Este estudo foi realizado em cooperação com o Projeto Bioresource Nacional, o Ministério da Educação, Cultura, Desporto, Ciência e Tecnologia, do Japão.

O esquema geral do experimento é mostrado na figura. 1. 1. Preparação do Reagente <ol><li> Tornar o meio de base (aqui no conhecido como PB1), em uma garrafa de vidro de 100 ml de acordo com o gráfico abaixo: <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> MW </td><td> mM </td><td> mg/100ml </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 58,4 </td><td> 136,98 </td><td> 800,0 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 74,6 </td><td> 2,68 </td><td> 20,0 </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> 136,1 </td><td> 1,47 </td><td> 20,0 </td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 0,12 H 2 O </td><td> 358,14 </td><td> 8,04 </td><td> 288,1 </td></tr><tr><td> MgCl 2, 6H 2 O </td><td> 203,3 </td><td> 0,49 </td><td> 10,0 </td></tr><tr><td&gt; Glucose </td><td> 180,2 </td><td> 5,56 </td><td> 100,0 </td></tr><tr><td> Na piruvato </td><td> 110 </td><td> 0,33 </td><td> 3,6 </td></tr><tr><td> CaCl 2, 2H 2 O </td><td> 147 </td><td> 0,9 </td><td> 13,2 </td></tr><tr><td> Penicilina G </td><td></td><td></td><td> 6.0 (aprox) </td></tr></tbody></table></li><li> Fazer o Ficoll-solução de sacarose (FS): <ol><li> Adicionar os seguintes produtos químicos a 14 ml de solução PB1 em um tubo de 50 ml. <table border="1"><tbody><tr><td> Ficoll 70 </td><td> 6,0 g </td></tr><tr><td> Sacarose </td><td> 3,424 g </td></tr><tr><td> BSA </td><td> 42,0 mg </td></tr></tbody></table></li><li> Mix Ficoll 70 e sacarose em PB1 solução e agitar bem até dissolver completamente. </li><li> Depois de verificar a completa dissolução acima, adicione BSA na superfície da solução e mantê-la4oC até BSA esteja completamente dissolvido (&gt; 4 horas ou durante a noite). </li></ol></li><li> Fazer a solução de equilíbrio (EFS20) ea solução de vitrificação (EFS40) em um tubo de 50 ml: <ul><li> EFS20: 20% (v / v) etilenoglicol, 24% (w / v) Ficoll, sacarose e 0,4 mol / L em PB1 com BSA </li><li> EFS40: 40% (v / v) etilenoglicol, 18% (w / v) Ficoll, e 0,3 mol / L de sacarose * em PB1 com BSA * Para embriões da linhagem BALB / c ou ICR, aumentar a concentração de sacarose a 0,9 sacarose mol / L, pois são mais sensíveis a cryodamage 6. </li></ul><table border="1"><tbody><tr><td></td><td> EFS20 solução </td><td> EFS40 solução </td></tr><tr><td> Etilenoglicol </td><td> 1 ml </td><td> 2 ml </td></tr><tr><td> Solução de FS </td><td> 4 ml </td><td> 3 ml </td></tr></tbody></table></li><li> Esterilizar a solução por filtração usando um filte 0,45 mMr. Faça alíquotas em 5 tubos de poliestireno ml e armazenar a 4 ° C. Eles podem ser usados ​​por cerca de 6 meses. </li><li> Preparação da solução embrião descongelamento contendo sacarose 0,75 M (TS1) <ol><li> Dissolver 7,7 g de sacarose na PB1 (preparada no passo 1.1) e trazer o volume total de 30 ml. Misturar por agitação suave até sacarose esteja completamente dissolvido. </li><li> Adicionar 90 mg de BSA sobre a superfície da solução e deixá-lo ficar até que esteja completamente dissolvido. </li><li> Esterilizar a solução por filtração. </li><li> Alíquotas e armazenar a 4 ° C. Eles podem ser usados ​​por cerca de 1 mês. </li></ol> Nota: TS1 também podem ser preparados a partir de M2 ​​disponível comercialmente. <ol start="6"><li> Dissolver 7,7 g de sacarose em M2 e trazer o volume total de 30 ml. </li><li> Misturar por agitação suave até sacarose esteja completamente dissolvido. </li><li> Esterilizar a solução por filtração. </li><li> Alíquotas e armazenar a 4oC. Eles podem ser usados ​​por cerca de 1 mês. </li></ol></li><li> Solução TS2 (descongelamentocontendo sacarose 0,25 M): <ol><li> Diluir 10 ml TS1 com 20 ml de PB1 ou M2, conforme o caso. </li><li> Alíquotas e armazenar a 4 ° C. Eles podem ser usados ​​por cerca de 1 mês. </li></ol></li></ol> 2. Vitrificação de embriões de 2 células de rato <ol><li> Prepare duas células de embriões de rato por monta natural ou convencional em técnicas de fertilização in vitro. </li><li> Alíquota de 50 mL em um EFS40 cryotube. Seguir, executar o resto do processo de vitrificação na temperatura ambiente. </li><li> Alíquota de 50 mL de EFS20 no fundo de um de 35 mm ou 60 mm placa de Petri de plástico. </li><li> Transferir até 30 embriões para EFS20 usando um capilar de vidro com apenas a quantidade mínima de meio de cultura. Iniciar um temporizador para 2 min. Nota: os embriões Coloque no fundo da gota. Isso faz com que a desidratação eficiente de embriões. Verificar a morfologia dos embriões por um estereomicroscópio. Embriões desidratados mostram uma morfologia encolhido, como mostrado na figura. 2A.Se eles não são desidratadas o suficiente, espere por mais 1 ou 2 min. </li><li> Em torno de 1,5 min, pegar os embriões a partir da queda EFS20 com apenas a quantidade mínima de solução. Transferi-los para EFS40 na cryotube preparada em 2.1 passo. Nota: Para obter melhores resultados, ajustar o tempo de pegar os embriões, para que todos os embriões podem ser transferidos para EFS40 em torno de 2 min. </li><li> Espere por 1 min. </li><li> Coloque o cryotube diretamente em nitrogênio líquido (LN 2). </li></ol> 3. Descongelar embriões vitrificados duas células-Mouse <ol><li> Antes de descongelar, preparar um prato com 10 gotas mL de meio de cultura de embriões de embriões recuperados (veja o passo 3.13). Cubra o prato com azeite e coloque em uma incubadora de CO 2 até o uso. Nota: Apesar de todos os meios de cultura de embriões de rotina podem ser utilizadas neste experimento, recomendamos mídia com maior osmolaridade, como meio de M16. </li><li> TS1 quente a 37 ° C. </li><li> Coloque em uma máscara facial e cryogloves. Abra a LN 2 tank e recuperar um cryotube contendo embriões. </li><li> Abrir rapidamente o topo do tubo e descartar LN 2. Aguarde 30 segundos para evitar o congelamento a partir de TS1 o próximo passo. </li><li> Use uma pipeta 1000ul para adicionar 850 mL de TS1 (37 ° C) dentro do tubo e misture a solução pipettings suave (cerca de dez vezes em 25 segundos) até que a solução está uniformemente dissolvido. </li><li> Transferência de todo o volume do tubo a uma 60 milímetros de plástico placa de Petri (ou vidro de relógio) (Fig. 3A). Nota: Os embriões devem ser manipulados em temperatura ambiente (22-25 ° C) até que eles são colocados em uma incubadora de CO 2 na Etapa 3.14. </li><li> Iniciar um temporizador para 3 min. </li><li> Em torno de 2 min no TS1, agite levemente o prato até o meio contendo embriões é espalhado sobre a superfície do prato (Fig. 3B). Nota: Isto ajudará os embriões descem até o fundo, porque eles estão flutuando perto da superfície quando transferido para TS1. </li><li> Coloque três gotas de 50 mL de TS2 em diae prato (Fig. 3C). </li><li> Depois de 3 min em TS1, verificar a morfologia de embriões por um estereomicroscópio, que devem ser ligeiramente encolhido. Veja a morfologia de embriões em anteriores (Fig. 2B) e posterior (Fig. 2C) no TS1. Nota: Se os embriões ainda estão inchadas, mantê-los em TS1 por mais 1-3 min. </li><li> Pegar os embriões e transferi-los para a primeira gota de TS2 (Fig. 3D). Iniciar um temporizador para 3 min </li><li> Depois de 3 min, transferência de embriões para a segunda gota e depois para a terceira queda (Fig. 3E). </li><li> Transferência dos embriões para o meio de cultura preparado no Passo 3.1. Os embriões são na forma mostrada na figura. 2D. </li><li> Coloque em um prato de CO 2 incubadora. Cerca de 10 min mais tarde, a transferência de embriões para a próxima gota de meio de cultura para lavar sacarose que foi transitado do TS2. </li><li> Continue cultura em uma incubadora de CO2 até a transferência de embrião. Nota: Embry TransferênciaOS para o oviduto de receptoras no dia da descongelação. Cultura in vitro tempo pode diminuir a viabilidade de embriões em algumas linhagens de camundongos. </li></ol> 4. Resultados representativos: In vitro - e in vivo de embriões desenvolvimento após o descongelamento é apresentado nas Tabelas 1 e 2. As vantagens deste protocolo são a alta capacidade de sobrevivência dos embriões após o descongelamento e sua ampla aplicabilidade para diferentes linhagens de camundongos. <table border="1"><tbody><tr><td> Tensão </td><td> No. total de tubos </td><td> N º de embriões vitrificados </td><td> Recuperado (No. (%)) </td><td> Morfologicamente normais (N º (%)) </td><td> Desenvolvimento de blastocistos (n º (%)) </td></tr><tr><td> C57BL/6J </td><td> 20 </td><td> 400 </td><td> 397 (99) </td><td> 394 (99) </td><td> 342 (87) </td></tr><tr><td> BALB / ca </td><td> 15 </td><td> 300 </td><td> 296 (99) </td><td> 282 (95) </td><td> 238 (84) </td></tr><tr><td> ICR </td><td> 24 </td><td> 480 </td><td> 474 (99) </td><td> 443 (93) </td><td> 398 (90) </td></tr></tbody></table> Tabela 1. In vitro-desenvolvimento de embriões vitrificados e descongelados em linhagens de camundongos comuns <table border="1"><tbody><tr><td> Condição de embriões </td><td> N º de beneficiários do sexo feminino </td><td> N º de embriões transferidos </td><td> Locais de implantação (No. (%)) </td><td> Vivem descendentes (No. (%)) </td></tr><tr><td> Fresco </td><td> 12 </td><td> 180 </td><td> 141 (78.3) </td><td> 110 (61.1) </td></tr><tr><td> Vitrificados </td><td> 16 </td><td> 242 </td><td> 202 (83.5) </td><td> 125 (51.7) </td></tr></tbody></table> Tabela 2. In vivo desenvolvimento de embriões vitrificados e descongelados em camundongos C57BL/6J. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3155/3155fig1.jpg" /> Figura 1. O esquema geral do experimento, incluindo equilíbrio, vitrificação e descongelamento de embriões. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3155/3155fig2.jpg" /> Figura 2. A morfologia de embriões em cada etapa do descongelamento. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3155/3155fig3.jpg" /> Figura 3. Thawing procedimento de embriões. Todos os procedimentos são realizados à temperatura ambiente. (A), Adicionar 850 mL de TS1 (37 ° C) em um cryotube e transferência de todo o volume da solução no cryotube em um prato de plástico. Neste momento, os embriões olhar inchado como mostrado na figura. 2B. (B), espalhe a solução sobre a superfície do prato, agitando suavemente. (C), coloque três gotas de 50 mL de TS2 no prato de plástico. (D), Transferência de embriões para a primeira gota de TS2. Depois de 3 min, os embriões olhar shurunken como mostrado na figura. 2C. (E), transferi-los de sériely no TS2 restantes gotas e depois para o meio de cultura.

<ol>
	<li>Whittingham, D. G., Leibo, S. P., Mazur, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+of+mouse+embryos+frozen+to+-196&#176;+and+-269&#176;C.">Survival of mouse embryos frozen to -196&#176; and -269&#176;C.</a> Science. 187, 411-414 (1972).</li><li>Rall, W. F., Fahy, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ice-free+cryopreservation+of+mouse+embryos+at+-196&#176;C+by+vitrification.">Ice-free cryopreservation of mouse embryos at -196&#176;C by vitrification.</a> Nature. 313, 573-575 (1985).</li><li>Yoshiki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+resources+at+the+RIKEN+BioResource+center.">The mouse resources at the RIKEN BioResource center.</a> Exp. Anim. 58, 85-96 (2009).</li><li>Mochida, K., Ogura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+embryos+in+laboratory+species.">Cryopreservation of embryos in laboratory species.</a> J. Mamm. Ova. Res. 27, 87-92 (2010).</li><li>Kasai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+mouse+embryos+cryopreservation+in+a+low+toxicity+vitrification+solution,+without+appreciable+loss+of+viability.">A simple method for mouse embryos cryopreservation in a low toxicity vitrification solution, without appreciable loss of viability.</a> J. Reprod. Fert. 89, 91-97 (1990).</li><li>Dinnyes, A., Wallace, G. A., Rall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+genotype+on+the+efficiency+of+mouse+embryo+cryopreservation+by+vitrification+or+slow+freezing+methods.">Effect of genotype on the efficiency of mouse embryo cryopreservation by vitrification or slow freezing methods.</a> Mol. Reprod. Dev. 40, 429-435 (1995).</li><li>Kasai, M., Mukaida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+animal+and+human+embryos+by+vitrification.">Cryopreservation of animal and human embryos by vitrification.</a> Reprod. Biomed. Online. 9, 164-170 (2004).</li><li>Miyake, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitrification+of+mouse+oocytes+and+embryos+at+various+stages+of+development+in+an+ethylene+glycol-based+solution+by+a+simple+method.">Vitrification of mouse oocytes and embryos at various stages of development in an ethylene glycol-based solution by a simple method.</a> Theriogenology. 40, 121-134 (1993).</li><li>Han, M. S., Niwa, K., Kasai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitrification+of+rat+embryos+at+various+developmental+stages.">Vitrification of rat embryos at various developmental stages.</a> Theriogenology. 59, 1851-1863 (2003).</li><li>Jin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Equilibrium+vitrification+of+mouse+embryos.">Equilibrium vitrification of mouse embryos.</a> Biol. Reprod. 82, 444-450 (2010).</li></ol>

Não temos nada a revelar.

Desde o primeiro relato de vitrificação embrião de rato por Rall e Fahy, em 1985, duas, várias melhorias técnicas têm sido feitos para aumentar a capacidade de sobrevivência dos embriões após o descongelamento. Uma das modificações mais bem sucedida foi conseguida através da utilização de etileno glicol como crioprotetor por causa de sua baixa toxicidade e alta permeabilidade da membrana. Tais vantagens permitem-nos lidar com embriões congelamento à temperatura ambiente 4; métodos de vitrificação outras requerem embrião entregando a temperaturas mais frias e nem sempre são aplicáveis ​​a algumas linhagens de camundongos incluindo BALB / c 6. O etileno glicol vitrificação primeiro baseado foi desenvolvido por Kasai et al. em 1990 5,7. Porque o método original foi otimizada para canudos de plástico como recipientes, nós temos um pouco modificou o protocolo para criotubos, que são mais facilmente acessíveis em laboratórios e mais resistentes a danos físicos. Portanto, o método de vitrificação aqui descrito pode ser applicable para muitos laboratórios usando ratos como modelos de pesquisa. O mesmo método também pode ser usado para embriões de camundongos na mórula e blastocisto estágios 8 e 9 embriões de ratos. No entanto, temos encontrado recentemente que a qualidade dos criotubos podem afetar as taxas de sobrevivência dos embriões após o congelamento-descongelamento. Assim, é essencial para examinar a superfície interna do criotubos por sua suavidade antes de embriões vitrificação (por exemplo, ver a Tabela de reagentes e equipamentos específicos). Métodos de vitrificação têm muitas vantagens sobre métodos convencionais de congelamento lento, mas que inerentemente têm uma desvantagem em relação a finalidade de transporte. Como embriões vitrificados deve ser mantida a inferiores a -120 ° C para manter a sua viabilidade, carregadores secos são geralmente utilizados para o seu transporte seguro. Carregadores secos são pesados ​​e volumosos, e sua ida e volta é caro, especialmente para o transporte internacional. Estamos agora a desenvolver um método de vitrificação novoque os embriões vitrificados podem ser armazenados em temperatura de gelo seco (cerca de -80 ° C) durante pelo menos sete dias 10. Este método deve ser a vitrificação da próxima geração.

<table border="1"><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comments (opcional) </td></tr><tr><td> Albumina de soro bovino </td><td> Merck Biosciences (Calbiochem) </td><td> 12657 </td><td></td></tr><tr><td> Etilenoglicol </td><td> Wako Pure Chemical Industries </td><td> 058-00986 </td><td></td></tr><tr><td> Ficoll 70 </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0310-10 </td><td></td></tr><tr><td> Glicose </td><td> Wako Pure Chemical Industries </td><td> 041-00595 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Wako Pure Chemical Industries </td><td> 191-01665 </td><td></td></tr><tr><td> KCl </td><td> Wako Pure Chemical Industries </td><td> 163-03545 </td><td></td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> Wako Pure Chemical Industries </td><td> 169-04245 </td><td></td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 · 12H 2 </sub&gt; O </td><td> Wako Pure Chemical Industries </td><td> 500-04195 </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 · 6H 2 O </td><td> Wako Pure Chemical Industries </td><td> 135-00165 </td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2 · 2H2O </td><td> Wako Pure Chemical Industries </td><td> 031-00435 </td><td></td></tr><tr><td> Penicilina G </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P-4687 </td><td></td></tr><tr><td> Piruvato de sódio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P-8574 </td><td></td></tr><tr><td> Sacarose </td><td> Wako Pure Chemical Industries </td><td> 196-00015 </td><td></td></tr><tr><td> M16 médio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M7292 </td><td></td></tr><tr><td> Meio M2 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M7167 </td><td></td></tr><tr><td> Criotubo </td><td> Sumitomo Bakelite </td><td> MS-4501 </td><td> &quot;Vial criogénicos&quot; </td></tr></table>

cryopreservation of mouse embryos by ethylene glycol-based vitrification

Criopreservação de embriões de camundongos é uma base tecnológica que suporta ciências biomédicas, porque muitas cepas de camundongos foram produzidos por modificações genéticas eo número está aumentando de forma consistente ano após ano. O seu desenvolvimento técnico começou com lentidão métodos de congelação na década de 1970 1, seguido por métodos de vitrificação desenvolvido no final dos anos 1980 2. Geralmente, a última técnica é vantajosa em sua rapidez, simplicidade e alta capacidade de sobrevivência de embriões recuperados. No entanto, o crioprotetores contidas são altamente tóxicos e podem afetar o desenvolvimento embrionário subseqüente. Portanto, a técnica não era aplicável a certas cepas de camundongos, mesmo quando as soluções são refrigerados a 4 ° C para mitigar o efeito tóxico durante a manipulação de embriões. No Bioresource RIKEN Center, mais de 5000 linhagens de camundongos com diferentes backgrounds genéticos e fenótipos são mantidos 3, e, portanto, ter otimizado a te vitrificaçãonão haver descrição prévia com a qual podemos criopreservar embriões de várias espécies diferentes de camundongos, com os benefícios de sobrevivência embrionária após a vitrificação alta e descongelamento (ou liquefação, mais precisamente), à temperatura ambiente 4. Aqui, apresentamos um método de vitrificação para embriões de camundongos que tem sido utilizado com sucesso no nosso centro. A solução de criopreservação contém etileno glicol, em vez de DMSO para minimizar a toxicidade de embriões 5. Ele também contém Ficoll e sacarose para a prevenção de desvitrificação e ajuste osmótico, respectivamente. Embriões podem ser manipulados em temperatura ambiente e transferida em nitrogênio líquido dentro de 5 min. Porque o método original foi otimizada para canudos de plástico como recipientes, nós temos um pouco modificou o protocolo para criotubos, que são mais facilmente acessíveis em laboratórios e mais resistentes a danos físicos. Descrevemos também o processo de descongelamento de embriões vitrificados em detalhes porque é um ste críticap para a recuperação eficiente de camundongos vivos. Estas metodologias seria útil para pesquisadores e técnicos que necessitam de preservação das linhagens de camundongos para uso posterior em uma maneira segura e rentável.

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Cryopreservation of Mouse Embryos by Ethylene Glycol-Based Vitrification

Uma etileno glicol baseado em método de vitrificação para embriões de camundongos é descrito. É vantajoso para outros métodos, em sua simplicidade e toxicidade embrionária baixo e, portanto, pode ser amplamente aplicável a muitas cepas de camundongos, incluindo camundongos isogênicos e gene modificado.

Criopreservação de embriões de camundongos por Vitrificação Etileno Glicol-Based

Cryopreservation of mouse embryos is a technological basis that supports biomedical sciences, because many strains of mice have been produced by genetic ...

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Biology

31.0K visualizações.  RIKEN BioResource Center. Uma etileno glicol baseado em método de vitrificação para embriões de camundongos é descrito. É vantajoso para outros métodos, em sua simplicidade e toxicidade embrionária baixo e, portanto, pode ser amplamente aplicável a muitas cepas de camundongos, incluindo camundongos isogênicos e gene modificado.

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Dissection of 6.5 dpc Mouse Embryos

Analysis of gene expression patterns during early stages of mammalian embryonic development can provide important clues about gene function, cell-cell interaction and signaling mechanisms that guide embryonic patterning. However, dissection of the mouse embryo from the decidua shortly after implantation can be a challenging procedure, and detailed step-by-step documentation of this process is lacking.

Here we demonstrate how post-implantation (6.5 dpc) embryos are isolated by first dissecting the uterus of a pregnant mouse (detection of the vaginal plug was designated day 0.5 poist coitum) and subsequently dissecting the embryo from maternal decidua. The dissection of Reichert's membrane is described as well as the removal of the ectoplacental cone.

Isolation of postimplantation-stage embryos allows one to study gene patterning and analyze cell-lineage decision making processes during embryonic development, but proper dissection of the early embryo can be challenging. This protocol describes a method for isolating early primitive-streak-stage embryos (~6.5 days post coitum [dpc]).

Dissecção de 6,5 embriões de camundongos dpc

Analysis of gene expression patterns during early stages of mammalian embryonic development can provide important clues about gene function, cell-cell ...

Biologia

In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E15 Mouse Embryos

In-utero in-vivo injection and electroporation of the embryonic mouse neocortex provides a powerful tool for the manipulation of individual progenitors lining the walls of the lateral ventricle. This technique is now widely used to study the processes involved in corticogenesis by over-expressing or knocking down genes and observing the effects on cellular proliferation, migration, and differentiation. In comparison to traditional knockout strategies, in-utero electroporation provides a rapid means to manipulate a population of cells during a specific temporal window. In this video protocol we outline the experimental methodology for preparing mice for surgery, exposing the uterine horns through laporatomy, injecting DNA into the lateral ventricles of the developing embryo, electroporating DNA into the progenitors lining the lateral wall, and caring for animals post-surgery. Our laboratory uses this protocol for surgeries on E13-E16 mice, however, it is most commonly performed at E15, as shown in this video. 

In Utero injeção intraventricular e eletroporação de embriões de camundongos E15

In-utero in-vivo injection and electroporation of the embryonic mouse neocortex provides a powerful tool for the manipulation of individual progenitors ...

Collection and Cryopreservation of Hamster Oocytes and Mouse Embryos

Embryos and oocytes were first successfully cryopreserved more than 30 years ago, when Whittingham et al. 1 and Wilmut 2 separately described that mouse embryos could be frozen and stored at -196 &deg;C and, a few years later, Parkening et al. 3 reported the birth of live offspring resulting from in vitro fertilization (IVF) of cryopreserved oocytes. Since then, the use of cryopreservation techniques has rapidly spread to become an essential component in the practice of human and animal assisted reproduction and in the conservation of animal genetic resources. Currently, there are two main methods used to cryopreserve oocytes and embryos: slow freezing and vitrification. A wide variety of approaches have been used to try to improve both techniques and millions of animals and thousands of children have been born from cryopreserved embryos. However, important shortcomings associated to cryopreservation still have to be overcome, since ice-crystal formation, solution effects and osmotic shock seem to cause several cryoinjuries in post-thawed oocytes and embryos. Slow freezing with programmable freezers has the advantage of using low concentrations of cryoprotectants, which are usually associated with chemical toxicity and osmotic shock, but their ability to avoid ice-crystal formation at low concentrations is limited. Slow freezing also induces supercooling effects that must be avoided using manual or automatic seeding 4. In the vitrification process, high concentrations of cryoprotectants inhibit the formation of ice-crystals and lead to the formation of a glasslike vitrified state in which water is solidified, but not expanded. However, due to the toxicity of cyroprotectants at the concentrations used, oocytes/embryos can only be exposed to the cryoprotectant solution for a very short period of time and in a minimum volume solution, before submerging the samples directly in liquid nitrogen 5. In the last decade, vitrification has become more popular because it is a very quick method in which no expensive equipment (programmable freezer) is required. However, slow freezing continues to be the most widely used method for oocyte/embryo cryopreservation. In this video-article we show, step-by-step, how to collect and slowly freeze hamster oocytes with high post-thaw survival rates. The same procedure can also be applied to successfully freeze and thaw mouse embryos at different stages of preimplantation development.

In this video-article we present a step-by-step demonstration on how to collect and cryopreserve hamster oocytes with high post-thaw survival rates. The same procedure can also be applied to successfully freeze and thaw mouse embryos at different stages of preimplantation development.

Recolha e criopreservação de óvulos e embriões de camundongos Hamster

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Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an organism that contains cells from more than one animal; mosaics are one type of chimera in which cells from more than one genotype are mixed, usually wild-type and mutant. In the zebrafish, chimeras can be readily made by transplantation of cells from a donor embryo into a host embryo at the appropriate embryonic stage. Labeled donor cells are generated by injection of a lineage marker, such as a fluorescent dye, into the one-cell stage embryo. Labeled donor cells are removed from donor embryos and introduced into unlabeled host embryos using an oil-controlled glass pipette mounted on either a compound or dissecting microscope. Donor cells can in some cases be targeted to a specific region or tissue of the developing blastula or gastrula stage host embryo by choosing a transplantation site in the host embryo based on well-established fate maps.

A step-by-step guide to generating targeted chimeric zebrafish embryos by transplantation at the blastula or gastrula stage.

A criação de embriões quiméricos Zebrafish por Transplante

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

In vivo de imagens e tratamentos terapêuticos em um modelo de camundongo ortotópico de câncer de ovário

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

Genetic screening is one of the most powerful methods available for gaining insights into complex biological process 1. Over the years many improvements and tools for genetic manipulation have become available in Drosophila 2. Soon after the initial discovery by Frie and Mello 3 that double stranded RNA can be used to knockdown the activity of individual genes in Caenorhabditis elegans, RNA interference (RNAi) was shown to provide a powerful reverse genetic approach to analyze gene functions in Drosophila organ development 4, 5.
Many organs, including lung, kidney, liver, and vascular system, are composed of branched tubular networks that transport vital fluids or gases 6, 7. The analysis of Drosophila tracheal formation provides an excellent model system to study the morphogenesis of other tubular organs 8. The Berkeley Drosophila genome project has revealed hundreds of genes that are expressed in the tracheal system. To study the molecular and cellular mechanism of tube formation, the challenge is to understand the roles of these genes in tracheal development. Here, we described a detailed method of dsRNA injection into Drosophila embryo to knockdown individual gene expression. We successfully knocked down endogenous dysfusion(dys) gene expression by dsRNA injection. Dys is a bHLH-PAS protein expressed in tracheal fusion cells, and it is required for tracheal branch fusion 9, 10. dys-RNAi completely eliminated dys expression and resulted in tracheal fusion defect. This relatively simple method provides a tool to identify genes requried for tissure and organ development in Drosophila.

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

RNA interference has been proven very effective to analyze gene function in Drosophila tracheal development. A detailed protocol used by Jiang lab to inject dsRNA into fly embryos to knockdown gene expression is illustrated. This technique has the potential for screening genes required for tissue and organ development in Drosophila.

RNAi Interferência por injeção dsRNA em Drosophila Os embriões

Genetic screening is one of the most powerful methods available for gaining insights into complex biological process 1. Over the years many improvements ...

Cryopreservation of Preimplantation Embryos of Cattle, Sheep, and Goats

Preimplantation embryos from cattle, sheep, and goats may be cryopreserved for short- or long-term storage. Preimplantation embryos consist predominantly of water, and the avoidance of intracellular ice crystal formation during the cryopreservation process is of paramount importance to maintain embryo viability. Embryos are placed into a hypertonic solution (1.4 &#x2013; 1.5 M) of a cryoprotective agent (CPA) such as ethylene glycol (EG) or glycerol (GLYC) to create an osmotic gradient that facilitates cellular dehydration. After embryos reach osmotic equilibrium in the CPA solution, they are individually loaded in the hypertonic CPA solution into 0.25 ml plastic straws for freezing. Embryos are placed into a controlled rate freezer at a temperature of -6&deg;C. Ice crystal formation is induced in the CPA solution surrounding the embryo, and crystallization causes an increase in the concentration of CPA outside of the embryo, causing further cellular dehydration. Embryos are cooled at a rate of 0.5&deg;C/min, enabling further dehydration, to a temperature of -34&deg;C before being plunged into liquid nitrogen (-196&deg;C). Cryopreserved embryos must be thawed prior to transfer to a recipient (surrogate) female. Straws containing the embryos are removed from the liquid nitrogen dewar, held in room temperature air for 3 to 5 sec, and placed into a 37&deg;C water bath for 25 to 30 sec. Embryos cryopreserved in GLYC are placed into a 1 M solution of sucrose for 10 min for removal of the CPA before transfer to a recipient (surrogate) female. Embryos cryopreserved in EG, however, may be directly transferred to the uterus of a recipient.

Preimplantation embryos may be cryopreserved after placement into a hypertonic cryoprotective solution to cause cellular dehydration. After equilibration, ice crystal formation is induced in the solution surrounding the embryo. Further dehydration occurs as the embryo is slowly cooled to subzero temperatures before plunging into liquid nitrogen for storage.

Criopreservação de embriões pré-implantatório de bovinos, ovinos e caprinos

Preimplantation embryos from cattle, sheep, and goats may be cryopreserved for short- or long-term storage.  Preimplantation embryos consist predominantly ...

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures are lengthy and technically demanding with multiple important steps that collectively contribute to the quality of the final result. This protocol describes in detail several key quality control steps for optimizing probe labeling and performance. Overall, our protocol provides a detailed description of the critical steps necessary to reproducibly obtain high quality results. First, we describe the generation of digoxygenin (DIG) labeled RNA probes via in vitro transcription of DNA templates generated by PCR. We describe three critical quality control assays to determine the amount, integrity and specific activity of the DIG-labeled probes. These steps are important for generating a probe of sufficient sensitivity to detect endogenous mRNAs in a whole mouse embryo. In addition, we describe methods for the fixation and storage of E8.5-E11.5 day old mouse embryos for in situ hybridization. Then, we describe detailed methods for limited proteinase K digestion of the rehydrated embryos followed by the details of the hybridization conditions, post-hybridization washes and RNase treatment to remove non-specific probe hybridization. An AP-conjugated antibody is used to visualize the labeled probe and reveal the expression pattern of the endogenous transcript. Representative results are shown from successful experiments and typical suboptimal experiments.

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

This whole mount in situ hybridization protocol discusses critical steps that ensure reproducible high quality results for gene expression studies in E8.5-E11.5 day old mouse embryos.

Monte todo In Situ Hibridação de E8.5 de Embriões E11.5 rato

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&middot;Cryo Kit

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies. Many of these valuable animals exist only as live animals, with no backup plan in case of emergency. Cryopreservation of embryos can provide this backup, but is costly, can be a lengthy procedure, and generally requires a large number of animals for success. Since the discovery that mouse sperm can be successfully cryopreserved with a basic cryoprotective agent (CPA) consisting of 18&#37; raffinose and 3&#37; skim milk, sperm cryopreservation has become an acceptable and cost-effective procedure for archiving, distributing and recovery of these valuable strains.
 Here we demonstrate a newly developed I&bull;Cryo kit for mouse sperm cryopreservation. Sperm from five commonly-used strains of inbred mice were frozen using this kit and then recovered. Higher protection ratios of sperm motility (&gt; 60&#37;) and rapid progressive motility (&gt; 45&#37;) compared to the control (basic CPA) were seen for sperm frozen with this kit in 5 inbred mouse strains. Two cell stage embryo development after IVF with the recovered sperm was improved consistently in all 5 mouse strains examined. Over a 1.5 year period, 49 GM mouse lines were archived by sperm cryopreservation with the I&bull;Cryo kit and later recovered by IVF.

Here we demonstrate the newly developed I&#x2022;Cryo kit for mouse sperm cryopreservation. Two-cell stage embryo development with frozen-thawed sperm was improved consistently in 5 mouse strains with the use of this kit. Over a 1.5 year period, 49 genetically modified mouse lines were archived by sperm cryopreservation with the I&#x2022;Cryo kit and later successfully recovered by IVF.

Criopreservação do mouse Sperm and Recovery utilizando o I · Cryo Kit

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies.  Many of these ...

Gene Transfer into Older Chicken Embryos by ex ovo Electroporation

The chicken embryo provides an excellent model system for studying gene function and regulation during embryonic development. In ovo electroporation is a powerful method to over-express exogenous genes or down-regulate endogenous genes in vivo in chicken embryos1. Different structures such as DNA plasmids encoding genes2-4, small interfering RNA (siRNA) plasmids5, small synthetic RNA oligos6, and morpholino antisense oligonucleotides7 can be easily transfected into chicken embryos by electroporation. However, the application of in ovo electroporation is limited to embryos at early incubation stages (younger than stage HH20 - according to Hamburg and Hamilton)8 and there are some disadvantages for its application in embryos at later stages (older than stage HH22 - approximately 3.5 days of development). For example, the vitelline membrane at later stages is usually stuck to the shall membrane and opening a window in the shell causes rupture of the vessels, resulting in death of the embryos; older embryos are covered by vitelline and allantoic vessels, where it is difficult to access and manipulate the embryos; older embryos move vigorously and is difficult to control the orientation through a relatively small window in the shell.
In this protocol we demonstrate an ex ovo electroporation method for gene transfer into chicken embryos at late stages (older than stage HH22). For ex ovo electroporation, embryos are cultured in Petri dishes9 and the vitelline and allantoic vessels are widely spread. Under these conditions, the older chicken embryos are easily accessed and manipulated. Therefore, this method overcomes the disadvantages of in ovo electroporation applied to the older chicken embryos. Using this method, plasmids can be easily transfected into different parts of the older chicken embryos10-12.

Gene Transfer into Older Chicken Embryos by ex ovo Electroporation

A method of gene transfer into chicken embryos at later incubation stages (older than Hamburger and Hamilton stage (HH) 22) is described. This method overcomes disadvantages of in ovo electroporation applied to older chicken embryos and is a useful technique to study gene function and regulation at older developmental stages.

Transferência de Embriões em Gene de frango por mais velhos<em&gt; Ovo ex</em&gt; Eletroporação

The chicken embryo provides an  excellent model system for studying gene function and regulation during  embryonic development. In ovo electroporation is ...