICPBio Reprodução </td><td> IC2, IC4, IC6 </td><td> 0,4% BSA (albumina bovina), tampão MOPS (zwitterions inerte) </td></tr><tr><td> ViGro segurando mais </td><td> Bioniche Saúde Animal </td><td> EVM024, EVM824 </td><td></td></tr><tr><td> SYNGRO Segurando médio </td><td> Bioniche Saúde Animal </td><td> ESM024, ESM224, ESM828 </td><td> contém ácido hialurônico, sem produtos de origem animal </td></tr><tr><td> BioLife modificada D-PBS </td><td> Agtech, Inc. </td><td> C06 </td><td> fosfato modificado Dulbecco solução salina tamponada </td></tr><tr><td> BioLife Fração BSA V </td><td> Agtech, Inc. </td><td> B09 </td><td> liofilizado albumina sérica bovina, fração V </td></tr><tr><td> BioLife antibiótico antimicótico </td><td> Agtech, Inc. </td><td> B01 </td><td> anfotericina-B, penicilina G, sulfato de estreptomicina </td></tr><tr><td> BioLife tripsina kit </td><td> Agtech, Inc. </td><td> C22A </td><td> 25 g liofilizada tripsina, água estéril, estéril D-PBS </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><th> Nome do equipamento </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários (opcional) </th></tr><tr><td> Biol-Cool freezer taxa controlada </td><td> STF Sistemas </td><td> BC-IV -40 </td><td> Freezer banho de metanol </td></tr><tr><td> Controle de congelamento freezer taxa controlada </td><td> Cryologic </td><td> CL2200 </td><td> Freezer de nitrogênio líquido </td></tr></tbody></table>

cryopreservation of preimplantation embryos of cattle, sheep, and goats

Pré-implantação de embriões de bovinos, ovinos e caprinos podem ser criopreservados para armazenamento de curto ou longo prazo. Embriões pré-implantação é predominantemente constituído por água, e evitar a formação intracelular de cristais de gelo durante o processo de criopreservação é de suma importância para manter a viabilidade do embrião. Embriões são colocados em uma solução hipertônica (1,4-1,5 M) de um agente de crioprotetores (CPA), tais como etileno glicol (EG) ou glicerol (Glyc) para criar um gradiente osmótico que facilita a desidratação celular. Após atingir o equilíbrio osmótico de embriões na solução CPA, são individualmente carregados na solução hipertônica CPA em 0,25 ml canudos de plástico para congelar. Embriões são colocados em um freezer taxa controlada a uma temperatura de -6 ° C. Formação de cristais de gelo é induzida na solução CPA em torno do embrião, e cristalização provoca um aumento na concentração de CPA fora do embrião, causando desidratação celular ainda mais. Embriões são resfriados a uma taxa de 0,5 ° C / min, permitindo uma maior desidratação, a uma temperatura de -34 ° C antes de ser mergulhado em nitrogênio líquido (-196 ° C). Embriões criopreservados devem ser descongelados antes da transferência para um destinatário (substituto) do sexo feminino. Palhas contendo os embriões são removidos do nitrogênio líquido dewar, realizado em ar ambiente de temperatura de 3 a 5 seg, e colocados em banho-maria a 37 ° C por 25 a 30 seg. Embriões criopreservados em Glyc são colocados em uma solução de sacarose 1 M por 10 min para a remoção do CPA antes da transferência para um destinatário (substituto) do sexo feminino. Embriões criopreservados em EG, no entanto, podem ser diretamente transferidos para o útero de um destinatário.

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Cryopreservation of Preimplantation Embryos of Cattle, Sheep, and Goats

Embriões pré-implantação pode ser criopreservados após a colocação em uma solução hipertônica crioprotectores para causar desidratação celular. Após atingir o equilíbrio, a formação de cristais de gelo é induzida na solução em torno do embrião. Maior desidratação ocorre quando o embrião é lentamente resfriado a temperaturas abaixo de zero antes de mergulhar em nitrogênio líquido para o armazenamento.

Criopreservação de embriões pré-implantatório de bovinos, ovinos e caprinos

Preimplantation embryos from cattle, sheep, and goats may be cryopreserved for short- or long-term storage.  Preimplantation embryos consist predominantly ...

cryopreservation-of-preimplantation-embryos-of-cattle-sheep-and-goats

Research

JoVE Journal

Biology

30.6K visualizações.  Iowa State University. Embriões pré-implantação pode ser criopreservados após a colocação em uma solução hipertônica crioprotectores para causar desidratação celular. Após atingir o equilíbrio, a formação de cristais de gelo é induzida na solução em torno do embrião. Maior desidratação ocorre quando o embrião é lentamente resfriado a temperaturas abaixo de zero antes de mergulhar em nitrogênio líquido para o armazenamento.

Vídeo: Cryopreservation of Preimplantation Embryos of Cattle, Sheep, and Goats

Dissection of 6.5 dpc Mouse Embryos

Analysis of gene expression patterns during early stages of mammalian embryonic development can provide important clues about gene function, cell-cell interaction and signaling mechanisms that guide embryonic patterning. However, dissection of the mouse embryo from the decidua shortly after implantation can be a challenging procedure, and detailed step-by-step documentation of this process is lacking.

Here we demonstrate how post-implantation (6.5 dpc) embryos are isolated by first dissecting the uterus of a pregnant mouse (detection of the vaginal plug was designated day 0.5 poist coitum) and subsequently dissecting the embryo from maternal decidua. The dissection of Reichert's membrane is described as well as the removal of the ectoplacental cone.

Isolation of postimplantation-stage embryos allows one to study gene patterning and analyze cell-lineage decision making processes during embryonic development, but proper dissection of the early embryo can be challenging. This protocol describes a method for isolating early primitive-streak-stage embryos (~6.5 days post coitum [dpc]).

Dissecção de 6,5 embriões de camundongos dpc

Analysis of gene expression patterns during early stages of mammalian embryonic development can provide important clues about gene function, cell-cell ...

Biologia

Plastic Embedding and Sectioning of Xenopus laevis Embryos

Plastic sections maintain true tissue morphology in thin sections of tissue that can be immunostained with fluorescent secondary antibodies, making this method more useful than paraffin-embedded or frozen sections for many types of tissue. The method for staining, plastic embedding, and sectioning is demonstrated in this video.

Incorporação de plástico e secção de embriões Xenopus laevis

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos and their dechorionation using bleach are demonstrated. Using a glass pipet attached to a mouth suction tube, we illustrate the removal of all cells from single embryos. The method for dispersing cells from each embyro into a small (5 l) drop of medium on an uncoated glass coverslip is demonstrated. A view through the microscope at 1 hour after plating illustrates the preferred cell density. Most of the cells that survive when grown in defined medium are neuroblasts that divide one or more times in culture before extending neuritic processes by 12-24 hours. A view through the microscope illustrates the level of neurite outgrowth and branching expected in a healthy culture at 2 days in vitro. The cultures are grown in a simple bicarbonate based defined medium, in a 5% CO2 incubator at 22-24&deg;C. Neuritic processes continue to elaborate over the first week in culture and when they make contact with neurites from neighboring cells they often form functional synaptic connections. Neurons in these cultures express voltage-gated sodium, calcium, and potassium channels and are electrically excitable. This culture system is useful for studying molecular genetic and environmental factors that regulate neuronal differentiation, excitability, and synapse formation/function.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. Views of live cultures show cells 1 hour after plating and differentiated neurons after 2 days of growth in a bicarbonate-based defined medium. The neurons are electrically excitable and form synaptic connections.

Preparação de culturas de neurônios a partir de embriões Midgastrula Stage Drosophila

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

Monte Whole dupla hibridização in situ de embriões de galinha precoce

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

Microinjeção de mRNA e Oligonucleotídeos Anti-Senso Morpholino em embriões Zebrafish.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Collection and Cryopreservation of Hamster Oocytes and Mouse Embryos

Embryos and oocytes were first successfully cryopreserved more than 30 years ago, when Whittingham et al. 1 and Wilmut 2 separately described that mouse embryos could be frozen and stored at -196 &deg;C and, a few years later, Parkening et al. 3 reported the birth of live offspring resulting from in vitro fertilization (IVF) of cryopreserved oocytes. Since then, the use of cryopreservation techniques has rapidly spread to become an essential component in the practice of human and animal assisted reproduction and in the conservation of animal genetic resources. Currently, there are two main methods used to cryopreserve oocytes and embryos: slow freezing and vitrification. A wide variety of approaches have been used to try to improve both techniques and millions of animals and thousands of children have been born from cryopreserved embryos. However, important shortcomings associated to cryopreservation still have to be overcome, since ice-crystal formation, solution effects and osmotic shock seem to cause several cryoinjuries in post-thawed oocytes and embryos. Slow freezing with programmable freezers has the advantage of using low concentrations of cryoprotectants, which are usually associated with chemical toxicity and osmotic shock, but their ability to avoid ice-crystal formation at low concentrations is limited. Slow freezing also induces supercooling effects that must be avoided using manual or automatic seeding 4. In the vitrification process, high concentrations of cryoprotectants inhibit the formation of ice-crystals and lead to the formation of a glasslike vitrified state in which water is solidified, but not expanded. However, due to the toxicity of cyroprotectants at the concentrations used, oocytes/embryos can only be exposed to the cryoprotectant solution for a very short period of time and in a minimum volume solution, before submerging the samples directly in liquid nitrogen 5. In the last decade, vitrification has become more popular because it is a very quick method in which no expensive equipment (programmable freezer) is required. However, slow freezing continues to be the most widely used method for oocyte/embryo cryopreservation. In this video-article we show, step-by-step, how to collect and slowly freeze hamster oocytes with high post-thaw survival rates. The same procedure can also be applied to successfully freeze and thaw mouse embryos at different stages of preimplantation development.

In this video-article we present a step-by-step demonstration on how to collect and cryopreserve hamster oocytes with high post-thaw survival rates. The same procedure can also be applied to successfully freeze and thaw mouse embryos at different stages of preimplantation development.

Recolha e criopreservação de óvulos e embriões de camundongos Hamster

Embryos and oocytes were first successfully cryopreserved more than 30 years ago, when Whittingham et al. 1 and Wilmut 2 separately described that mouse ...

Dechorionation of Medaka Embryos and Cell Transplantation for the Generation of Chimeras

Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the three vertebrate model organisms in which genome-wide phenotype-driven mutant screens were carried out 1. Divergence of functional overlap of related genes between medaka and zebrafish allows identification of novel phenotypes that are unidentifiable in a single species 2, thus medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of the vertebrate genome functions. Manipulation of medaka embryos, such as dechorionation, mounting embryos for imaging and cell transplantation, are key procedures to work on both medaka and zebrafish in a laboratory. Cell transplantation examines cell autonomy of medaka mutations. Chimeras are generated by transplanting labeled cells from donor embryos into unlabeled recipient embryos. Donor cells can be transplanted to specific areas of the recipient embryos based on the fate maps 3 so that clones from transplanted cells can be integrated in the tissue of interest during development. Due to the hard chorion and soft embryos, manipulation of medaka embryos is more involved than in zebrafish. In this video, we show detailed procedures to manipulate medaka embryos.

Due to the hard chorion and soft embryos, manipulation of medaka embryos is more involved than in zebrafish. This video shows step-by-step procedures for how to manipulate medaka embryos, including dechorionation, mounting in agarose for imaging and cell transplantation for the production of chimeras. These procedures are essential to use medaka and zebrafish in a laboratory to take full advantage of their complementary features for the genetic dissection of vertebrate genome functions.

Dechorionation de Embriões Medaka e Transplante de Células de Geração de Quimeras

Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the three vertebrate model organisms in ...

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current techniques used to view such processes are somewhat limited. The following protocol describes a new technique for mounting fixed and labeled Drosophila embryos for coronal viewing with confocal imaging. This method consists of embedding embryos between two layers of glycerin jelly mounting media, and imaging jelly strips positioned upright. The first step for sandwiching the embryos is to make a thin bedding of glycerin jelly on a slide. Next, embryos are carefully aligned on this surface and covered with a second layer of jelly. After the second layer is solidified, strips of jelly are cut and flipped upright for imaging. Alternatives are described for visualizing the embryos depending upon the type of microscope stand to be used. Since all cells along the dorsal-ventral axis are imaged within a single confocal Z-plane, our method allows precise measurement and comparison of fluorescent signals without photobleaching or light scattering common to 3D reconstructions of longitudinally mounted embryos.

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Here we present a mounting protocol for stained Drosophila embryos in an upright position that allows imaging of cross-sections using Confocal microscopy.

Imagem vertical de Drosophila Os embriões

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current ...

Cryopreservation of Mouse Embryos by Ethylene Glycol-Based Vitrification

Cryopreservation of mouse embryos is a technological basis that supports biomedical sciences, because many strains of mice have been produced by genetic modifications and the number is consistently increasing year by year. Its technical development started with slow freezing methods in the 1970s1, then followed by vitrification methods developed in the late 1980s2. Generally, the latter technique is advantageous in its quickness, simplicity, and high survivability of recovered embryos. However, the cryoprotectants contained are highly toxic and may affect subsequent embryo development. Therefore, the technique was not applicable to certain strains of mice, even when the solutions are cooled to 4&deg;C to mitigate the toxic effect during embryo handling. At the RIKEN BioResource Center, more than 5000 mouse strains with different genetic backgrounds and phenotypes are maintained3, and therefore we have optimized a vitrification technique with which we can cryopreserve embryos from many different strains of mice, with the benefits of high embryo survival after vitrifying and thawing (or liquefying, more precisely) at the ambient temperature4.
Here, we present a vitrification method for mouse embryos that has been successfully used at our center. The cryopreservation solution contains ethylene glycol instead of DMSO to minimize the toxicity to embryos5. It also contains Ficoll and sucrose for prevention of devitrification and osmotic adjustment, respectively. Embryos can be handled at room temperature and transferred into liquid nitrogen within 5 min. Because the original method was optimized for plastic straws as containers, we have slightly modified the protocol for cryotubes, which are more easily accessible in laboratories and more resistant to physical damages. We also describe the procedure of thawing vitrified embryos in detail because it is a critical step for efficient recovery of live mice. These methodologies would be helpful to researchers and technicians who need preservation of mouse strains for later use in a safe and cost-effective manner.

An ethylene glycol-based vitrification method for mouse embryos is described. It is advantageous to other methods in its simplicity and low embryonic toxicity, and therefore can be broadly applicable to many strains of mice, including inbred and gene-modified mice.

Criopreservação de embriões de camundongos por Vitrificação Etileno Glicol-Based

Cryopreservation of mouse embryos is a technological basis that supports biomedical sciences, because many strains of mice have been produced by genetic ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a variety of neurodegenerative diseases, understanding microtubule based motor transport and its regulation will likely ultimately lead to improved therapeutic approaches. Kinesin-1 is a eukaryotic motor protein which moves in an anterograde (plus-end) direction along microtubules (MTs), powered by ATP hydrolysis. Here we report a detailed purification protocol to isolate active full length kinesin from Drosophila embryos, thus allowing the combination of Drosophila genetics with single-molecule biophysical studies. Starting with approximately 50 laying cups, with approximately 1000 females per cup, we carried out overnight collections. This provided approximately 10 ml of packed embryos. The embryos were bleach dechorionated (yielding approximately 9 grams of embryos), and then homogenized. After disruption, the homogenate was clarified using a low speed spin followed by a high speed centrifugation. The clarified supernatant was treated with GTP and taxol to polymerize MTs. Kinesin was immobilized on polymerized MTs by adding the ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate at room temperature. After kinesin binding, microtubules were sedimented via high speed centrifugation through a sucrose cushion. The microtubule pellet was then re-suspended, and this process was repeated. Finally, ATP was added to release the kinesin from the MTs. High speed centrifugation then spun down the MTs, leaving the kinesin in the supernatant. This kinesin was subjected to a centrifugal filtration using a 100 KD cut off filter for further purification, aliquoted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 &deg;C. SDS gel electrophoresis and western blotting was performed using the purified sample. The motor activity of purified samples before and after the final centrifugal filtration step was evaluated using an in vitro single molecule microtubule assay. The kinesin fractions before and after the centrifugal filtration showed processivity as previously reported in literature. Further experiments are underway to evaluate the interaction between kinesin and other transport related proteins.

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

This is a protocol to isolate active full length Kinesin from Drosophila embryos for single-molecule biophysical studies. We show how to collect embryos, make the embryo lysate, and then polymerize microtubules (MTs). Kinesin is purified by immobilizing it on the MTs, spinning down the Kinesin-MT complexes, and then releasing the kinesin from the MTs via ATP addition.

Isolamento e Purificação de cinesina partir Drosophila Os embriões

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...