Este protocolo é útil para a conservação a longo prazo dos oócitos felinos através de uma técnica de criopreservação conhecida como vitrificação, que é crucial para a fertilidade e preservação da biodiversidade em espécies animais. As principais vantagens da vitrificação são sua velocidade, uma vez que pode ser concluída em menos de 17 minutos e sua viabilidade em condições de campo se o nitrogênio líquido estiver disponível. O gato doméstico é um modelo viável para felinos selvagens em extinção.
O desenvolvimento e otimização dos protocolos de criopreservação permitiria o estabelecimento de biobancos gamete para programas de conservação felina. Comece preparando uma placa de vitrificação Repro com três poços cônicos em uma fileira. Adicione 20 microliters de solução de equilíbrio ao primeiro poço e 300 microliters de solução de vitrificação ao segundo e terceiro poços.
Para equilibrar os complexos cumulus oocyte, ou COCs, use uma pipeta de pequeno furo para transferir um ou mais complexos para o fundo do primeiro poço. Adicione lentamente 20 microliters de solução de equilíbrio à borda da queda e espere por três minutos, depois adicione outros 240 microliters de solução de equilíbrio e espere por nove minutos. Enquanto espera, prepare uma caixa com nitrogênio líquido e rotule um suporte de vitrificação com o código de identificação do experimento ou gato.
Coloque a caixa e o suporte perto do microscópio estéreo. Após equilibrar os COCs, realize a vitrificação em menos de 90 segundos. Para vitranco os COCs, encha a pipeta de furo pequeno com a solução de vitrificação a partir do segundo poço.
Pegue os COCs do fundo do primeiro poço e mova-os para a superfície do segundo poço. Lave a pipeta com a solução de vitrificação, depois mova os COCs para outra área do poço e misture a solução circundante. Encha a pipeta com solução de outra área do poço.
Mova os COCs e misture o meio ao seu redor com a pipeta. Repita este processo mais uma vez. Em seguida, lave a pipeta com a solução de vitrificação do terceiro poço e use-a para mover os COCs para o fundo do terceiro poço.
Novamente, misture a solução ao redor. Depois de encher a pipeta com solução de outra área do poço, mova os COCs e misture a solução. Repita esse processo.
Encha a ponta da pipeta com a solução de vitrificação de outra área do poço e use-a para carregar os COCs na tira do suporte de vitrificação perto da ponta, em seguida, aspire o meio de excesso. Mergulhe imediatamente o suporte de vitrificação em nitrogênio líquido e use grampos para fechá-lo, certificando-se de que ele permaneça imerso. Armazene os suportes de vitrificação carregados em um cálice e mantenha-os em um tanque de nitrogênio líquido de armazenamento até o aquecimento.
Coloque o estágio de aquecimento perto do microscópio estéreo e ligue-o a 38 graus Celsius. Aqueça a tampa de uma placa de Petri em cima do palco, em seguida, transfira os suportes de vitrificação do tanque de armazenamento para uma caixa com nitrogênio líquido. Prepare uma linha de uma placa Repro para que cada suporte de vitrificação seja aquecido.
Adicione 300 microliters de solução de diluição ao primeiro poço e 300 microliters de solução de lavagem para o segundo e terceiro poços. Retire a solução de descongelamento da incubadora e deixe cair 100 microliters na tampa da placa de Petri. Use os grampos para abrir o suporte de vitrificação dentro do nitrogênio líquido.
Coloque a tampa da placa de Petri sob o microscópio estéreo, em seguida, pegue rapidamente o suporte de vitrificação e mergulhe sua tira na gota, movendo-a até que todos os COCs se desprendem. Remova o suporte da queda assim que estiver vazio, mas deixe os COCs na solução de descongelamento por um minuto. Encha uma pipeta com solução de diluição e use-a para mover os COCs da queda da solução de descongelamento para o fundo do primeiro poço com solução de diluição.
Deixe os COCs lá por três minutos. Lave a pipeta com a solução de lavagem a partir do segundo poço, depois pegue os COCs e mova-os para o fundo do segundo poço. Espere por cinco minutos.
Lave a pipeta com uma solução do terceiro poço e use-a para mover os COCs do segundo poço para a superfície do terceiro poço. Espere os COCs tocarem no fundo do terceiro poço. Em seguida, repita o processo com outra área de poço.
Quando terminar, lave a pipeta com meio de cultura e mova os oócitos para um prato de cultura. A grande maioria dos gametas sobrevive após a vitrificação e aquecimento oócito de acordo com este protocolo. Uma imagem representativa de um viável complexo de oócito de gato aquecido viável cumulus oocyte manchado com diacetato de fluoresceína e iodeto de propídio é mostrado aqui.
Esta tabela mostra a porcentagem de sobrevivência após a vitrificação, que retrata dados pós-aquecimento de oócitos destinados à maturação in vitro. Dos 435 oócitos, 395 sobreviveram, marcando uma viabilidade global de 90,8% pós-aquecimento. No entanto, algumas alterações morfológicas podem ser notadas após o aquecimento.
As anormalidades morfológicas mais frequentes são alterações na forma e granulação do ooplasma, perda parcial ou às vezes total de células cumulus, e fraturas zona pellucida. Ao tentar este procedimento, lembre-se de preparar a mídia com antecedência para que sejam a temperatura certa antes do uso e siga as temperaturas e horários do protocolo para evitar a toxicidade celular. O protocolo também poderia ser aplicado a oócitos de outras espécies.
Se for bem-sucedido, isso também pode contribuir para a banca de germinais para a preservação da biodiversidade em felinos ameaçados de extinção.
