Este trabalho foi apoiado pelo Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia do Canadá Discovery Grant RGPIN36481-08 para William G. Bendena.

1. Preparação de organismos experimentais <ol><li> Escolha 10 nemátopos encenados L4 por estirpe 24 h antes de iniciar o ensaio para garantir que os organismos sejam adultos jovens quando testados. Para cada mutante ou nematóide de controle testado, escolha 10 L4s (10 para o controle e 10 para o ensaio). <ol><li> Manter os organismos L4 usando métodos padrão 26 , 27 durante 24 h em placas de ágar padrão semeadas com OP50 Escherichia coli . Se os organismos forem perdidos durante as etapas de lavagem subsequentes, compense aumentando o tamanho da amostra inicial ( ou seja, coloque 20 vermes em vez de 10). Nota: O comportamento é um fenótipo indevidamente variável. Execute o método em triplicado para cada tensão em três dias separados. Inclua tensões de controle adicionais e condições para novas tensões, como destacado na seção de discussão. </li></ol></li><li> Imediatamente antes do ensaio, transferir orga experimentalNismos para uma placa de ágar sem bactérias e permitir que os nematóides se movam livremente durante 1 minuto para remover o excesso de bactérias. <ol><li> Se os organismos experimentais tiveram condições de contaminação durante as 24 h anteriores ao ensaio, descarte-os. </li></ol></li><li> Pipetar 1 mL de M9 na placa sem bactéria para lavar vermes em um tubo de microcentrífuga. </li><li> Centrifugar a 3.000 xg por 1 min. Worms deve formar uma pelota no fundo do tubo. Solução Aspirar M9 sem perturbar a pelota de sem-fim. Adicione 1 mL de M9 à pastilha de sem-fim, invertendo o tubo para misturar vermes com a solução. </li><li> Repita as etapas 1.4 mais três vezes. <ol><li> Se o excesso de bactéria foi inicialmente transferido com os vermes, repita por um total de 5 vezes. Nenhuma bactéria deve ser transferida para as placas de alimentação de cobre. Se o alimento for transferido para a placa de ensaio, ele irá interferir com a coleta precisa de dados. </li></ol></li><li> Após a lavagem final, aspirar o sobrenadante até 10081; L de M9 e a pele de sem-fim permanecem. Atenção: os comportamentos relacionados com a fome tornam-se evidentes após 30 min. Conseqüentemente, os vermes devem ser transferidos imediatamente da solução, uma vez que os passos de lavagem foram concluídos. </li></ol> 2. Preparação de placas de ensaio <ol><li> Prepare placas de agar NGM padrão dois dias antes do ensaio. <ol><li> Se as placas forem mantidas em um ambiente úmido, faça placas de ágar 3 dias antes do ensaio. Alternativamente, retire a tampa da placa por 3-6 h para garantir a secura adequada (se em um ambiente estéril). </li></ol></li><li> Com um marcador permanente espesso, faça uma linha na parte inferior da placa ao longo da borda externa e outra para formar uma barreira de linha média ( Figura 1 ). A barreira da linha média deve ser equidistante de cada borda da placa. Use uma régua para garantir medições precisas. Essas linhas servirão de guia ao transferir bactérias e a solução de cobre. Providenciou queE. coli é transferida antes da solução de cobre, essas linhas servirão como indicadores. </li><li> Placa de semente com 50 μL de OP50 E. coli em apenas um lado da barreira de cobre para criar um gramado uniforme ( Figura 2 ). A concentração bacteriana deve permanecer consistente em todos os ensaios; No entanto, pouca variabilidade foi observada em resposta a diferenças leves na concentração. <ol><li> Use as linhas marcadas na parte inferior da placa para garantir que as bactérias não entrem em contato com a solução de cobre. Desde que a solução de cobre alinhe a borda da placa e forme uma barreira de linha média, transfira a bactéria para que a solução de cobre não entre em contato com a fonte de alimento. </li></ol></li><li> Marque um segundo conjunto de placas e transfira-os não OP50 E. coli ( Figura 2 ). Essas placas servirão para avaliar o controle negativo. Essas placas também devem ter umMarcando em uma metade da placa para denotar a origem da transferência inicial. </li><li> Permitir que as bactérias se sectem, depois incubar as placas a 37 ° C durante a noite. Certifique-se de que os remendos bacterianos não sejam perturbados ao se transferir para uma incubadora ou sala de 37 ° C. Perturbações excessivas podem alterar a localização ou a forma do remendo de alimentos. </li></ol> 3. Ensaio de quimiotaxis <ol><li> Prepare uma solução de sulfato de cobre (II) 0,5 M antes da hora de início do ensaio. Desde que sejam utilizados 125 μL da solução por placa, amplie este volume dependendo do número de placas de ensaio utilizadas ( por exemplo, 5 placas de ensaio, 625 μL). </li><li> Pipetar 100 μL da solução de sulfato de cobre (II) na borda do ágar para criar uma barreira de cobre externa. O lado inferior marcado da placa deve servir de guia. </li><li> Pipetar 25 μL da solução de sulfato de cobre (II) para criar uma barreira da linha média. <ol><li> Certifique-se de que a solução de sulfato de cobre (II)Não entra em contato com o remendo bacteriano. Use uma técnica manchada, uma vez que a varredura pode afetar a locomoção devido a entalhes / arranhões no ágar. </li></ol></li><li> Deixe a solução de cobre secar na placa. O período de tempo pode variar dependendo das condições de placa e laboratório. Verifique visualmente a secura a cada 5 minutos após a transferência. Nota: A solução de cobre apresenta uma tonalidade azulada e é facilmente identificável. Use um lenço de laboratório para tomar levemente a solução perto da borda da placa para discernir a secura. </li><li> Pipetar 20 μL da pastilha de sem-fim do fundo do tubo na metade sem bactéria da placa de ensaio. <ol><li> Certifique-se de que 10 vermes são transferidos para a placa de ensaio. Se extras adicionais foram incluídos acidentalmente, remova-os escolhendo com óleo de halocarbono para garantir que nenhuma bactéria seja adicionada à placa. Cada ensaio deve ter um número consistente de nemátodos durante o ensaio. NOTA: se muito poucos vermes são transfErrado durante os ensaios, o aumento do tamanho da amostra inicial mitiga as perdas potenciais durante lavagens e transferências. </li></ol></li><li> Remova o excesso de M9 da placa com um tecido de laboratório. M9 não deve entrar em contato com a solução de sulfato de cobre (II). Cuidado: Certifique-se de que os vermes e a superfície do ágar permanecem inalterados ao executar esta etapa. Se usado com muita dureza, o tecido do laboratório pode criar entalhes na superfície de agar da placa e pode remover vermes. Worms acidentalmente removidos via KimWipe devem ser descartados. </li><li> Uma vez que a solução M9 foi removida e todos os vermes começaram os padrões de locomotriz não líquida, comece o cronômetro do ensaio. <ol><li> Otimamente, remova a solução M9 dentro de um min. O parâmetro essencial é a identificação da locomoção sinusoidal. Worms locomote de forma diferente, por exemplo , batendo em vez de sinusoidal, quando em líquido. Comece o teste de parada de ensaio uma vez que cada um dos órgãos experimentaisIsms pára de bater. </li></ol></li><li> Verifique as placas de ensaio a cada 30 min. <ol><li> Para as placas de ensaio com manchas bacterianas, marcar positivamente os organismos se atingirem o parto alimentar ao longo de um período de 4 h. Para as placas de controle negativo, marcar positivamente os organismos se eles cruzaram a barreira. </li></ol></li></ol>

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Não temos nada a revelar.

Este design de ensaio modifica o ensaio de ração alimentar 24 para incluir uma solução de cobre para criar uma barreira da linha média aversiva e ao redor da borda da placa para evitar a perda de nemátodos. Os organismos são testados quanto à sua capacidade de atravessar a barreira aversiva e alcançar um parto alimentar ao longo de um período de 4 h. No contexto de npr-9 (GF) , utilizamos este ensaio para avaliar como as condições de inanição podem a...

Caenorhabditis elegans tem sido usado como modelo para o estudo da neurobiologia por décadas devido à relativa facilidade na análise dos circuitos de um sistema nervoso composto de apenas 302 neurônios 1 . Desde que o organismo dependa de responder a pistas ambientais, grande parte do sistema nervoso é dedicado a regular a integração de sinais ambientais 2 . Apesar da simplicidade de seu sistema nervoso, C. elegans pode detectar e responder a diversos sinais ambientais, incluindo repelentes 3 , atrativos 4 , temperatura 5 e até mesmo umidade 6 . A incapacidade de integrar adequadamente os sinais do ambiente tem sido associada a uma série de distúrbios comportamentais e doenças neurodegenerativas em sistemas modelo de mamíferos 7- 9. Com uma gama de modelos disponíveis de doença neural<html> 10 em C. elegans e o desenvolvimento de telas farmacêuticas de nemátodos 11 , este organismo provou ser um sistema útil para o estudo da neurobiologia. Dada a disponibilidade de um conector de nemátodos cartografado 1 e mutações para quase todos os genes do genoma 12 do nematóide, nossa compreensão do sistema nervoso do nematóide e, por extensão, a nossa própria, é parcialmente limitada pelo desenho de ensaios criativos apropriados. Uma série de ensaios de quimiotaxia foram desenvolvidos ao longo dos últimos 40 anos para avaliar a resposta de nematóides a diversos estímulos aversivos 3 , 4 , 13 , 14 , 15 . A experimentação inicial envolveu a introdução de um estímulo ambiental agudo enquanto um único verme vagava em uma placa de ágar= &quot;Xref&quot;&gt; 3 , 14 , 16 . Mudanças imediatas nas respostas locomotrizas foram registradas. Por exemplo, o octanol injetável volátil pode ser aplicado a um cabelo e flutuou na frente do nariz de um nematóide para estimular o início da locomoção para trás em vermes selvagens 17 . Ensaios mais complexos também foram desenvolvidos para incorporar variáveis ​​múltiplas como meio de avaliar a escolha comportamental 18 . Uma variação deste ensaio implica o uso de uma solução de cobre para criar uma barreira da linha média aversiva 4 . Um atrativo, a saber, diacetil, foi colocado em um lado da barreira química com os vermes transferidos para fora da fonte de diacetilo. Worms defeituoso para as respostas de aversão ao cobre imediatamente atravessou a barreira para atingir o diacetil, enquanto que as vermes do tipo selvagem foram inicialmente repelidas pela barreira. As respostas foram marcadas quando os vermes se aproximaram pela barreira de cobreSem observações de longo prazo. Quando os vermes são avaliados depois de sofrerem condições de fome, sua sensibilidade aos estímulos ambientais diminui 19 . Quando o octanol químico aversivo é conduzido na frente do nariz dos nematóides, os organismos de tipo selvagem estimulam o movimento para trás dentro de 3 a 5 s quando em alimentos. Após estes organismos terem sido removidos dos alimentos durante 10 min, eles apresentam uma resposta tardia de 8-10 s 20 . Assim, com o aumento da fome, os nemátodos exibem uma resposta aversiva diminuída aos sinais ambientais prejudiciais, uma vez que a busca de alimentos se torna mais essencial para a sobrevivência. Por outro lado, os nemátodos que exageram o receptor neuropéptido 9 ( npr-9) , não respondem ao octanol sobre ou fora dos alimentos e apresentam incapacidade de responder a uma série de estímulos aversivos 21 . Esses organismos npr-9 (GF) também não modulam sua freqüência de reversão na presença de alimentos, mas podemInverter em resposta a estímulos tácteis agressivos, indicando que eles são capazes de locomoção para trás 21 . Nós também avaliamos os mutantes npr-9 (LF), dado que eles exibem uma freqüência de reversão anormalmente diminuída dos alimentos, mas podem modular seu comportamento na presença de alimentos 21 . O acasalamento do estado nutricional do sem-fim com a introdução de estímulos externos agudos ajudou a elucidar os mecanismos pelos quais uma via relacionada ao alimento pode modular amplamente as vias de sinalização sensorial 22 , 23 . A presença de alimentos no ambiente de nemátodos também foi usada para avaliar respostas de retirada de etanol 24 . Neste experimento, os vermes foram incubados em diferentes concentrações de etanol e depois foram colocados em uma placa de ágar com um remendo de alimento conhecido como &quot;ensaio de raça alimentar&quot;. O parto de comida foi colocado em uma borda da placa enquanto os nematóides wAntes da distância da fonte de comida. A retirada de etanol foi avaliada medindo a duração do tempo necessário para que os vermes alcancem o remendo de alimentos. Este ensaio de aversão de cobre com base em nutrientes baseia-se no ensaio da raça alimentar para integrar variáveis ​​ambientais adicionais, nomeadamente alimentos e cobre, ao mesmo tempo que avaliam as mudanças comportamentais ao longo do tempo. Esta é uma adaptação de um protocolo de uso comum em toda a comunidade C. elegans 4 . Este protocolo tem sido utilizado para avaliar respostas aversivas e a detecção de alimentos ao longo de um período de quatro horas 21 . Uma vez que os comportamentos de fome de exibição de vermes após 30 minutos de privação de alimentos 25 , também podemos avaliar como as mudanças no estado nutricional podem influenciar as respostas ambientais. As condições deste ensaio medem como os organismos experimentais alteram a capacidade de resposta aos estímulos aversivos ao longo do tempo, portanto, avalia as mudanças comportamentais comoOs organismos progridem para um estado de fome (e continuam as medidas de fome prolongada). Uma vez que os animais npr-9 (GF) não alteram seu comportamento em resposta a alimentos ou muitas pistas aversivas, buscamos identificar se esses déficits comportamentais persistiriam no contexto da fome. Em última análise, este design de ensaio foi formulado para avaliar especificamente os mutantes npr-9 (GF), mas pode ser ainda adaptado para caracterizar novas variedades.

<table><tbody><tr><td>M9 Solution [3 g KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 6 g Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O to 1 litre. Autoclave to sterilize before use.]</td><td></td><td></td><td>Produced in lab</td></tr><tr><td>Cupric Sulfate</td><td>Sigma</td><td>C-1297</td><td>Use water to appropriately suspend to a concentration of 0.5M</td></tr></tbody></table>

a caenorhabditis elegans nutritional-status based copper aversion assay

Para garantir a sobrevivência, os organismos devem ser capazes de evitar habitats desfavoráveis, garantindo uma fonte consistente de alimentos. Caenorhabditis elegans alteram seus padrões de locomotriz após a detecção de diversos estímulos ambientais e podem modular seu conjunto de respostas comportamentais em resposta a condições de fome. Os nemematódios exibem tipicamente uma resposta aversiva diminuída quando removidos de uma fonte de alimento durante mais de 30 min. A observação de mudanças comportamentais em resposta a um estado nutricional em mudança pode fornecer informações sobre os mecanismos que regulam a transição de um estado bem alimentado para um estado de fome. Nós desenvolvemos um ensaio que mede a capacidade de um nematóide de atravessar uma barreira aversiva ( isto é, cobre) e chegar a uma fonte de alimento durante um período prolongado de tempo. Este protocolo baseia-se no trabalho anterior, integrando múltiplas variáveis ​​de forma a permitir a coleta contínua de dados à medida que os organismos se deslocam para umaN condição cada vez mais fome. Além disso, este ensaio permite um aumento do tamanho da amostra para que populações maiores de nemátodos possam ser avaliadas simultaneamente. Os organismos defeituosos para a capacidade de detectar ou responder ao cobre imediatamente atravessam a barreira química, enquanto os nemátodos de tipo selvagem são inicialmente repelidos. À medida que os vermes de tipo selvagem estão cada vez mais famintos, eles começam a atravessar a barreira e chegar à fonte de alimento. Nós projetamos este ensaio para avaliar um mutante incapaz de responder a diferentes pistas ambientais, incluindo a sensação de alimentos ou a detecção de produtos químicos aversivos. Quando avaliados através deste protocolo, os organismos defeituosos atravessaram imediatamente a barreira, mas também foram incapazes de detectar uma fonte de alimento. Portanto, esses mutantes atravessam repetidamente a barreira química apesar de terem chegado temporariamente a uma fonte de alimento. Este ensaio pode facilmente testar populações de vermes para avaliar potenciais defeitos de via relacionados à aversão e à fome.

Utilizamos o tipo selvagem (N2), npr-9 (tm1652) e uma tensão de supressão npr-9 , ou seja , npr-9 (GF) (IC836 - npr-9 :: npr-9; sur-5 :: gfp; odr -1 :: rfp), para avaliar as respostas à fome e à aversão ao cobre. Os organismos de tipo selvagem são capazes de detectar e responder à barreira de cobre aversiva, enquanto os mutantes npr-9 (GF) não iniciam uma resposta aversiva ao cobre ao longo do ensaio <sup class="xref"...

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A Caenorhabditis elegans Nutritional-status Based Copper Aversion Assay

UMA<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Ensaio de Aversão ao Cobre Baseado em Status Nutricional

Aqui, apresentamos um ensaio específico de Caenorhabditis elegans projetado para avaliar mudanças no comportamento de aversão ao cobre e a capacidade de localizar uma fonte de alimento comum, à medida que o organismo progride de um estado nutricional bem alimentado para morrer de fome.

To ensure survival, organisms must be capable of avoiding unfavorable habitats while ensuring a consistent food source. Caenorhabditis elegans alter their ...

a-caenorhabditis-elegans-nutritional-status-based-copper-aversion

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Caenorhabditis elegans Nutritional-status Based Copper Aversion Assay

6.5K visualizações.  Queen's University.  Aqui, apresentamos um ensaio específico de Caenorhabditis elegans projetado para avaliar mudanças no comportamento de aversão ao cobre e a capacidade de localizar uma fonte de alimento comum, à medida que o organismo progride de um estado nutricional bem alimentado para morrer de fome. 

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Automated Analysis of a Nematode Population-based Chemosensory Preference Assay

The nematode, Caenorhabditis elegans' compact nervous system of only 302 neurons underlies a diverse repertoire of behaviors. To facilitate the dissection of the neural circuits underlying these behaviors, the development of robust and reproducible behavioral assays is necessary. Previous C. elegans behavioral studies have used variations of a "drop test", a "chemotaxis assay", and a "retention assay" to investigate the response of C. elegans to soluble compounds. The method described in this article seeks to combine the complementary strengths of the three aforementioned assays. Briefly, a small circle in the middle of each assay plate is divided into four quadrants with the control and experimental solutions alternately placed. After the addition of the worms, the assay plates are loaded into a behavior chamber where microscope cameras record the worms' encounters with the treated regions. Automated video analysis is then performed and a preference index (PI) value for each video is generated. The video acquisition and automated analysis features of this method minimizes the experimenter's involvement and any associated errors. Furthermore, minute amounts of the experimental compound are used per assay and the behavior chamber's multi-camera setup increases experimental throughput. This method is particularly useful for conducting behavioral screens of genetic mutants and novel chemical compounds. However, this method is not appropriate for studying stimulus gradient navigation due to the close proximity of the control and experimental solution regions. It should also not be used when only a small population of worms is available. While suitable for assaying responses only to soluble compounds in its current form, this method can be easily modified to accommodate multimodal sensory interaction and optogenetic studies. This method can also be adapted to assay the chemosensory responses of other nematode species.

We present a behavior recording setup and protocol that enables automated analysis of the nematode, Caenorhabditis elegans' preference for soluble compounds in a population-based assay. This article describes the construction of a behavior chamber, the behavioral assay protocol, and video analysis software usage.

Análise automatizada de um ensaio de preferência quimiossensorial baseado na população de um nematodo

The nematode, Caenorhabditis elegans' compact nervous system of only 302 neurons underlies a diverse repertoire of behaviors. To facilitate the dissection ...

Comportamento

A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans

Applying toxicity testing of chemicals in higher order organisms, such as mice or rats, is time-consuming and expensive, due to their long lifespan and maintenance issues. On the contrary, the nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) has advantages to make it an ideal choice for toxicity testing: a short lifespan, easy cultivation, and efficient reproduction. Here, we describe a protocol for the automatic phenotypic profiling of C. elegans in a 384-well plate. The nematode worms are cultured in a 384-well plate with liquid medium and chemical treatment, and videos are taken of each well to quantify the chemical influence on 33 worm features. Experimental results demonstrate that the quantified phenotype features can classify and predict the acute toxicity for different chemical compounds and establish a priority list for further traditional chemical toxicity assessment tests in a rodent model.

A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans

A quantitative method has been developed to identify and predict the acute toxicity of chemicals by automatically analyzing the phenotypic profiling of Caenorhabditis elegans. This protocol describes how to treat worms with chemicals in a 384-well plate, capture videos, and quantify toxicological related phenotypes.

Um ensaio de alta produtividade para a predição da toxicidade química por Automated Caracterização fenotípica de Caenorhabditis elegans

Applying toxicity testing of chemicals in higher order organisms, such as mice or rats, is time-consuming and expensive, due to their long lifespan and ...

Ambiente

Ensaio de alto rendimento para medir a ingestão de alimentos e a expectativa de vida de Caenorhabditis elegans

Quantifying Food Intake in Caenorhabditis elegans by Measuring Bacterial Clearance

Feeding is an essential biological process for an organism&#39;s growth, reproduction, and survival. This assay aims to measure the food intake of Caenorhabditis elegans&#160;(C. elegans), an important parameter when studying the genetics of aging or metabolism. In most species, feeding is determined by measuring the difference between the amount of food provided and the amount left after a given time interval. The method presented here uses the same strategy to determine the feeding of C. elegans. It measures the amount of bacteria, the food source of C. elegans, cleared within 72 h. This method uses 96-well microtiter plates and has allowed the screening of hundreds of drugs for their ability to modulate food intake at a speed and depth not possible in other animal models. The strength of this assay is that it allows to measure feeding and lifespan simultaneously and directly measures the disappearance of food and, thus, is based on the same principles used for other organisms, facilitating species-to-species comparison.

Autor em destaque: Explorando a relação entre lipotoxicidade e ICFEP 

This protocol describes an assay to quantify Caenorhabditis elegans feeding rate based on measuring the clearance of bacteria in liquid culture.

Quantificando a ingestão de alimentos em Caenorhabditis elegans medindo a depuração bacteriana

Feeding is an essential biological process for an organism&#39;s growth, reproduction, and survival. This assay aims to measure the food intake of ...

An Assay for Measuring the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans

Alcohol use disorders are a significant public health concern, for which there are few effective treatment strategies. One difficulty that has delayed the development of more effective treatments is the relative lack of understanding of the molecular underpinnings of the effects of ethanol on behavior. The nematode, Caenorhabditis elegans (C.&#160;elegans), provides a useful model in which to generate and test hypotheses about the molecular effects of ethanol. Here, we describe an assay that has been developed and used to examine the roles of particular genes and environmental factors in behavioral responses to ethanol, in which locomotion is the behavioral output. Ethanol dose-dependently causes an acute depression of crawling on an agar surface. The effects are dynamic; animals exposed to a high concentration demonstrate an initial strong depression of crawling, referred to here as initial sensitivity, and then partially recover locomotion speed despite the continued presence of the drug. This ethanol-induced behavioral plasticity is referred to here as the development of acute functional tolerance. This assay has been used to demonstrate that these two phenotypes are distinct and genetically separable. The straightforward locomotion assay described here is suitable for examining the effects of both genetic and environmental manipulations on these acute behavioral responses to ethanol in C.&#160;elegans.

An Assay for Measuring the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans

C. elegans is a useful model for studying the effects of ethanol on behavior. We present a behavioral assay that quantifies the effects of ethanol on the locomotion speed of crawling worms; both initial sensitivity and the development of acute functional tolerance to ethanol can be measured with this assay.

Um ensaio para medir os efeitos do etanol sobre a velocidade de Locomotion<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Alcohol use disorders are a significant public health concern, for which there are few effective treatment strategies. One difficulty that has delayed the ...

Neurociência

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Biologia

Caenorhabditis elegans as a Model System for Discovering Bioactive Compounds Against Polyglutamine-Mediated Neurotoxicity

Age-related misfolding and aggregation of pathogenic proteins are responsible for several neurodegenerative diseases. For example, Huntington&#39;s disease (HD) is principally driven by a CAG nucleotide repeat that encodes an expanded glutamine tract in huntingtin protein. Thus, the inhibition of polyglutamine (polyQ) aggregation and, in particular, aggregation-associated neurotoxicity is a useful strategy for the prevention of HD and other polyQ-associated conditions. This paper introduces generalized experimental protocols to assess the neuroprotective capacity of test compounds against HD using established polyQ transgenic Caenorhabditis elegans models. The AM141 strain is chosen for the polyQ aggregation assay as an age-associated phenotype of discrete fluorescent aggregates can be easily observed in its body wall at the adult stage due to muscle-specific expression of polyQ::YFP fusion proteins. In contrast, the HA759 model with strong expression of polyQ-expanded tracts in ASH neurons is used to examine neuronal death and chemoavoidance behavior. To comprehensively evaluate the neuroprotective capacity of target compounds, the above test results are ultimately presented as a radar chart with profiling of multiple phenotypes in a manner of direct comparison and direct viewing.

Caenorhabditis elegans as a Model System for Discovering Bioactive Compounds Against Polyglutamine-Mediated Neurotoxicity

Here, we present a protocol to assess the neuroprotective activities of test compounds in Caenorhabditis elegans, including polyglutamine aggregation, neuronal death, and chemoavoidance behavior, as well as an exemplary integration of multiple phenotypes.

Caenorhabditis elegans como um sistema modelo para descobrir compostos bioativos contra neurotoxicidade mediada por poliglutamina

Age-related misfolding and aggregation of pathogenic proteins are responsible for several neurodegenerative diseases. For example, Huntington&#39;s ...

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic human disorders, including cardiovascular and neurodegenerative diseases, diabetes, aging, and cancer. Therefore, it is important to study oxidative stress not only in cell systems but also using whole organisms. C. elegans is an attractive model organism to study the genetics of oxidative stress signal transduction pathways, which are highly evolutionarily conserved.
Here, we provide a protocol to measure oxidative stress resistance in C. elegans in liquid. Briefly, ROS-inducing reagents such as paraquat (PQ) and H2O2 are dissolved in M9 buffer, and solutions are aliquoted in the wells of a 96 well microtiter plate. Synchronized L4/young adult C. elegans animals are transferred to the wells (5-8 animals/well) and survival is measured every hour until most worms are dead. When performing an oxidative stress resistance assay using a low concentration of stressors in plates, aging might influence the behavior of animals upon oxidative stress, which could lead to an incorrect interpretation of the data. However, in the assay described herein, this problem is unlikely to occur since only L4/young adult animals are being used. Moreover, this protocol is inexpensive and results are obtained in one day, which renders this technique attractive for genetic screens. Overall, this will help to understand oxidative stress signal transduction pathways, which could be translated into better characterization of oxidative stress-associated human disorders.

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

C. elegans is an attractive model organism to study signal transduction pathways involved in oxidative stress resistance. Here we provide a protocol to measure oxidative stress resistance of C. elegans animals in liquid phase, using several oxidizing agents in 96 well plates.

Medição de resistência de Estresse Oxidativo<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Em placas de 96 poços de microtitulação

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic ...

Long-Term Culture of Individual Caenorhabditis elegans on Solid Media for Longitudinal Fluorescence Monitoring and Aversive Interventions

Caenorhabditis elegans are widely used to study aging biology. The standard practice in C. elegans aging studies is to culture groups of worms on solid nematode growth media (NGM), allowing the efficient collection of population-level data for survival and other physiological phenotypes, and periodic sampling of subpopulations for fluorescent biomarker quantification. Limitations to this approach are the inability to (1) follow individual worms over time to develop age trajectories for phenotypes of interest and (2) monitor fluorescent biomarkers directly in the context of the culture environment. Alternative culture approaches use liquid culture or microfluidics to monitor individual animals over time, in some cases including fluorescence quantification, with the tradeoff that the culture environment is contextually distinct from solid NGM. The WorMotel is a previously described microfabricated multi-well device for culturing isolated worms on solid NGM. Each worm is maintained in a well containing solid NGM surrounded by a moat filled with copper sulfate, a contact repellent for C. elegans, allowing longitudinal monitoring of individual animals. We find copper sulfate insufficient to prevent worms from fleeing when subjected to aversive interventions common in aging research, including dietary restriction, pathogenic bacteria, and chemical agents that induce cellular stress. The multi-well devices are also molded from polydimethylsiloxane, which produces high background artifacts in fluorescence imaging. This protocol describes a new approach for culturing isolated roundworms on solid NGM using commercially available polystyrene microtrays, originally designed for human leukocyte antigen (HLA) typing, allowing the measurement of survival, physiological phenotypes, and fluorescence across the lifespan. A palmitic acid barrier prevents worms from fleeing, even in the presence of aversive conditions. Each plate can culture up to 96 animals and easily adapts to a variety of conditions, including dietary restriction, RNAi, and chemical additives, and is compatible with automated systems for collecting lifespan and activity data.

Long-Term Culture of Individual Caenorhabditis elegans on Solid Media for Longitudinal Fluorescence Monitoring and Aversive Interventions

Here, we present a protocol to culture isolated individual nematodes on solid media for lifelong physiological parameter tracking and fluorescence quantification. This culture system includes a palmitic acid barrier around single-worm wells to prevent animals from fleeing, allowing the use of aversive interventions, including pathogenic bacteria and chemical stressors.

Cultura de Longo Prazo de Caenorhabditis elegans Individuais em Meio Sólido para Monitoramento Longitudinal de Fluorescência e Intervenções Aversivas

Caenorhabditis elegans are widely used to study aging biology. The standard practice in C. elegans aging studies is to culture groups of worms on solid ...

UMA

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Análise automatizada de um ensaio de preferência quimiossensorial baseado na população de um nematodo

Um ensaio de alta produtividade para a predição da toxicidade química por Automated Caracterização fenotípica de Caenorhabditis elegans

Quantificando a ingestão de alimentos em Caenorhabditis elegans medindo a depuração bacteriana

Quantificando a ingestão de alimentos em Caenorhabditis elegans medindo a depuração bacteriana

Quantificando a ingestão de alimentos em Caenorhabditis elegans medindo a depuração bacteriana

Um ensaio para medir os efeitos do etanol sobre a velocidade de Locomotion

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Caenorhabditis elegans como um sistema modelo para descobrir compostos bioativos contra neurotoxicidade mediada por poliglutamina

Medição de resistência de Estresse Oxidativo

Cultura de Longo Prazo de Caenorhabditis elegans Individuais em Meio Sólido para Monitoramento Longitudinal de Fluorescência e Intervenções Aversivas