GVdB, via the University of Leuven (KU Leuven), receives long-term structural research support from the Methusalem Program funded by the Flemish Government (METH08/07) and holds a European Research Council Advanced Grant AdvG-2012-321670 from the Ideas Program of the European Union seventh framework program. SET received a Research Foundation-Flanders (FWO) Research Assistant Fellowship.

O protocolo foi aprovado pela Universidade de Leuven Ética Conselho de Revisão de Pesquisa Animal. 1. Preparação da Linha Venosa <ol><li> Preparar a ponta do cateter venoso por rapidamente imergindo a parte central de 60 cm microrenathane tubagem (MRE) em óleo de sésamo quente (&gt; 220 ° C). Subsequentemente esticar a parte do meio do tubo para produzir um diâmetro estreito (diâmetro externo (OD) &lt;0.5 mm), movendo-se suavemente as extremidades do tubo para longe umas das outras. </li><li> Utilizar uma lâmina de bisturi para cortar o tubo em duas partes de 30 cm cada (ver Figura 1, Quadro 1). </li><li> Ligar o tubo de ERM de polietileno tubagem PE10 usando conector de polietileno PE50 e ligar esta tubagem PE10 para a parte inferior do suporte giratório. Conectar a parte superior da peça giratória a tubagem PE10, e ligar esta para uma agulha de ponta Luer com tubagem PE50 conector de acordo com a Figura 1. </li><li> Aplicar forte fast-acting cola adesiva para todas as ligações e testar o cateter para detecção de fugas através de lavagem com ar. Gás esterilizar o cateter antes da sua utilização. </li></ol><img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/55553/55553fig1.jpg" /> Figura 1: Construção de Venosa Line. Linhas venosas são preparados por alongamento do tubo de ERM para um diâmetro pequeno e ligando-o através de uma tubagem de polietileno de um dispositivo giratório de roedor. Ver Tabela 1 para instruções sobre comprimentos das diferentes partes. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55553/55553fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> lenda </td><td> comprimento </td><td> Volume </td></tr><tr><td> 1) de agulhas Luer topo 22G </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2) PE50 - polietileno de 0,023&quot; x 0,038&quot; </td><td> 5 cm </td><td> 13 uL </td></tr><tr><td> 3) PE10 - polietileno de 0,011&quot; x 0,024” </td><td> 50 centímetros </td><td> 30 uL </td></tr><tr><td> 4) Roedor giratória 20 L </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 5) PE-10 </td><td> 15 cm </td><td> 9 pL </td></tr><tr><td> 6) PE-50 (conector) </td><td> 5 cm </td><td> 13 uL </td></tr><tr><td> 7) MRE025 Dica esticado microrenathane 0,025&quot; x 0,012&quot; </td><td> 30 cm </td><td> 27 uL </td></tr><tr><td> Soma total </td><td> 105 cm </td><td> 92 uL </td></tr></tbody></table> Tabela 1: Construção de Venosa Line. Esta tabela fornece uma legenda para a Figura 1. 2. Anestesia e Manipulação de pré-cirurgia <ol><li> Use de 24 semanas de idade macho C57BL 6J / (27-32 g). NOTA: Nós usamos ratos 24 semanas de idade (adultos maduros) como esta idade corresponde melhor com a idade média dos pacientes de terapia intensiva. Nós utilizamos ratos machos apenas para evitar a influência cíclica de estrogénios. A técnica também pode ser usada em animais mais jovens (testadas em ratinhos de idade de 16 semanas) e fêmeas, se preferido. </li><li> Esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos antes do uso. Limpar o cateter venoso caseira estéril com solução salina para remover quaisquer bolhas de ar e para testar a permeabilidade e potenciais fugas. </li><li> Corte um fio de metal (0,8 mm de diâmetro) de 80 cm de comprimento, dobrá-lo por dobragem e fazer um laço. Chumbo 3 pérolas sobre o fio dobrado para o circuito. Anexar o cateter para o arame metálico de guiamento pela ponta do cateter através das pérolas 3. NOTA: A ligação de fio de metal é necessário para a rotação da peça giratória para que o cateter está ligado. Como tal, o rato pode mover-se livremente, sem bloquear a linha venosa. </li><li> Anestesiar a mouse por uma injecção intraperitoneal (IP) de uma mistura de 0,03 ml de cetamina (100 mg / kg) e 0,02 mL de xilazina (13 mg / kg). Certifique-se de que a anestesia é adequada, verificando a ausência de reflexos. Puxe suavemente a língua mouse fora com uma pinça para evitar asfixia por ingestão da língua. NOTA: Se após 10 min, o murganho ainda tenta retirar os seus membros dar cetamina adicional como um mL bolus 0,01. </li><li> Raspar a área cirúrgica incluindo abdómen, lado ventral do pescoço (triângulo entre queixo, esterno e clavícula), e entre as omoplatas na base da cabeça). </li><li> Colocar o rato na posição de bruços numa almofada de aquecimento pré-aquecido, desinfectar a pele com etanol a 70% e aplicar uma pequena quantidade de lubrificante oftálmica para proteger os olhos de secar. Infiltrar nos locais cirúrgicos (abdómen, pescoço-frente e verso) com 0,2 mL de ropivacaína (0,67 mg / kg). </li><li> Enquanto o rato ainda está em posição de pronação, fazer uma pequena incisão na base do lado dorsalda cabeça com bisturi ou tesoura. Expor os músculos cervicais posteriores, e amarrar o músculo para o laço da ligação de fio de nylon com 3,0 por conduzindo um fio de nylon 3.0 sob o músculo. </li><li> Posicione o mouse em seu lado direito. Fazer uma pequena incisão vertical na pele do pescoço ventral com um bisturi ou tesoura. Sob orientação visual, um túnel subcutaneamente agulha de calibre 18 através desta incisão ventral para a incisão na parte traseira feita anteriormente e enfiar o cateter através da agulha para exteriorizar-lo no lado ventral. </li><li> Posicione o mouse sobre as suas costas. Passe um fio 3.0 nylon atrás dos dentes superiores incisivos do mouse e fita-lo até a almofada de aquecimento. Proteger a cabeça em uma máscara facial para a entrega de oxigénio (2 L / min). Corrigir o rato em uma posição esticada para baixo gravando a cauda e as duas patas dianteiras. NOTA: Se os anestesia de cetamina-xilazina por si só não é suficiente, isoflurano inalado (0,5-1,5%) pode ser administrado durante a cirurgia. </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. Colocação de uma crônica sonda vesical de demora <ol><li> Posicione o mouse sob o microscópio de dissecação. Na incisão feita anteriormente no pescoço ventral, gentilmente provocar tecido adiposo e glândulas afastado com uma pinça até que a veia jugular pode ser visualizado. </li><li> Bruscamente dissecar para libertar a veia jugular do tecido conjuntivo subcutâneo e de cima e em torno do vaso através da colocação da ponta do fórceps entre a veia e tecido conjuntivo e a abertura das pinças repetidamente em paralelo com a veia. Como tal, os danos à veia serão evitados. </li><li> Isolar a veia jugular, colocando uma pinça sem corte sob a veia. Alimentar três pedaços de fio de seda 3.0 sob a veia, a posição de uma parte proximal à bifurcação da veia jugular (ligadura craniana) e uma parte perto da esternocleidomastoideu (caudal ligadura). Apertar a ligadura craniana e a ligadura caudal para alongar a veia e evitar hemorragia excessiva durante a colocação do cateter. Tou seja, uma ligadura solta com o fio do meio para assegurar a fácil fixação do cateter mais tarde. </li><li> Utilizando micro-tesoura, fazer uma incisão ao longo da nervura entre as ligaduras cranianos e caudal e grande o suficiente para passar o cateter. Agarre o cateter com uma pinça, e inserir o cateter 11 mm na veia. Folgadamente fixar o cateter por amarrar a ligadura meio e confirmar o posicionamento correcto por lavagem suavemente com solução salina estéril. </li><li> Fixar o cateter por firmemente amarrar a ligadura meio e caudal em torno do vaso e o cateter. Laço termina de ligadura caudal e meio em conjunto para prender firmemente o cateter. Garantir que os nós não obstruir a veia, através de lavagem do cateter após cada nó feito. Finalmente, amarrar o caudal e ligaduras cranianos. Fechar a incisão com suturas 5.0 de seda. </li></ol> 4. Cecal Clipagem e Puncture <ol><li> Fazer uma incisão mediana de 1 cm através da pele da metade inferior do abdómen com bisturi ou tesoura;ter cuidado para não penetrar na cavidade peritoneal. </li><li> Identificar a linha alba da musculatura abdominal e fazer uma incisão intermuscular para ganhar a entrada para a cavidade peritoneal. Localizar o ceco, e utilizar uma pinça anatómicas rombas para isolar o ceco e exteriorização. </li><li> Ligadura o ceco em 50% do seu comprimento com suturas de seda 3,0. Certifique-se de não ligar a válvula ileocecal para que a continuidade intestinal é mantido. </li><li> Perfurar a ceco com uma agulha de calibre 18 por um único através de-e-a meio caminho através do furo entre a ligação e a ponta do ceco. Depois de retirar a agulha, extrudir uma pequena quantidade de fezes a partir do furo para assegurar a desobstrução. </li><li> Reposicionar o intestino na cavidade abdominal, e fechar o peritônio e pele com suturas 5.0 de seda. NOTA: Em média, um novo estagiário requer de 10 a 15 animais para ser capaz de colocar sem problemas do cateter venoso e executar CLP dentro de 45 min. Após o período de treinamento, uma anestesia / cirurgia related mortalidade de 10% pode ser esperado. </li></ol> Tratamento 5. Pós-cirúrgico e Reanimação com Fluidos <ol><li> Colocar o rato na posição supina e fixar o cateter no fio de fixação com fita adesiva. Mover o rato para uma gaiola individual. Utilize uma base com um grampo ajustável para manter o dispositivo giratório 25 cm acima do rato e firmemente tape a parte livre do fio de ligação de metal para o ponto de rotação da peça giratória. </li><li> Anexar uma seringa que contém a mistura de colóides equilibradas e cristalóides (1: 4) para a linha venosa para iniciar a reanimação fluido. </li><li> Coloque a gaiola num ambiente de temperatura controlada (27 ° C) do armário de animais com 12 horas de luz e os ciclos de escuro e iniciar a reanimação de fluidos por via intravenosa (10 mL / kg / h) através de uma bomba de infusão, accionado por seringa precisas. Fornecer enriquecimento gaiola, tais como material de assentamento e um bloco de madeira. </li></ol> 6. Cuidados Intensivos <ol><li> Às 6 h pós-operação, por via subcutânea injectar dor medication e antibióticos (0,3 mL buprenorfina (0,15 mg / kg) e 0,2 mL de imipenem (16.67mg / kg)). NOTA: Após a prática padrão de medicina de animais de laboratório, a primeira dose de analgésicos é dada antes da incisão cirúrgica inicial e, em seguida, como dirigido por políticas veterinários da instituição. As injecções subcutâneas deve ser cuidadosamente injectada no espaço subcutâneo. </li><li> Depois de 20 - 24 h de reanimação fluido, substituir os cristalóides / colóides de nutrição parentérica total (6,67 mL / kg / h). NOTA: A nutrição parentérica total administrado (5,8 kcal / 24 h), cobre cerca de 40% das necessidades calóricas diárias de ratinhos, semelhante à da ingestão calórica precoce de pacientes na unidade de cuidados intensivos. </li><li> Subcutaneamente administrar medicação para a dor e antibióticos (0,6 mL de buprenorfina (0,3 mg / kg) e 0,2 mL de imipenem (16,67 mg / kg) a cada 12 h durante a totalidade do período de doença grave. </li><li> Confira os animais pelo menos a cada 3 h durante o dia. Avaliar o sofrimento, dando uma dorpontuação baseada no mouse escala careta validado 11. Intensificar monitorização para animais com uma pontuação elevada dor. </li></ol> 7. final do experimento NOTA: Aprovação e recomendações sobre o nível de gravidade do modelo e diretrizes e políticas para endpoints humanos deve ser procurado a partir do Institutional Review Board Ética local para Pesquisa Animal. Nota: Em caso de uma linha venosa não funcionais, tais como cateter bloqueado, deslocalização do cateter, problemas com a bomba de seringa, o animal é excluído do estudo e eutanasiados. <ol><li> No final do período experimental, anestesiar profundamente o rato usando uma mistura de 0,03 ml de cetamina (100 mg / kg) e 0,02 mL (13 mg / kg), xilazina. Euthanize o mouse por retirada de sangue por punção cardíaca. Loja encaixe amostras de tecidos congelados de interesse a -80 ° C. </li></ol>

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	<li>Angus, D. C., van der Poll, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+sepsis+and+septic+shock.">Severe sepsis and septic shock.</a> N Engl J Med. 369 (9), 840-851 (2013).</li><li>Singer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Third+International+Consensus+Definitions+for+Sepsis+and+Septic+Shock+(Sepsis-3).">The Third International Consensus Definitions for Sepsis and Septic Shock (Sepsis-3).</a> JAMA. 315 (8), 801-810 (2016).</li><li>Remick, D. G., Newcomb, D. E., Bolgos, G. L., Call, D. 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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cecal+ligation+and+puncture+with+total+parenteral+nutrition:+a+clinically+relevant+model+of+the+metabolic,+hormonal,+and+inflammatory+dysfunction+associated+with+critical+illness.">Cecal ligation and puncture with total parenteral nutrition: a clinically relevant model of the metabolic, hormonal, and inflammatory dysfunction associated with critical illness.</a> J Surg Res. 121 (2), 178-186 (2004).</li><li>Conti, M., Merlani, P., Ricou, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognosis+and+quality+of+life+of+elderly+patients+after+intensive+care.">Prognosis and quality of life of elderly patients after intensive care.</a> Swiss Med Wkly. 142, (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Foi desenvolvido um modelo de ratinho mais clinicamente relevante da doença crítica, combinando o método de ligadura e puno do ceco para induzir sépsia com a utilização de um cateter venoso central para fluidos, drogas e nutrientes administrados. Esta configuração experimental é reprodutível, permite estudar a fase prolongada da doença crítica e resulta numa taxa de mortalidade estável, por este meio simulando a situação clínica humana 1. Ligadura e pe...

doença crítica é um estado de doença em que a função de um ou mais sistemas de órgãos é dificultada na medida em que o paciente vai morrer, a menos que o suporte médica intensiva é administrado. Considerando que a causa inicial para a admissão na unidade de cuidados intensivos (UCI) pode variar, variando de trauma, cirurgia complicada, queimaduras, exacerbações da doença a sepsia, todos os pacientes criticamente doentes sofrem de danos celulares, causada por hipoperfusão, hipoxia e inflamação excessiva entre outros , o que leva à falência de órgãos. A maioria dos pacientes sobrevivem ao insulto agudo, mas uma fração importante dos pacientes não se recuperam imediatamente e precisa de tratamento intensivo prolongado. Eles estão em alto risco de morte devido a não resolver falência múltipla de órgãos. Além disso, a fase prolongada da doença crítica caracteriza-se por fraqueza muscular profundo e endócrino e alteração metabólica, dos quais a patogénese está actualmente completamente compreendida. vários rmodelos Odent estão sendo usados ​​no ambiente de pesquisa de cuidados intensivos. Os dois modelos mais utilizados são a administração exógena de lipopolissacarídeo (LPS) e ligação cecal e punção (CLP). Ambos os modelos foram desenvolvidos para mimetizar a fase aguda da septicemia, definida como uma disfunção de órgãos com risco de vida causada por uma resposta do hospedeiro desregulada à infecção, e uma das principais razões para a admissão na UCI em todo o mundo 1, 2. O modelo LPS tem várias desvantagens, uma vez que apenas transitoriamente afeta a liberação de citocinas e do estado hemodinâmico do animal 3. Ao contrário dos seres humanos, roedores também são particularmente resistentes à endotoxina e o uso de doses elevadas &#39;&#39; de endotoxina é necessário para a produção de hipotensão e mortalidade, por este meio aumentando ainda mais preocupações da validade deste método 4, 5. O outro modelo, a ligadura cecal e modelo punção (CLP)apresenta uma ligação de uma porção do ceco seguido por um punção de agulha através de-e-through. Este procedimento faz com que uma infecção abdominal polimicrobiana com danos no tecido, seguido por uma translocação das bactérias dentro do compartimento de sangue. Isto irá desencadear uma resposta inflamatória sistémica e o desenvolvimento de sepsia. O modelo CLP tem sido amplamente reconhecida como um modelo animal de doença aguda crítica, que reproduz as características principais de sépsis: hiperinflamação, vasodilatação, hipotensão e aumento do débito cardíaco 6, 7. No entanto, este modelo não permitir o estudo de falha não resolvendo de múltiplos órgãos, perda de massa muscular, e endócrino e alterações metabólicas, que são típicas para a fase prolongada da doença crítica. Além disso, recentemente a validade dos modelos de rato para doença grave têm sido questionadas, uma vez que resultados de modelos de mouse nem sempre pode ser traduzido para definir o humano 8, 9, 10. Uma possível explicação pode ser de que o tratamento de suporte que é fornecido para criticamente doentes pacientes humanos difere substancialmente do cuidado que é fornecida a ratinhos gravemente doentes. Portanto, para se assemelhar a configuração humano mais perto e para permitir a investigação da fase prolongada de doença grave, foi desenvolvido um modelo de ratinho que mimetiza a cuidados intensivos aguda como dado para os seres humanos, tais como grande administração de fluidos por via intravenosa e o tratamento com antibióticos, e que permite para administrar cuidados de suporte, a fim de sobreviver à fase prolongada da doença crítica, como suporte nutricional. Para este efeito, nós adaptamos o modelo de ratinho de sepsia induzida por CLP, sendo o padrão de ouro para sepsia, e colocado de um cateter venoso central, que permite a administração de fluidos, nutrição e drogas.

<table><tbody><tr><td>Buprenorphine</td><td>Ecuphar</td><td></td><td>Vetergesic 0.3 mg/mL</td></tr><tr><td>C57BL/6&amp;nbsp;</td><td>Janvier labs</td><td>C57BL/6JRj</td><td></td></tr><tr><td>colloids</td><td>Fresenius Kabi</td><td></td><td>Volulyte 6%</td></tr><tr><td>crystalloids</td><td>Baxter</td><td></td><td>Plasmalyte a viaflo</td></tr><tr><td>Ethilon 3.0</td><td>Ethicon</td><td>F3211</td><td></td></tr><tr><td>Imipenem</td><td>MSD</td><td></td><td>Tienam 500&amp;nbsp;mg powder for injection fluid</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Eurovet</td><td></td><td>Iso-vet</td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Eurovet</td><td></td><td>Nimatek 100 mg/mL</td></tr><tr><td>LocTite Super glue3 all plastics&amp;nbsp;</td><td>Rectavit</td><td>119818</td><td></td></tr><tr><td>Mersilk 3.0</td><td>Ethicon</td><td>L192</td><td></td></tr><tr><td>Mersilk 5.0</td><td>Ethicon</td><td>F682</td><td></td></tr><tr><td>Microrenathane .025&quot; O.D. x .012&quot; I.D.</td><td>Bioseb</td><td>MRE-025</td><td></td></tr><tr><td>olimel N7E</td><td>Baxter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PE10 - Polyethylene .011&quot; x .024&quot;&amp;nbsp;</td><td>Instech Solomon</td><td>BTPE-10</td><td></td></tr><tr><td>PE-50 tubing .023&quot; x.038&quot;</td><td>Instech Solomon</td><td>BTPE-50</td><td></td></tr><tr><td>Rodent Swivel 20 G</td><td>Bioseb</td><td>RS-20G&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ropivaca&amp;iuml;ne</td><td>Astrazenica</td><td></td><td>Naropin 2&amp;nbsp;mg/mL</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>VMD</td><td></td><td>Xylazine hydrochloride 2%</td></tr></tbody></table>

use of a central venous line for fluids, drugs and nutrient administration in a mouse model of critical illness

Este protocolo descreve um modelo de rato cateterizado centralmente de doença crítica prolongada. Nós combinar a ligação cecal e método punção para induzir sépsia com a utilização de um cateter venoso central para fluidos, drogas e nutrientes administrados para mimetizar a situação clínica humana. Pacientes criticamente doentes necessitam de apoio médico intensivo, a fim de sobreviver. Embora a maioria dos pacientes irá recuperar dentro de poucos dias, cerca de um quarto dos pacientes necessitam de tratamento intensivo e está em alto risco de morrer de não resolver a falha de múltiplos órgãos. Além disso, a fase prolongada da doença crítica caracteriza-se por fraqueza muscular profundo, e endócrino e alterações metabólicas, de que a patogénese está actualmente completamente compreendida. O modelo animal mais utilizado na pesquisa de cuidados intensivos é a ligadura e punção cecal modelo para induzir sepse. Este é um modelo muito reprodutíveis, com alterações inflamatórias e hemodinâmicos agudos semelhantes a setembro humanosis, que é projetado para estudar a fase aguda da doença crítica. No entanto, este modelo caracteriza-se por uma elevada letalidade, que é diferente da situação clínica humana, e não é desenvolvido para estudar a fase prolongada da doença crítica. Por isso, nós adaptamos a técnica de colocação de um cateter venoso central na veia jugular que nos permite administrar cuidados de suporte clinicamente relevante, para melhor imitar a situação clínica humana de doença grave. Este modelo do rato requer um extenso procedimento cirúrgico e tratamento intensivo diário dos animais, mas resulta em um modelo relevante da fase aguda e prolongada de doença crítica.

Ratinhos C57BL / 6 foram feitas criticamente doentes como descrito acima. Foram realizadas duas experiências para avaliar a sobrevivência pós-CLP até dois pontos de tempo: de sobrevivência até 5 dias (n = 15) e sobrevivência até ao dia 7 (n = 22) pós-CRE. As curvas de sobrevivência das duas experiências não foram significativamente diferentes (em comparação até o dia 5), ​​indicando a reprodutibilidade da configuração experimental. animais não sobreviventes foram en...

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Use of a Central Venous Line for Fluids, Drugs and Nutrient Administration in a Mouse Model of Critical Illness

This protocol describes a centrally catheterized mouse model of prolonged critical illness. We combine the cecal ligation and puncture method to induce sepsis with the use of a central venous line for fluids, drugs and nutrient administration to mimic the human clinical setting.

O uso de um cateter venoso central para fluidos, drogas e Administração de nutrientes em um modelo do rato da doença crítica

This protocol describes a centrally catheterized mouse model of prolonged critical illness. We combine the cecal ligation and puncture method to induce ...

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Research

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Hyperinsulinemic-euglycemic Clamps in Conscious, Unrestrained Mice

Type 2 diabetes is characterized by a defect in insulin action. The hyperinsulinemic-euglycemic clamp, or insulin clamp, is widely considered the "gold standard" method for assessing insulin action in vivo. During an insulin clamp, hyperinsulinemia is achieved by a constant insulin infusion. Euglycemia is maintained via a concomitant glucose infusion at a variable rate. This variable glucose infusion rate (GIR) is determined by measuring blood glucose at brief intervals throughout the experiment and adjusting the GIR accordingly. The GIR is indicative of whole-body insulin action, as mice with enhanced insulin action require a greater GIR. The insulin clamp can incorporate administration of isotopic 2[14C]deoxyglucose to assess tissue-specific glucose uptake and [3-3H]glucose to assess the ability of insulin to suppress the rate of endogenous glucose appearance (endoRa), a marker of hepatic glucose production, and to stimulate the rate of whole-body glucose disappearance (Rd).
The miniaturization of the insulin clamp for use in genetic mouse models of metabolic disease has led to significant advances in diabetes research. Methods for performing insulin clamps vary between laboratories. It is important to note that the manner in which an insulin clamp is performed can significantly affect the results obtained. We have published a comprehensive assessment of different approaches to performing insulin clamps in conscious mice1 as well as an evaluation of the metabolic response of four commonly used inbred mouse strains using various clamp techniques2. Here we present a protocol for performing insulin clamps on conscious, unrestrained mice developed by the Vanderbilt Mouse Metabolic Phenotyping Center (MMPC; URL: www.mc.vanderbilt.edu/mmpc). This includes a description of the method for implanting catheters used during the insulin clamp. The protocol employed by the Vanderbilt MMPC utilizes a unique two-catheter system3. One catheter is inserted into the jugular vein for infusions. A second catheter is inserted into the carotid artery, which allows for blood sampling without the need to restrain or handle the mouse. This technique provides a significant advantage to the most common method for obtaining blood samples during insulin clamps which is to sample from the severed tip of the tail. Unlike this latter method, sampling from an arterial catheter is not stressful to the mouse1. We also describe methods for using isotopic tracer infusions to assess tissue-specific insulin action. We also provide guidelines for the appropriate presentation of results obtained from insulin clamps.

The hyperinsulinemic-euglycemic clamp, or insulin clamp, is the gold standard for assessing insulin action in vivo. A method for performing insulin clamps in mice is described. This includes a method for arterial catheterization that permits experiments to be performed in conscious, unrestrained mice with minimal stress.

Hiperinsulinêmico euglicêmico-Clamps em Consciente, Ratos Unrestrained

Type 2 diabetes is characterized by a defect in insulin action. The hyperinsulinemic-euglycemic clamp, or insulin clamp, is widely considered the "gold ...

Medicina

Methods for Intravenous Self Administration in a Mouse Model

Animal models have been developed to study the reinforcing effects of drugs, including the intravenous self-administration (IVSA) paradigm. The advantages of using an IVSA paradigm to study the reinforcing properties of drugs of abuse such as cocaine include the fact that the drug is self-administered instead of experimenter-administered, the schedule of reinforcement can be altered, and accurate measurement of the quantities of drug consumed as well as the timing and pattern of IV injections can be obtained. Furthermore, the intravenous route of administration avoids potential confounds related to first pass metabolism or taste, and produces rapid increases in blood and brain drug levels. As outlined in this video, intravenous self-administration can be obtained without prior food restriction or prior drug training following careful catheter placement during surgery and meticulous daily catheter flushing and maintenance. Experimental procedures outlined in this paper include a description of animal housing and acclimation methods, operant training using sweetened milk solutions, and catheter implantation surgery.

The intravenous self-administration (IVSA) paradigm is considered to be the gold standard in examining the reinforcing properties of drugs of abuse in rodents. This manuscript outlines the experimental procedures and surgical techniques necessary to obtain reliable IVSA data. In particular, meticulous catheter implantation and maintenance are highlighted.

Métodos de auto-administração intravenosa em um modelo de camundongo

Animal models have been developed to study the reinforcing effects of drugs, including the intravenous self-administration (IVSA) paradigm. The advantages ...

Neurociência

Catheterization of the Carotid Artery and Jugular Vein to Perform Hemodynamic Measures, Infusions and Blood Sampling in a Conscious Rat Model

The success of a small animal model to study critical illness is, in part, dependent on the ability of the model to simulate the human condition. Intra-tracheal inoculation of a known amount of bacteria has been successfully used to reproduce the pathogenesis of pneumonia which then develops into sepsis. Monitoring hemodynamic parameters and providing standard clinical treatment including infusion of antibiotics, fluids and drugs to maintain blood pressure is critical to simulate routine supportive care in this model but to do so requires both arterial and venous vascular access. The video details the surgical technique for implanting carotid artery and common jugular vein catheters in an anesthetized rat. Following a 72 hr recovery period, the animals will be re-anesthetized and connected to a tether and swivel setup attached to the rodent housing which connects the implanted catheters to the hemodynamic monitoring system. This setup allows free movement of the rat during the study while continuously monitoring pressures, infusing fluids and drugs (antibiotics, vasopressors) and performing blood sampling.

Vascular accesses to measure hemodynamics, provide fluids and perform blood sampling are important to any small animal model study. We present a technique for implanting catheters into the carotid artery and the common jugular vein in an anesthetized rat for connecting to a system to perform monitoring, infusions and sampling.

Cateterismo da artéria carótida e jugular para executar as medidas hemodinâmicas, infusões e Sangue de amostragem em um Rat Consciente Modelo

The success of a small animal model to study critical illness is, in part, dependent on the ability of the model to simulate the human condition. ...

Monitoring of Systemic and Hepatic Hemodynamic Parameters in Mice

The use of mouse models in experimental research is of enormous importance for the study of hepatic physiology and pathophysiological disturbances. However, due to the small size of the mouse, technical details of the intraoperative monitoring procedure suitable for the mouse were rarely described. Previously we have reported a monitoring procedure to obtain hemodynamic parameters for rats. Now, we adapted the procedure to acquire systemic and hepatic hemodynamic parameters in mice, a species ten-fold smaller than rats. This film demonstrates the instrumentation of the animals as well as the data acquisition process needed to assess systemic and hepatic hemodynamics in mice. Vital parameters, including body temperature, respiratory&#160;rate&#160;and heart&#160;rate were recorded throughout the whole procedure. Systemic hemodynamic parameters consist of carotid artery pressure (CAP) and central venous pressure (CVP). Hepatic perfusion parameters include portal vein pressure (PVP), portal flow rate as well as the flow rate of the common hepatic artery (table 1). Instrumentation and data acquisition to record the normal values was completed within 1.5 h. Systemic and hepatic hemodynamic parameters remained within normal ranges during this procedure.
This procedure is challenging but feasible. We have already applied this procedure to assess hepatic hemodynamics in normal mice as well as during 70% partial hepatectomy and in liver lobe clamping experiments. Mean PVP after resection (n= 20), was 11.41&#177;2.94 cmH2O which was significantly higher (P&#60;0.05) than before resection (6.87&#177;2.39 cmH2O). The results of liver lobe clamping experiment indicated that this monitoring procedure is sensitive and suitable for detecting small changes in portal pressure and portal flow rate. In conclusion, this procedure is reliable in the hands of an experienced micro-surgeon but should be limited to experiments where mice are absolutely needed.

This film demonstrates how to acquire systemic and hepatic hemodynamics in mice. The whole monitoring includes acquisition of vital parameters, systemic blood pressure, central venous pressure, common hepatic artery flow rate, and portal vein pressure as well as the portal flow rate in mice.

Monitoramento da sistêmicas e hepática Hemodinâmica em Ratos

The use of mouse models in experimental research is of enormous importance for the study of hepatic physiology and pathophysiological disturbances. ...

Ensaio de trombose venosa otimizado em um modelo de câncer de camundongo usando clipes vasculares

Venous Thrombosis Assay in a Mouse Model of Cancer

This methodology paper highlights the surgical nuances of a rodent model of venous thrombosis, specifically in the context of cancer-associated thrombosis (CAT). Deep venous thrombosis is a common complication in cancer survivors and can be potentially fatal. The current murine venous thrombosis models typically involve a complete or partial mechanical occlusion of the inferior vena cava (IVC) using a suture. This procedure induces a total or partial stasis of blood and endothelial damage, triggering thrombogenesis. The current models have limitations such as higher variability in clot weights, significant mortality rate, and prolonged learning curve. This report introduces surgical refinements using vascular clips to address some of these limitations. Using a syngeneic colon cancer xenograft mouse model, we employed customized vascular clips to ligate the infrarenal vena cava. These clips allow residual lip space similar to a 5-0 polypropylene suture after IVC ligations. Mice with the suture method served as controls. The vascular clip method resulted in a consistent reproducible partial vascular occlusion and greater clot weights with less variability than the suture method. The larger clot weights, greater clot mass, and clot to the IVC luminal surface area were expected due to the higher pressure profile of the vascular clips compared to a 6-0 polypropylene suture. The approach was validated by gray scale ultrasonography, which revealed consistently greater clot mass in the infrarenal vena cava with vascular clips compared to the suture method. These observations were further substantiated with the immunofluorescence staining. This study offers an improved method to generate a venous thrombosis model in mice, which can be employed to deepen the mechanistic understanding of CAT and in translational research such as drug discovery.

Autor em destaque: Avançando na pesquisa de trombose associada ao câncer em modelos de roedores 

This article aims to present an optimized method for assessing venous thrombosis in a mouse cancer model, using vascular clips to achieve venous ligation. Optimization minimizes variability in thrombosis-related measurements and enhances relevance to human cancer-associated venous thrombosis.

Ensaio de Trombose Venosa em Modelo de Câncer em Camundongos

This methodology paper highlights the surgical nuances of a rodent model of venous thrombosis, specifically in the context of cancer-associated thrombosis ...

Pesquisa do câncer

Stenosis of the Inferior Vena Cava: A Murine Model of Deep Vein Thrombosis

Deep vein thrombosis (DVT) and its devastating complication, pulmonary embolism, are a severe health problem with high mortality. Mechanisms of thrombus formation in veins remain obscure. Lack of mobility (e.g., after surgery or long-haul flights) is one of the main factors leading to DVT. The pathophysiological consequence of the lack of mobility is blood flow stagnation in venous valves. Here, a model is described that mimics such flow disturbance as a thrombosis-driving factor. In this model, partial flow restriction (stenosis) in the inferior vena cava (IVC) is created. Closure of about 90% of the IVC lumen for 48 h results in development of thrombi structurally similar to those in humans. The similarities are: i) most of the thrombus volume is red, i.e., consists of red blood cells and fibrin, ii) presence of a white part (lines of Zahn), iii) non-denuded endothelial monolayer, iv) elevated plasma D-Dimer levels, and v) possibility to prevent thrombosis by low molecular weight heparin. Limitations include variable size of thrombi and the fact that a certain percentage of wild-type mice (0 - 35%) may not produce a thrombus. In addition to visual observation and measurement, thrombi may be visualized by non-invasive technologies, such as ultrasonography, which allows for monitoring the dynamics of thrombus development. At shorter time points (1 - 6 h), intravital microscopy may be applied to directly observe events (e.g., recruitment of cells to the vessel wall) preceding thrombus formation. Use of this method by several teams around the world has made it possible to uncover basic mechanisms of DVT initiation and identify potential targets that might be beneficial for its prevention.

We describe here stenosis in the inferior vena cava as a murine model of deep vein thrombosis. This model recapitulates blood flow restriction, one of the major triggers of venous thrombosis in humans.

Estenose da veia Cava Inferior: um modelo murino de trombose venosa profunda

Deep vein thrombosis (DVT) and its devastating complication, pulmonary embolism, are a severe health problem with high mortality. Mechanisms of thrombus ...

Imunologia e Infecção

Veno-Venous Extracorporeal Membrane Oxygenation in a Mouse

The use of extracorporeal membrane oxygenation (ECMO) has increased substantially in recent years. ECMO has become a reliable and effective therapy for acute as well as end-stage lung diseases. With the increase in clinical demand and prolonged use of ECMO, procedural optimization and prevention of multi-organ damage are of critical importance. The aim of this protocol is to present a detailed technique of veno-venous ECMO in a non-intubated, spontaneously breathing mouse. This protocol demonstrates the technical design of the ECMO and surgical steps. This murine ECMO model will facilitate the study of pathophysiology related to ECMO (e.g., inflammation,bleeding and thromboembolic events). Due to the abundance of genetically modified mice, the molecular mechanisms involved in ECMO-related complications can also be dissected.

Here we present a protocol describing the technique of veno-venous extracorporeal membrane oxygenation (ECMO) in a non-intubated, spontaneously breathing mouse. This murine model of ECMO can be effectively implemented in experimental studies of acute and end-stage lung diseases.

Oxigenação de membrana extracorpórea veno-venosa em um rato

The use of extracorporeal membrane oxygenation (ECMO) has increased substantially in recent years. ECMO has become a reliable and effective therapy for ...

Murine Model of Central Venous Stenosis using Aortocaval Fistula with an Outflow Stenosis

Central venous stenosis is an important entity contributing to arteriovenous fistula (AVF) failure. A murine AVF model was modified to create a partial ligation of the inferior vena cava (IVC) in the outflow of the fistula, mimicking central venous stenosis. Technical aspects of this model are introduced. The aorta and IVC are exposed, following an abdominal incision. The infra-renal aorta and IVC are dissected for proximal clamping, and the distal aorta is exposed for puncture. The IVC at the midpoint between the left renal vein and the aortic bifurcation is carefully dissected to place an 8-0 suture beneath the IVC. After clamping the aorta and IVC, an AVF is created by puncturing the infra-renal aorta through both walls into the IVC with a 25 G needle, followed by ligating a 22 G intra-venous (IV) catheter and IVC together. The catheter is then removed, creating a reproducible venous stenosis without occlusion. The aorta and IVC are unclamped after confirming primary hemostasis. This novel model of central vein stenosis is easy to perform, reproducible, and will facilitate studies on AVF failure.

An aortocaval fistula was created by puncturing the murine infra-renal aorta through both walls into the inferior vena cava and was followed by creation of a stenosis in its outflow via partial ligation of the inferior vena cava. This reproducible model can be used to study central venous stenosis.

Modelo murino de estenose venosa central usando fístula Aortocaval com estenose de saída

Central venous stenosis is an important entity contributing to arteriovenous fistula (AVF) failure. A murine AVF model was modified to create a partial ...

O uso de um cateter venoso central para fluidos, drogas e Administração de nutrientes em um modelo do rato da doença crítica

Resumo

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Hiperinsulinêmico euglicêmico-Clamps em Consciente, Ratos Unrestrained

Métodos de auto-administração intravenosa em um modelo de camundongo

Cateterismo da artéria carótida e jugular para executar as medidas hemodinâmicas, infusões e Sangue de amostragem em um Rat Consciente Modelo

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Ensaio de Trombose Venosa em Modelo de Câncer em Camundongos

Ensaio de Trombose Venosa em Modelo de Câncer em Camundongos

Ensaio de Trombose Venosa em Modelo de Câncer em Camundongos

Estenose da veia Cava Inferior: um modelo murino de trombose venosa profunda

Oxigenação de membrana extracorpórea veno-venosa em um rato

Modelo murino de estenose venosa central usando fístula Aortocaval com estenose de saída