Este protocolo é particularmente adequado para a tela genética de mutantes de Drosophila visualmente defeituosos. Isso porque permitem a detecção de pequenas anormalidades na fototransdução de Drosophila, particularmente nos níveis de fotopigment e funções relacionadas a pares de nível. Essa técnica é profunda in vivo, é fácil de executar e altamente robusta, permitindo a detecção de pequenas mudanças na atividade de proteínas de fototransdução.
Na minha opinião, consertar as moscas enquanto mantém a viabilidade é provavelmente a parte crítica deste método. Ligue o computador e abra o software Clampex. Ligue o amplificador e o gerador de pulso Master-8, depois ligue a lâmpada de xenônio e o controlador do obturador.
Ligue o puxador e coloque um capilar de vidro no puxador e puxe-o. Remova o capilar de vidro do puxador. Encha o capilar de vidro com solução de toque filtrado usando uma seringa de ponta alongada.
Insira o eletrodo do fio no capilar de vidro. Certifique-se de que a solução dentro do capilar esteja em contato com o fio de prata. Insira os suportes de eletrodos nos dois micromanipuladores de eletrodos.
Ligue a fonte de alimentação do ferro de solda. Defina a corrente para aproximadamente 2,25 ampere. Esta corrente deve aquecer o filamento de platina-irídio de 0,25 milímetros a aproximadamente 55 a 56 graus Celsius.
Coloque uma gota de cera com uma baixa temperatura de fusão no ferro de solda. Anestesiar as moscas dentro da garrafa. Despeje as moscas anestesiadas no recipiente adormecido, escolha uma mosca e cubra o resto das moscas com uma placa de Petri.
Segure cuidadosamente a mosca por suas asas usando uma pinça afiada e coloque-a no suporte de mosca. No suporte de mosca, coloque a mosca deitada de lado com as costas em direção à mão. Usando pinças, levante a mosca de suas asas e fixe suas asas no suporte de mosca usando o ferro de solda.
Conecte a mosca de volta à superfície do suporte com cera usando o ferro de solda. Abaixe a ponta do ferro de solda até o ponto de junção das pernas, depois derreta a cera para cobrir todas as pernas juntas. Coloque uma pequena gota de cera entre a cabeça e o pescoço na área do pescoço.
Coloque o suporte de mosca em uma gaiola de faraday escuro em um bloco de ímã e certifique-se de que a mosca está a aproximadamente cinco milímetros do final do guia de luz. Coloque o eletrodo de gravação acima do olho da mosca e o eletrodo do solo sobre a parte superior das costas da mosca usando os micromanipuladores. Em seguida, insira o eletrodo moído na parte de trás da mosca usando os micromanipuladores.
Insira o eletrodo de gravação na periferia externa do olho da mosca, de preferência usando os micro manipuladores. Feche a gaiola de faraday e desligue as luzes da sala para permitir que a adaptação escureça por cinco minutos. Insira os parâmetros a partir de uma duração de pulso de 500 metros por segundo, um intervalo de pulso de 60 segundos e o número de pulsos definidos para seis.
Para medir o PDA, ajuste o gerador de pulso Master-8 no modo TRAIN e, em seguida, dê um pulso de luz de cinco segundos de intensidade máxima usando um filtro laranja. Verifique a resposta de tensão. Substitua o filtro laranja por um filtro azul de banda larga e dê três pulsos de luz de 5 segundos em intensidade máxima.
Verifique a resposta de tensão. Espere pelo menos 60 segundos no escuro. Substitua o filtro azul pelo filtro laranja anterior.
Em seguida, dê dois pulsos de luz de 5 segundos com intervalos de 60 segundos. Verifique a resposta de tensão. Para medir o potencial ERP M, dê um pulso contínuo de luz azul até que uma resposta de tensão de estado estável seja alcançada.
Dê um breve flash de luz intenso de um comprimento de onda entre 350 e 700 nanômetros usando um filtro de passe de banda de 20 nanômetros. Em seguida, meça a amplitude máxima da fase M1 da resposta m-potencial, que reflete a absorção de metarhodopsin neste comprimento de onda específico no fotoequilíbrio. As respostas do PDA foram avaliadas para diferentes moscas mutantes.
Moscas do tipo selvagem mostraram uma despolarização saturada no escuro que apareceu como ERG negativo da córnea prolongada, após intensa estimulação da luz azul. As seguintes luzes azuis produziram pequenas respostas sobrepostas ao PDA, sem os transitórios ligados e desligados. Em moscas mutantes com biogênese de fotopigmentar anormal, como ninaE, a resposta de tensão retornou à linha de base após intensa estimulação da luz azul, e a resposta a uma luz azul adicional não foi suprimida e mostrou transitórios normais.
O ERP tipo selvagem da mosca é obtido pelo mesmo protocolo, mas um flash verde intenso é aplicado durante o PDA. Este flash verde provoca o ERP e suprimiu o PDA. O potencial M foi obtido pelo flash verde após a iluminação azul, mas não por um flash azul após a iluminação azul na mosca do tipo selvagem.
Este protocolo foi repetido em tipo selvagem, em fotopigment hypomorph mutante ninaE, e em mutante deficiente de fototransdução com níveis normais de fotopigment norpA. Os espectros de absorção relativa de rodopsina e metarhodopsina foram calculados a partir de medições fotométricas do espectro diferente e do espectro fotoequilibrium. É importante que a sobrevivência das moscas preste atenção à viscosidade da cera, abstendo-se do superaquecimento.
Este procedimento é adequado para a genética e através da triagem de mutantes visuais defeituosos. Métodos que isolam e identificam aleatoriamente mutações visuais podem facilitar a descoberta de novas proteínas e mecanismos envolvidos na fototransdução de Drosophila. O protocolo PDA possibilitou o isolamento de mecanismos visuais importantes e novos.
A participação provavelmente não teria sido descoberta ou mesmo antecipada de outra forma.
