Autores querem reconhecer contribuições críticas do Dr. A. Dejam e MM Pelletier no desenvolvimento do uso da solução de nitrito de preservação para as medições de nitrito no sangue.

Todos os protocolos, incluindo o uso de animais foram aprovados para uso pelo NIDDK Animal Care e do Comitê Use e sangue humano foi obtido a partir dos bancos de sangue NIH de doadores saudáveis. Preparação 1. Amostra <ol><li> Preparação da solução de nitrito de preservação <ol><li> Prepara-se uma solução contendo 890 mM de ferricianeto de potássio (K 3 Fe (CN) 6) e NEM 118 mM (N-etilmaleimida) em água destilada. Dissolva bem até que fique claro amarelo sem cristais presentes. Adicionar NP-40 (octil phenoxylpolyethoxylethanol) em uma proporção de 1: 9 (v / v, NP-40 / solução). Misture com cuidado para evitar a formação de espuma e armazenar a 4 ° C, durante cerca de uma semana). </li></ol></li><li> Recolha e preparação de amostras de sangue <ol><li> Recolha de sangue, utilizando, pelo menos, uma agulha de 20 G para evitar hemólise com a heparina para evitar a coagulação (5 U / ml). Para a amostra de sangue, misturar sangue com nitrito de solução conservante imediatamente em uma proporção de 1: 4 (v/ V / solução de sangue). </li><li> Para as amostras de plasma e células vermelhas do sangue, centrifugação do sangue recolhido durante 5 min a 4000 xg, a 4 ° C para separar as células vermelhas do sangue (RBC) e plasma. Tome-se o sobrenadante (plasma) e misturá-lo com nitrito de solução conservante, como descrito acima para a determinação dos níveis de nitrito no plasma. </li><li> Cuidadosamente remover a restante plasma e buffy coat a partir da amostra e da pipeta da amostra de glóbulos vermelhos a partir do fundo do tubo para evitar a contaminação por outros tipos de células do sangue, utilizando uma ponta de pipeta de corte, e transferi-lo para um tubo contendo solução conservante nitrito na mesma razão como acima. </li><li> Misturar cada amostra (plasma e glóbulos vermelhos) com metanol frio a uma razão de 1: 1 ou 1: 2 (v / v da amostra / metanol) e centrifugar para a 13.000 xg, a 4 ° C durante 15 min para precipitar as proteínas. Leve o sobrenadante e usá-lo para a medição de nitrito ou congelar amostras preparadas, se necessário, em gelo seco e armazenar a -80 ° C. Nota: Nitrito rea rapidamentects com oxi-hemoglobina (oxiHb) em nitrato de formação de sangue. Desde oxiHb está sempre presente em grande excesso em relação nitrito, esta reacção conduz à aniquilação quase completa de nitrito de sangue nativo com um prazo de ~ 10 min. A fim de preservar a maioria de nitrito de sangue endógena, solução de preservação é adicionado nitrito de toda a amostra de sangue imediatamente após a colheita de sangue. A solução irá rapidamente lisar as células vermelhas do sangue e oxidar oxiHb em metemoglobina (metHb), uma forma inactiva de hemoglobina que não reage quimicamente com o nitrito. </li></ol></li><li> Preparação de amostras de outros tipos de fluido corporal <ol><li> Após a coleta de amostra para um recipiente adequado, misture bem com nitrito de preservar solução, deproteinate e medir imediatamente ou congelar e armazenar a -80 ° C. </li></ol></li><li> Recolha e preparação de amostras de tecido <ol><li> Recolha de tecidos animais perfundidos com solução salina heparinizada (10 U HEPARin / ml). Especial de consumo de cerca de 1 g de tecido desejado e homogeneizar ou usando um homogeneizador manual ou automatizado um homogeneizador. </li><li> Adicionar quantidade conhecida de solução de nitrito de preservação, conforme necessário para atingir homogenato suave. </li><li> Uma vez que o tecido é homogeneizado, precipitar as proteínas utilizando metanol frio (1: 1 ou 1: 2, razão v / v de amostra / metanol), como descrito acima, as amostras depois de centrifugação a 13.000 xg, a 4 ° C durante 15 min. </li><li> Recolha níveis de nitrito sobrenadante e medida. Se necessário, congelar amostras em qualquer fase da preparação sobre gelo seco e armazenar a -80 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Preparação de reduzir Soluções <ol><li> Tri-iodeto (I 3) reduzir a solução de nitrito e R- (X) -NO espécies determinação 1,3,4 <ol><li> Prepara-se uma solução de Kl 301 mM em conjunto com 138 mM de solução de I2 em água. Misturar-se com ácido acético glacial na proporção de 2: 7 (v / v / solução de ácido) num agitador magnético durante ~ 30 min, até que todoscristais são dissolvidos. Preferencialmente manter em garrafa escura, como iodeto é sensível à luz, e usar dentro de uma semana de preparação. Nota: Esta solução reduzirá o nitrito em NO e que também irá liberar NO a partir de R-SNO, R-NNO e Fe-NO grupos funcionais (R- (X) -NO), mas o nitrato não será afetado. O sinal a partir dos grupos funcionais à base de NO acima podem ser separados a partir do sinal verdadeiro nitrito por tratamento de metade da amostra com sulfanilamida acidificada (AS) e comparando-tratado como sinal e não tratada. AS irreversivelmente forma de diazónio catião com nitrito e este complexo não pode ser reduzida em I 3 solução. Porque, assim como o tratamento, prepare uma solução 290 mM de sulfanilamida em HCl 1 M e adicioná-lo a uma alíquota de amostra na proporção de 1: 9 (v / v AS / amostra). Medir o sinal de CL em partes AS-tratadas e não tratadas da amostra. Calcule o sinal de nitrito de verdade, como uma diferença de parte AS-tratados e não tratados da amostra. Nitrito pode também ser medido usando um nit selectivarito de redução de solução de / mistura de ácido acético ascórbico como descrito na parte 2.2. No entanto, devido à pequena quantidade geralmente de R- (X) -NO espécies presentes, medições usando como amostras-não tratados são na maioria dos casos, uma muito boa aproximação do teor total de nitrito. </li></ol></li><li> O ácido ascórbico / ácido acético solução (4A) para a determinação selectiva de nitrito de dois <ol><li> Prepare o ácido ascórbico 500 mm de água. Misturar esta solução com ácido acético glacial numa razão de 1: 7 (v / v, ácido ascórbico / ácido acético) para se preparar a mistura de reacção. Nota: Esta solução é específico para nitrito, não vai liberar NO a partir de qualquer R- (X) -NO espécie ou nitrato. No entanto, a solução de ácido acético e ascórbico deve ser preparada de fresco a cada dia antes das medições, como o ácido ascórbico oxida facilmente em solução. Conclusão de redução de nitritos depende da concentração de ácido ascórbico; e ácido ascórbico 50 mM, pelo menos, é recomendado para R completaedução de nitrito de plasma. No entanto, recomenda-se realizar algumas experiências piloto com diferentes concentrações de ácido ascórbico e padrões de nitrito no intervalo de concentração de nitrito esperado antes das medições por amostra final. Tenha em atenção que o ácido ascórbico esgota ligeiramente durante as medições, mudanças frequentes de modo de mistura de reacção na câmara de reacção de vidro são recomendados. </li></ol></li><li> Vanádio (III) solução de cloreto de redução para a determinação de nitrato de 9 <ol><li> Preparar uma solução 51 mM de VCl 3 em HCl 1M. Filtrar a solução através de um filtro de 200 um e armazenar em um frasco escuro, use dentro de duas semanas. Nota: Esta solução irá reduzir o nitrato, nitrito e todos R- (X) -NO espécies, por isso, se quantidades comparáveis de nitrito ou outro R- (X) -NO espécies estão presentes em conjunto com o nitrato, o teor final de nitrato tem de ser calculado como a diferença entre os sinais obtidos com CL VCl 3 e I3 reduzindo soluções. </li></ol></li></ol> 3. A quimiluminescência (CL) de configuração e Medidas Analyzer <ol><li> Solução padrão <ol><li> Prepare 1 uM solução de nitrito de sódio (NaNO 2). A mesma solução pode ser utilizado para determinações de nitrito e nitrato. </li></ol></li><li> Usando analisador Nota: Atualmente, existem dois disponíveis comercialmente NÃO analisadores que são sensíveis o suficiente para fins de pesquisa biológica - Sievers NOA e Ecophysics CLD 88Y. Ambos operam no mesmo princípio; a diferença principal é que CLD 88Y utiliza oxigénio do ar ambiente para fazer o ozono (O3), enquanto NOA requer um tanque de oxigénio exterior para o efeito. O procedimento abaixo descreve o conjunto para o Sievers NOA. <ol><li> configuração do instrumento <ol><li> Faça um ajuste inicial do analisador de acordo com as recomendações do fabricantecomo visto na Figura 1. </li><li> Abrir O tanque 2 ligado ao instrumento. Escolha &quot;análise&quot; e &quot;enter&quot; no menu principal no painel frontal. Na tela seguinte, escolha &quot;iniciar&quot; e pressione &quot;Enter&quot;. Ligar a armadilha de ácido (contendo NaOH 1 M) para o instrumento, conforme visto na Figura 1. </li><li> Esperar até fotomultiplicador arrefece para a temperatura inferior a -12 ° C e a câmara de reacção é evacuado a 6 Torr. Demora cerca de 30 min para chegar a uma linha de base plana e estável. A linha de base precisa para estabilizar dentro de 1 - 2 mV, o seu valor nominal é menos importante do que a sua estabilidade. Nota: Se o nitrato é medido, ligar o banho de arrefecimento de água (definido a 4 ° C, o que serve como armadilha fria por vapores de ácido e água) e o banho de água com aquecimento (a câmara de reacção principal, 95 ° C). A taxa de redução de nitrato em NO VCl 3 em solução é dependente da temperatura, e é muito lenta em Tempe quartotura, de modo substancial aumento da temperatura é necessária para observar a reacção. </li><li> Abra o tanque Ele e ligar a câmara de reacção de vidro para armadilha de ácido, como visto na Figura 1. Encha a câmara de reacção com uma solução de redução apropriado, reduzir a borbulhar para o mínimo e ligar câmara de reação para a armadilha de ácido. Usando tentativa e erro, ajustar a taxa de borbulhamento Ele para coincidir com a taxa de aspiração do instrumento (normalmente a ~ 200 mL / min para NOA de Siever). </li><li> Ligue o computador que controla o instrumento e iniciar o software líquido baseado em LabVIEW. Para ativar a comunicação entre o instrumento e o software de aquisição, pressione &quot;Enter&quot; quando em &quot;menu de dados&quot; até que a tela lê &quot;saída habilitado&quot;, em seguida, pressione &quot;claro&quot; para voltar para a tela de dados. </li><li> Espere por um traço linha de base estável na tela e começar a injetar amostras e padrões de nitrito na solução redutora através do septo. Sempre esperar para chegar a um ré linha de base estáveler o pico. Isso pode levar até 2 min. O software líquido tem uma opção para &quot;marcar&quot; tempos de injecção e anotar a injeção e vai exportar estes comentários em um arquivo separado (filename.info) como um complemento útil para o arquivo de dados (filename.data). </li><li> Uma vez que as amostras e padrões são medidos, escolha &quot;stop&quot; opção no menu de software líquido - o que irá gravar dados de um arquivo temporário em um arquivo permanente conhecido como &quot;filename.data&quot;. Pressionando opção &quot;abortar&quot; irá terminar a medição sem escrever dados adquiridos em um arquivo permanente. </li><li> Para terminar experimento, desligue o aparelho do recipiente de reacção, desligando a torneira na parte superior do recipiente de reacção e desligue o tubo entre a armadilha ácida e vaso de reação (ver Figura 1). Agora, pare de analisador NOA - pressione &quot;claro&quot;, vá para &quot;análise&quot;, colocar máquina em &quot;standby&quot; e espera &quot;confirmar&quot;. Se usado regularmente, oinstrumento pode ser deixado em modo de espera durante várias semanas. Desligue o fornecimento de oxigênio. Em seguida, lavar a solução redutora da câmara de reacção, de desconexão e fechar o tanque Ele a partir do vaso de reacção de vidro e proceder ao acabamento vaso de reacção. </li></ol></li><li> Padrões e amostras injecções <ol><li> Injecte 50 ul de solução de nitrito de 1 uM na mistura reaccional utilizando uma seringa de Hamilton bem lavadas. Aguarde pelo menos 1 - 2 min entre as injeções para conseguir uma boa separação dos picos. Repita injecção de 50 ul para chegar duplicados para cada ponto de dados. Lavar seringa com água desionizada após cada injecção. </li><li> Para adquirir conjunto completo de dados para curva padrão, continue com injecções em duplicado de 100, 150 mL (adicional de 200 mL pode ser necessária se altas concentrações de nitrito ou nitrato são esperados) de solução de nitrito de 1 ï¿½. Em cada caso, ter o cuidado de esperar até que o sinal cai de volta para a linha de base e, em seguida, adquirir 1 - 2 min da linha de base para alcançar uma boa separação dos picos. Nota: os padrões de nitrito pode ser medido em qualquer momento durante as experiências. No entanto, é preferível para obter a curva padrão, antes da medição de dados, como também serve como um controlo independente de funcionalidade instrumento. Quando os dados são coletados, quantidade de amostra injetada deve levar a picos bem pronunciadas. No entanto, deve ser mantido em mente que o fotomultiplicador é linear apenas até ~ 800 mV, de modo nenhum o pico deve ser superior a ~ 700 mV. Isto pode ser conseguido quer através da diminuição da quantidade injectada amostra ou a diluição da amostra com a água desionizada. Cada ponto deve ser medida pelo menos em duplicado. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Piknova, B., Schechter, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+Nitrite+in+Blood+Samples+Using+the+Ferricyanide-Based+Hemoglobin+Oxidation+Assay.">Measurement of Nitrite in Blood Samples Using the Ferricyanide-Based Hemoglobin Oxidation Assay.</a> Methods Mol Biol. 704, 39-56 (2011).</li><li>Nagababu, E., Rifkind, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+plasma+nitrite+by+chemiluminescence+without+interference+of+S-,+N-nitroso+and+nitrated+species.">Measurement of plasma nitrite by chemiluminescence without interference of S-, N-nitroso and nitrated species.</a> Free Radic Biol Med. 42, 1146-1154 (2007).</li><li>Pinder, A. G., Rogers, S. C., Khalatbari, A., Ingram, T. E., James, P. E., Hancock, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+measurement+of+nitric+oxide+and+its+metabolites+in+biological+samples+by+ozone-based+chemiluminescence.">The measurement of nitric oxide and its metabolites in biological samples by ozone-based chemiluminescence.</a> Methods in Molecular Biology, Redox-Mediated Signal Transduction. 476, 11-28 (2008).</li><li>Pelletier, M. M., Kleinbongard, P., Ring-wood, L., Hito, R., Hunter, C. J., Schechter, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+measurement+of+blood+and+plasma+nitrite+by+chemiluminescence:+pitfalls+and+solutions.">The measurement of blood and plasma nitrite by chemiluminescence: pitfalls and solutions.</a> Free Radic Biol Med. 41, 541-548 (2006).</li><li>Mac Arthur, P. H., Shiva, S., Gladwin, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+circulating+nitrite+and+S-nitrosothiols+by+reductive+chemiluminescence.">Measurement of circulating nitrite and S-nitrosothiols by reductive chemiluminescence.</a> J Chromatogr B. 851, 93-105 (2007).</li><li>Bryan, N. S., Grisham, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+detect+nitric+oxide+and+its+metabolites+in+biological+samples.">Methods to detect nitric oxide and its metabolites in biological samples.</a> Free Radic Biol Med. 43, 645-657 (2007).</li><li>Hendgen-Cotta, U., Grau, M., Rasaaf, T., Gharinin, P., Kelm, M., Kleinbongard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reductive+gas-phase+chemiluminescence+and+flow+injection+analysis+for+measurement+of+nitric+oxide+pool+in+biological+matrices.">Reductive gas-phase chemiluminescence and flow injection analysis for measurement of nitric oxide pool in biological matrices.</a> Method Enzymol. 441, 295-315 (2008).</li><li>Yang, B. K., Vivas, E. X., Reiter, C. D., Gladwin, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodologies+for+the+sensitive+and+specific+measurement+of+S-nitrosothiols,+iron-nitrosyls+and+Nitrite+in+biological+samples.">Methodologies for the sensitive and specific measurement of S-nitrosothiols, iron-nitrosyls and Nitrite in biological samples.</a> Free Radic Res. 37, 1-10 (2003).</li><li>Sm&#225;rason, A. K. 1., Allman, K. G., Young, D., Redman, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+levels+of+serum+nitrate,+a+stable+end+product+of+nitric+oxide,+in+women+with+pre-eclampsia.">Elevated levels of serum nitrate, a stable end product of nitric oxide, in women with pre-eclampsia.</a> Br J Obstet Gynaecol. 104 (5), 538-543 (1997).</li><li>Beckman, J. S., Congert, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Measurement+of+Dilute+Nitric+Oxide+in+Solution+with+an+Ozone+Chemiluminescent+Detector.">Direct Measurement of Dilute Nitric Oxide in Solution with an Ozone Chemiluminescent Detector.</a> Methods: A companion to Methods in Enzymology. 7, 35-39 (1995).</li><li>Bates, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+measurements+by+chemiluminescence+detection.">Nitric oxide measurements by chemiluminescence detection.</a> Neuroprotocols: A companion to Methods in Neuroscience. 1, 141-149 (1992).</li></ol>

Dr. Alan Schechter está listado como um co-inventor de várias patentes emitidas para os Institutos Nacionais de Saúde para o uso de sais de nitrito para o tratamento de doenças cardiovasculares. Ele recebe royalties com base no licenciamento NIH destas patentes para o desenvolvimento clínico, mas nenhuma outra compensação.

Passos críticos dentro do Protocolo Alíquotas de todas as soluções (incluindo a água) utilizados para preparar, diluir ou de outro modo tratar amostras originais têm de ser salvo e devolvido para possível nitrito ou (mais frequentemente) contaminação por nitrato. Nós descobrimos que a maioria vem de contaminação de água e muitos produtos químicos utilizados para tratar a amostra (ferricianeto em particular) também contém quantidades significativas de contaminação de nitrato em...

Nitrito, e um nitrato menos estender, os níveis no sangue refletem o estado geral do corpo NO metabolismo. concentrações de nitrito no sangue e a maioria dos órgãos e tecidos são apenas em nanomolar alta ou baixa gama micromolar, nitrato está normalmente presente em quantidades muito mais elevadas - na gama micromolar. Alterações nos níveis de nitrito devido à progressão da doença ou mudanças nos hábitos alimentares são bastante pequeno e só pode ser medido utilizando um método muito sensível. Por causa de seus níveis muito diferentes e diversos processos metabólicos, determinação separada dos níveis de nitrito e nitrato é essencial. Os chamados &quot;NO x determinação&quot;, onde nitrito e nitrato são medidos em conjunto tem muito pouco valor. Vários métodos para a quantificação de nitrito em várias amostras biológicas foram desenvolvidos - sendo o mais comum o mais antigo, com base na reacção de Griess, que tinha sido originalmente descrita em 1879. Mesmo com modificatio modernans, o limite de sensibilidade para nitrito atingível pelo método de Griess &#39;está em baixa gama micromolar. Quimiluminescência (CL), combinado com o tri-iodeto de solução redutora, é actualmente considerado como o método mais sensível, permitindo a quantificação na gama baixa nanomolar das concentrações de nitrito 1-8,10,11. O mesmo método CL, combinado com vanádio (III), cloreto de solução redutora, pode ser usado para medições sensíveis de nitrato, com precisão na gama nanomolar 9. CL detecta NO gás livre. Portanto, nitrito, nitrato, R-nitrosotióis (R-SNO), R-nitrosaminas (R-Nno), ou compostos de metal-Não (posteriormente referido como manuscrito &quot;R- (X) -NO&quot;), tem de ser convertida em grátis Sem gás, a fim de quantificar seus valores originais via CL. Conversão de NO é efectuada através de várias soluções redutoras diferentes, dependendo da natureza do NO metabolito. Após a conversão, livre Nenhum gás é purgado do recipiente de reacção por um gás transportador (He, N2 ou Ar) para dentro da câmara de reacção de um analisador CL onde o ozono (O3) é combinado com NO para formar dióxido de azoto (NO2) no seu estado activado. Com o retorno ao estado fundamental, NO 2 * emite na região do infravermelho e fóton emitido é detectada pelo fotomultiplicador (PMT) de instrumento de CL. A intensidade de luz emitida é directamente proporcional à concentração de NO na câmara de reacção, o que permite o cálculo da concentração das espécies originais usando curvas de calibração adequada. Em nosso protocolo, primeiro presente deliberação baseada em CL de nitrito e nitrato nos ambientes clínicos mais utilizados - em sangue e plasma, e depois discutimos como determinar estes íons em amostras de tecido. Nós também explicar em detalhes como preservar a concentração de nitrito fisiológica original, em ambientes de nitrito-reativa, como o sangue e seus componentes, plasma e glóbulos vermelhos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="812">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:351px;">potassium ferricyanide; K3Fe(CN)6</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">702587</td>
			<td style="width:207px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NEM; N-ethylmaleimide</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td>4260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NP-40; 4-Nonylphenyl-polyethylene glycol</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">74385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sulfanilamide; AS&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td>S9251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">HCl</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H1758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">acetic acid, glacial</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A9967</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ascorbic acid&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">potassium iodide; KI</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">60399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">iodine; I2</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">207772</td>
			<td>light sensitive, toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">sodium nitrite; NaNO2</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td>563218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">vanadium(III) chloride; VCl3</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">208272</td>
			<td>ligt sensitive, toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GentleMac</td>
			<td style="width:135px;">Miltenyi</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sievers NOA 280i</td>
			<td style="width:135px;">GE</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CLD 88Y</td>
			<td style="width:135px;">&#160;Ecophysics&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring nitrite and nitrate, metabolites in the nitric oxide pathway, in biological materials using the chemiluminescence method

O óxido nítrico (NO) é um dos principais reguladores de moléculas na homeostase vascular e também um neurotransmissor. NO enzimaticamente produzido é oxidado em nitrito e nitrato por interações com várias proteínas oxi-heme e outras vias ainda não são bem conhecidos. O processo inverso, a redução de nitrito e nitrato em NO tinha sido descoberto em mamíferos na última década e está ganhando a atenção como um dos possíveis caminhos para prevenir ou aliviar toda uma gama de doenças cardiovasculares, doenças metabólicas e musculares que são pensados ​​para estar associado a diminuição dos níveis de NO. É, portanto, importante para estimar a quantidade de NO e dos seus metabolitos em diferentes compartimentos do corpo - sangue, fluidos corporais e os vários tecidos. Sangue, devido à sua fácil acessibilidade, é o compartimento preferido utilizado para a estimativa de metabólitos. Devido à sua curta vida (alguns milissegundos) e baixa concentração de sub-nanomolar, medições confiáveis ​​diretos de sangue NO &lt;em&gt; in vivo apresentam grandes dificuldades técnicas. Assim NO disponibilidade geralmente é estimado com base na quantidade de seus produtos de oxidação, nitrito e nitrato. Estes dois metabolitos são sempre medidos separadamente. Existem vários métodos bem estabelecidos para determinar as suas concentrações em fluidos biológicos e tecidos. Aqui é apresentado um protocolo para o método de quimioluminescência (CL), com base na detecção espectrofotométrico de NO após nitrito ou nitrato de redução de tri-iodeto ou de vanádio (III) soluções de cloreto, respectivamente. A sensibilidade para nitrito e nitrato de detecção é em baixa gama nanomolar, que define CL como o método mais sensível disponível atualmente para determinar mudanças na NO vias metabólicas. Nós explicar em detalhe como preparar amostras de fluidos e tecidos biológicos, a fim de preservar valores originais de nitrito e nitrato presente no momento da coleta e como determinar os respectivos montantes em amostras. Limitações da técnica CL também são explained.

A Figura 2 mostra resultados representativos recolhidos a partir de padrões e cinco amostras diferentes. Como mostrado nesta figura, os aumentos de tensão fotomultiplicador imediatamente após nitrito contendo a solução (padrões ou amostras) é injectado na solução redutora (injecções de tempos estão indicados por setas vermelhas abaixo da curva) e regressa ao valor basal, uma vez todos os nitritos presentes no injectado solução foi reduzida. É também evide...

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Measuring Nitrite and Nitrate, Metabolites in the Nitric Oxide Pathway, in Biological Materials using the Chemiluminescence Method

Nitric oxide (NO) is an important signaling molecule in vascular homeostasis. NO production in vivo is too low for direct measurement. Chemiluminescence provides useful insight into NO cycle via measuring its precursors and oxidation products, nitrite and nitrate. Nitrite / nitrate determination in body tissues and fluids is explained.

Medindo nitrito e nitrato, metabolitos na Óxido Nítrico Pathway, em materiais biológicos utilizando o método de quimioluminescência

Nitric oxide (NO) is one of the main regulator molecules in vascular homeostasis and also a neurotransmitter. Enzymatically produced NO is oxidized into ...

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22.4K visualizações.  NIDDK, NIH. Nitric oxide (NO) is an important signaling molecule in vascular homeostasis. NO production in vivo is too low for direct measurement. Chemiluminescence provides useful insight into NO cycle via measuring its precursors and oxidation products, nitrite and nitrate. Nitrite / nitrate determination in body tissues and fluids is explained.

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Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&Delta;41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is believed to aid their search for suitable environments (1). This capability is conferred by the magnetosome, a subcellular organelle that consists of a linear-chain assembly of lipid vesicles each able to biomineralize and enclose a ~50-nm crystal of magnetite or greigite. A principle component of the magnetosome that was shown to be required for the formation of functional vesicles is MamA. MamA is a highly abundant magnetosome-associated protein which is one of the most characterized magnetosome-associated proteins in vivo (2-6). This article focuses on the purification of MamA, which despite being studied in vivo, no clear functional or structural details have been identified for it. Bioinformatics analysis suggested that MamA is a tetra-tricopeptide repeat (TPR) containing protein. TPR is a structural motif found as such or forming part of a bigger fold in a wide range of proteins, it serves as a template for protein-protein interactions and mediates multi-protein complexes (7). TPRs are involved in many crucial tasks in eukaryotic cell organelle processes and many bacterial pathways (8-14). In order to understand MamA, a unique TPR containing protein, highly purified protein is required as a first step. In this article, we present the purification protocol for a stable MamA deletion mutant (MamA&Delta;41) from M. magneticum AMB-1.

MamA is a unique Magnetosome associated protein which was shown to be involved in magnetosome activation. Here we present the purification protocol of MamA deletion mutant (MamA&Delta;41) from M. magneticum AMB-1.

Purificação do M. magneticum Strain AMB-1 proteína associada Magnetosome MamAΔ41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is ...

Biologia

Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or separation step. When the IL-8 target was present, a 'sandwich'-based assay attached magnetic beads with IL-8 capture antibody to streptavidin coupled fluorescent protein via the IL-8 target and a biotinylated IL-8 antibody. The magnetic beads are maneuvered into oscillatory motion by applying an alternating magnetic field gradient through two electromagnetic poles. The fluorescent proteins, which are attached to the magnetic beads are condensed into the detection area and their movement in and out of an orthogonal laser beam produces a periodic fluorescent signal that is demodulated using synchronous detection. The magnetic modulation biosensing system was previously used to detect the coding sequences of the non-structural Ibaraki virus protein 3 (NS3) complementary DNA (cDNA) [2]. The techniques that are demonstrated in this work for external manipulation and condensation of particles may be used for other applications, e.g. delivery of magnetically-coupled drugs in-vivo or enhancing the contrast for in-vivo imaging applications.

Magnetic modulation biosensing system is utilized to rapidly, sensitively and simply detect biological assays, such as DNA molecules and proteins.

Detecção rápida de Homogêneos Ensaios Biológicos Usando o sistema de modulação Biossensoriais Magnetic

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or ...

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor mutations in components of age-regulatory pathways. If these mutations perturb the function of the age-regulatory pathway and therefore alter the lifespan of the entire organism, they provide important mechanistic insights1-3.
Another strategy to investigate the regulation of lifespan is to use small molecules to perturb age-regulatory pathways. To date, a number of molecules are known to extend lifespan in various model organisms and are used as tools to study the biology of aging4-16. The number of molecules identified thus far is small compared to the genetic "toolset" that is available to study the biology of aging.
Caenorhabditis elegans is one of the principle models used to study aging because of its excellent genetics and short lifespan of three weeks. More recently, C.elegans has emerged as a model organism for phenotype based drug screens5,7,16-20 because of its small size and its ability to grow in microtiter plates.
Here we present an assay to measure C.elegans lifespan in 96 well microtiter plates. The assay was developed and successfully used to screen large libraries for molecules that extend C.elegans lifespan7. The reliability of the assay was evaluated in multiple tests: first, by measuring the lifespan of wild type animals grown at different temperatures; second, by measuring the lifespan of mutants with altered lifespans; third, by measuring changes in lifespan in response to different concentrations of the antidepressant Mirtazepine. Mirtazepine has previously been shown to extend lifespan in C.elegans7. The results of these tests show that the assay is able to replicate previous findings from other assays and is quantitative. The microtiter format also makes this lifespan assay compatible with automated liquid handling systems and allows integration into automated platforms.

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

In this protocol we present a method to measure Caenorhabditis elegans lifespan in 96 well microtiter plates.

Medição Caenorhabditis elegans Expectativa de Vida em 96 placas de microtitulação Bem

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor ...

Detection of Nitric Oxide and Superoxide Radical Anion by Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy from Cells using Spin Traps

Reactive nitrogen/oxygen species (ROS/RNS) at low concentrations play an important role in regulating cell function, signaling, and immune response but in unregulated concentrations are detrimental to cell viability1, 2. While living systems have evolved with endogenous and dietary antioxidant defense mechanisms to regulate ROS generation, ROS are produced continuously as natural by-products of normal metabolism of oxygen and can cause oxidative damage to biomolecules resulting in loss of protein function, DNA cleavage, or lipid peroxidation3, and ultimately to oxidative stress leading to cell injury or death4. 
Superoxide radical anion (O2&bull;-) is the major precursor of some of the most highly oxidizing species known to exist in biological systems such as peroxynitrite and hydroxyl radical. The generation of O2&bull;- signals the first sign of oxidative burst, and therefore, its detection and/or sequestration in biological systems is important. In this demonstration, O2&bull;- was generated from polymorphonuclear neutrophils (PMNs). Through chemotactic stimulation with phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA), PMN generates O2&bull;- via activation of nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidase5. 
Nitric oxide (NO) synthase which comes in three isoforms, as inducible-, neuronal- and endothelial-NOS, or iNOS, nNOS or eNOS, respectively, catalyzes the conversion of L- arginine to L-citrulline, using NADPH to produce NO6. Here, we generated NO from endothelial cells. Under oxidative stress conditions, eNOS for example can switch from producing NO to O2&bull;- in a process called uncoupling, which is believed to be caused by oxidation of heme7 or the co-factor, tetrahydrobiopterin (BH4)8.
There are only few reliable methods for the detection of free radicals in biological systems but are limited by specificity and sensitivity. Spin trapping is commonly used for the identification of free radicals and involves the addition reaction of a radical to a spin trap forming a persistent spin adduct which can be detected by electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy. The various radical adducts exhibit distinctive spectrum which can be used to identify the radicals being generated and can provide a wealth of information about the nature and kinetics of radical production9.
The cyclic nitrones, 5,5-dimethyl-pyrroline-N-oxide, DMPO10, the phosphoryl-substituted DEPMPO11, and the ester-substituted, EMPO12 and BMPO13, have been widely employed as spin traps--the latter spin traps exhibiting longer half-lives for O2&bull;- adduct. Iron (II)-N-methyl-D-glucamine dithiocarbamate, Fe(MGD)2 is commonly used to trap NO due to high rate of adduct formation and the high stability of the spin adduct14.

Electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy was employed to detect nitric oxide from bovine aortic endothelial cells and superoxide radical anion from human neutrophils using iron (II)-N-methyl-D-glucamine dithiocarbamate, Fe(MGD)2 and 5,5-dimethyl-1-pyroroline-N-oxide, DMPO, respectively.

Detecção de Óxido Nítrico e ânion radical superóxido por espectroscopia de ressonância paramagnética eletrônica a partir de células usando armadilhas para spins

Reactive nitrogen/oxygen species (ROS/RNS) at low concentrations play an important role in regulating cell function, signaling, and immune response but in ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is a simple and very efficient method for the determination of the osmotic water permeability coefficient (Pf) in plant protoplasts, applicable in principle also to other spherical cells such as frog oocytes. The first step of the assay is the isolation of protoplasts from the plant tissue of interest by enzymatic digestion into a chamber with an appropriate isotonic solution. The second step consists of an osmotic challenge assay: protoplasts immobilized on the bottom of the chamber are submitted to a constant perfusion starting with an isotonic solution and followed by a hypotonic solution. The cell swelling is video recorded. In the third step, the images are processed offline to yield volume changes, and the time course of the volume changes is correlated with the time course of the change in osmolarity of the chamber perfusion medium, using a curve fitting procedure written in Matlab (the &#8216;PfFit&#8217;), to yield Pf.

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the osmotic water permeability coefficient (Pf) of cells can help understand the regulatory mechanisms of aquaporins (AQPs). Pf determination in spherical plant cell protoplasts presented here involves protoplasts isolation and numerical analysis of their initial rate of volume change as a result of an osmotic challenge during constant bath perfusion.

Medindo o Coeficiente de Permeabilidade osmótica de água (P<sub&gt; F</sub&gt;) De células esféricas: protoplastos planta isolada como um exemplo

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular physiology. Dysfunctional eNOS such as uncoupling of eNOS leads to decrease in NO bioavailability and increase in superoxide anion (O2.&#8722;) production, and in turn promotes cardiovascular diseases. Therefore, appropriate measurement of NO and O2.&#8722; levels in the endothelial cells are pivotal for research on cardiovascular diseases and complications. Because of the extremely labile nature of NO and O2.&#8722;, it is difficult to measure NO and O2.&#8722; directly in a blood vessel. Numerous methods have been developed to measure NO and O2.&#8722; production. It is, however, either insensitive, or non-specific, or technically demanding and requires special equipment. Here we describe an adaption of the fluorescence dye method for en face simultaneous detection and visualization of intracellular NO and O2.&#8722; using the cell permeable diaminofluorescein-2 diacetate (DAF-2DA) and dihydroethidium (DHE), respectively, in intact aortas of an obesity mouse model induced by high-fat-diet feeding. We could demonstrate decreased intracellular NO and enhanced O2.&#8722; levels in the freshly isolated intact aortas of obesity mouse as compared to the control lean mouse. We demonstrate that this method is an easy technique for direct detection and visualization of NO and O2.&#8722; in the intact blood vessels and can be widely applied for investigation of endothelial (dys)function under (physio)pathological conditions.

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

In this article we describe an adapted relatively easy method using the fluorescence dye diaminofluorescein-2 diacetate (DAF-2DA) and dihydroethidium (DHE) for en face simultaneous detection and visualization of intracellular nitric oxide (NO) and superoxide anion (O2.&#8722;) respectively, in freshly isolated intact aortas of an obesity mouse model.

Face Detection En de óxido nítrico e superóxido na camada endotelial das artérias intactas

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular ...

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular fluorescent complementation (BiFC) assay in tobacco epidermal cells, from testing protein-protein interaction to monitoring spatial distribution of signal transduction in plant cells. In this protocol, we used the BiFC assay to show that the interaction and the signaling between the Arabidopsis MAPKKK YODA and MAPK6 occur at the plasma membrane. When the scaffold protein BASL was co-expressed, the YODA-MAPK interaction redistributed and spatially co-polarized with CFP-BASL. This modified tobacco expression system allows for quick examination of signaling localization and dynamic changes (less than 4 days) and can accommodate multiple of fluorescent protein colors (at least three). We also presented detailed methods to quantify protein distribution (asymmetric spatial localization, or &#34;polarization&#34;) in tobacco cells. This advanced tobacco expression system has a potential to be used widely for quick testing of dynamic signaling events in live plant cells.

At the subcellular level, signaling events are dynamically modulated by developmental and environmental cues. Here we describe a protocol that employs the tobacco transient expression system to monitor dynamic protein-protein interaction and to disclose spatial organization of signal transduction in plant cells.

Imagiologia reorganização espacial de uma via de sinalização MAPK Utilizar o sistema de expressão transitória do Tabaco

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

De alta resolução de imagem Time-lapse e análise automatizada de microtúbulos Dynamics em Viver umbilical humano Células Endoteliais da Veia

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

Isolamento de filtração de Ácidos Nucleicos: Um Método de extracção de DNA simples e rápido

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...