Reconhecemos que o financiamento do Conselho Europeu de investigação (7. º PQ/260916), a Alexander von Humboldt-Stiftung (Sofja Kovalevskaja) e a Deutsche Forschungsgemeinschaft (DE1951 e SFB889).

Todas as experiências com animais aqui descritas foram realizadas em conformidade com as orientações para o bem-estar animal alemão.
Nota: A linha do tempo e as etapas principais do protocolo são ilustradas na Figura 1.
1. preparações
<ol><li>
Prepare as seguintes soluções.
	<ol>
<li>Preparar DMEM + para cultivo poligonais astrócitos MD: DMEM com 10% FCS, 100 de U de penicilina e estreptomicina 100 de µ g/mL.</li>
		<li>Prepare-se para cultivo astrócitos estrelados NB + H: neurobasal médio com 5 ng/mL HBEGF, 1 x suplemento B-27, 1 suplemento de glutamina x, penicilina de U 100 e 100 estreptomicina µ g/mL. Nota: Alíquotas de altas concentrações de HBEGF podem ser preparadas e armazenadas a-20 ° C a ser adicionado ao meio, sempre que necessário.</li>
		<li>Prepare o suporte de dissecação (10 mM HEPES em HBSS).</li>
		<li>Prepare alíquotas de 6-7 mL de 0,05% do trypsin-EDTA e 6-7 mL 0,25% do trypsin-EDTA em tubos de 15 mL. Estas podem ser armazenadas a-20 ° C e descongeladas em banho maria a 37 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>O dia antes de começar o protocolo, casaco pratos de cultura de tecidos tratados de 10 cm com 5 mL de 0,04% o polyethylenimine (PEI) cada.</li>
	<li>No dia seguinte, retire o PEI e lavar a louça com água deionizada, destilada duas vezes. Adicionar 12 mL de DMEM + para cada placa e pre-equilibrar na incubadora a 37 ° C e 5% de CO2 pelo menos 30 min antes de chapear pilhas.</li>
	<li>Preparar a área de dissecação: em uma capa de dissecação de fluxo laminar, coloque dois pratos de Petri de 10 cm preenchido com meio de dissecação no gelo. Para cada área do cérebro a ser isolado (por exemplo, córtex, hipocampo), prepare um 15-tubo preenchido com 14 mL de meio de dissecação e manter no gelo. Pulverizador ferramentas de dissecação (tesouras bem, Dumont #3 e #5 pinças) com 70% de etanol e coloque ao lado do microscópio de dissecação do capuz.</li>
</ol>2. o rato ou dissecação do cérebro de rato
Nota: Ambos os ratos e ratazanas podem ser usadas. Mais velho do P8 também podem ser utilizados animais (nós testamos até P12), mas remover as meninges se tornará cada vez mais difícil. Além disso, o rendimento da célula e a saúde vão diminuir, desde que as células do cérebro de animais mais velhos serão formaram processos intrincados e conexões que podem quebrar durante a dissociação do tecido, levando à morte celular aumentada. Preparações corticais são descritas aqui, mas outras regiões do cérebro também podem ser usados.
<ol><li>Coloque 0,05% do trypsin-EDTA em banho maria a 37 ° C.</li>
	<li>Eutanásia em animais (ratos grávidos para E19 filhotes ou animais P0-P8) levantando lentamente a concentração de CO2 e isolar o cérebro. As etapas a seguir requerem técnica estéril.</li>
	<li>
Se trabalhar com tecido embrionário, primeiro remova os embriões no útero e abra os sacos embrionários, então imediatamente cortou a cabeça com uma tesoura. Quando todas as cabeças são cortadas, transferi-los em meio de dissecação pre-cooled.
	<ol>
<li>Uma vez que as cabeças estão submersos no meio, abra a pele e o crânio (os dois são muito moles em animais jovens) com fórceps e pitada do cerebelo. Alavanca com cuidado o resto do cérebro acima e do crânio. Nota: Dois a quatro E19 embriões produzem tecido suficiente para pelo menos oito pratos de 10cm de astrócitos corticais chapeados em 500.000 células por prato no dia de dissecação.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para filhotes recém-nascidos ou mais velhos, cortou a cabeça com uma tesoura e isolar o cérebro medialmente cortando a pele em uma linha reta na parte de trás da cabeça até a ponta do nariz. Puxe a pele de lado e cuidadosamente corte o crânio esquerdo e direito, em seguida, elevador osso do crânio. Cortar o cerebelo e alavanca o resto do cérebro acima e do crânio. Nota: Dois ou três filhotes de P0-P8 produzem tecido suficiente para pelo menos oito pratos de 10cm de astrócitos corticais chapeados em 500.000 células por prato no dia de dissecação.</li>
	<li>Separe o córtex da estrutura subjacente do mesencéfalo. Coloque a pinça dentro da fissura longitudinal entre os hemisférios, mova a pinça entre o córtex e mesencéfalo estruturas de um hemisfério (perpendicular à fissura longitudinal) para beliscar cada hemisfério livre.</li>
	<li>Usando a pinça, remover todas as meninges de cada hemisfério (e seu hipocampo), em seguida, separar o hipocampo. Se hippocampal astrócitos são necessários, mova cada hipocampo para um tubo de 15 mL cheio com 14 mL de meio de dissecação no gelo.</li>
	<li>Remova mais áreas do córtex de cada hemisfério se regiões específicas são necessárias (por exemplo, o córtex frontal). Corte qualquer tecido cortical a ser usado para a geração de astrócitos em pedaços não maiores que 1 mm3. Recolha todos os pedaços de tecido cortical em um tubo de 15 mL separado cheio com meio de dissecação no gelo.</li>
</ol>3. dissociação e digestão do tecido
<ol><li>Uma vez que todas as peças de tecido são coletadas, esperar por eles para resolver a parte inferior do tubo e, em seguida, Aspire tanto médio quanto possível.</li>
	<li>Adicionar 2-3 mL de 0,05% do trypsin-EDTA usando uma pipeta sorológica e incubar os tubos num banho de água de 37 ° C por 20 min. Nota: Versão do trypsin-EDTA todos da pipeta rapidamente para misturar as peças de tecido e deixar repousar novamente.</li>
	<li>Aspire cuidadosamente com o tripsina-EDTA, deixando pedaços de tecido em como pouco líquido quanto possível, na parte inferior do tubo.</li>
	<li>Adicione 5 mL de meio de dissecação pre-cooled para lavar fora o restante do trypsin-EDTA. Pipetar para o lado da parte superior do tubo para alcançar misturando as peças de tecido.</li>
	<li>Aspire o meio de dissecação e deixar os pedaços de tecido em como pouco líquido quanto possível. Repita essa etapa de lavagem com meio pre-cooled dissecação mais duas vezes.</li>
	<li>Após a etapa de lavagem final, adicione 1 mL de DMEM + (aquecido à temperatura) usando uma ponta da pipeta 1.000 µ l e triture o tecido pipetando cima e para baixo sem a introdução de bolhas. Nota: É importante evitar a produção de bolhas, como isso pode mudar o pH da solução, para que os astrócitos são bastante sensíveis.</li>
	<li>Coloque um filtro de célula de 100 µm na abertura de um tubo de 50 mL e pre-molhado o filtro com 4,5 mL de DMEM pre-cooled +.</li>
	<li>Pipetar 1 mL da suspensão de tecido dissociado no filtro da célula e adicionar outro 4,5 mL pre-refrigeração DMEM + lavar as células através do filtro de célula.</li>
</ol>4. célula chapeamento para enriquecimento do Astrocyte por passagem
<ol><li>Conte as células, por exemplo, por diluir 10 µ l da suspensão celular com 10 µ l trypan azul e pipetagem a mistura para um hemocytometer.</li>
	<li>Placa de 500.000 células em 12 mL DMEM + por prato de 10 cm. Nota: DMEM + é útil para o crescimento de hamartomas, mais ainda do que para os neurônios ou microglia. Durante a agitação, as forças físicas atuando sobre as lamelas de vidro dentro de poços são muito mais fortes do que aqueles atuando sobre os pratos de 10 cm (sem lamelas). Se as células são sacudidas em placas de 24-bem, eles se tornam insalubres ou morrem. Só placa astrócitos em placas de 24 poços após agitação.</li>
	<li>Manter as culturas celulares na incubadora a 37 ° C e 5% de CO2 por sete dias.</li>
	<li>No dia 6, no dia anterior a tremer e a passagem de células, prepare as placas de cultura de PEI-revestido, conforme descrito na etapa 5.</li>
</ol>5. as células de passagem
<ol><li>
No dia anterior passagem, revestimento placas de cultura celular com PEI de 0,04%.
	<ol>
<li>Por imunocitoquímica, transdução viral ou transfeccao Plasmideo, use placas de 24 poços ou 6-poços (cada um contendo um esterilizado 12 mm ou 25 mm lamela de vidro, respectivamente).</li>
		<li>Esterilizar as lamelas de vidro de incubação em etanol a 70% pelo menos 1 h e, em seguida, lave três vezes em água destilada, deionizada antes de colocar as lamelas em poços.</li>
		<li>Adicione pelo menos 70 µ l PEI 0,04% por 12mm lamela em placas de 24 poços e 600 µ l 0,04% PEI por lamela de 25 mm em placas 6-boas.</li>
		<li>Por Western blot ou análise de RNA-Seq, os pratos de 10 cm, já que contém as células após a dissecação podem continuar a ser utilizados. Pratos só precisam ser sacudido, em seguida, as células são lavadas com PBS 1x e tratadas com NB + H (não transferir para novos pratos).</li>
	</ol>
</li>
	<li>No dia em vitro (DIV) 7 após a dissecação, coloque os pratos de 10 cm com células em DMEM + num agitador de laboratório na incubadora e agitar os pratos a 110 rpm para 6 h.</li>
	<li>Lave o PEI de lamelas revestidos com água deionizada, destilada duas vezes. Adicione meio NB + H para as placas (500 µ l por alvéolo para placas de 24 poços e 2 mL por bem para placas boas 6). Pre-equilibrar as placas na incubadora a 37 ° C e 5% CO2 enquanto tremem os pratos de 10 cm, ou pelo menos 30 min.</li>
	<li>20-30 min antes do final do abanar de 6h, pré-aquecer 1 x PBS, DMEM +, NB + H e 0,25% do trypsin-EDTA a 37 ° C em banho-maria.</li>
	<li>Após 6 h de tremer, tirar os pratos da cultura o agitador e substitua imediatamente o meio (que contém abalada-fora os neurônios, oligodendrócitos e micróglia) com 10ml pré aquecido 1X PBS por prato. Nota: É importante aspirar imediatamente o velho meio contendo células isoladas para evitar as células não-hamartomas anexar novamente.</li>
	<li>Remover a PBS e adicionar 3 mL previamente aquecido do trypsin-EDTA por prato. Incube cada prato por 4 min na incubadora a 37 ° C e 5% de CO2. Nota: Se preparar amostras para Western blot ou RNA-Seq, não adicione do trypsin-EDTA. Em vez disso, substituir a PBS com 12ml pré aquecido NB + H, após o qual culturas podem ser colocadas de volta na incubadora.</li>
	<li>Adicione 5 mL DMEM + previamente aquecido para o 3 mL do trypsin-EDTA em cada prato, pipetar as células fora do prato usando uma pipeta sorológica 5ml e coletar a suspensão de células em um tubo de 50 mL. Nota: Pipetar diretamente do fundo do prato - o piso do prato deve tornar-se mais claro, como separar as células. Só uso soro contendo médio (no lugar de DMEM +), como soro inactivates tripsina.</li>
	<li>Centrifugar a suspensão de eritrócitos a 3.220 x g a 20 ° C por 4 min.</li>
	<li>Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 1 mL pré aquecido NB + H.</li>
</ol>6. célula chapeamento para culturas de Astrocyte Final
<ol><li>Conte as células.</li>
	<li>Placa de 20.000 células por poço em placas de 6 boas (em 2 mL de meio de NB + H por alvéolo) ou 5.000 células por poço em placas de 24 poços (em 500 médio NB + H µ l por alvéolo).</li>
	<li>Manter as culturas de células na incubadora a 37 ° C e 5% de CO2 até tratamento adicional ou análise.</li>
	<li>Troca de meio a meio de uma vez por semana. Nota: Em ambientes de baixa-nutriente, astrócitos parem se proliferando, mas qualquer microglia restante irão proliferar (embora em nossa experiência, não microglia apareceu em culturas AWESAM). Troca de meio a meio de uma vez por semana evita enriquecimento de qualquer potencialmente restantes microglia8, e as monoculturas permanecem saudáveis pelo menos três semanas.</li>
</ol>

<ol><li>Puschmann, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioactive+3D+cell+culture+system+minimizes+cellular+stress+and+maintains+the+in+vivo-like+morphological+complexity+of+astroglial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Bioactive 3D cell culture system minimizes cellular stress and maintains the in vivo-like morphological complexity of astroglial cells.</a> Glia. 61 (3), 432-440 (2013).</li>
<li>Puschmann, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HB-EGF+affects+astrocyte+morphology%2C+proliferation%2C+differentiation%2C+and+the+expression+of+intermediate+filament+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">HB-EGF affects astrocyte morphology, proliferation, differentiation, and the expression of intermediate filament proteins.</a> J Neurochem. 128 (6), 878-889 (2014).</li>
<li>Foo, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+method+for+the+purification+and+culture+of+rodent+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes.</a> Neuron. 71 (5), 799-811 (2011).</li>
<li>Wolfes, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+culturing+stellate+astrocytes+reveals+spatially+distinct+Ca2%2B+signaling+and+vesicle+recycling+in+astrocytic+processes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">A novel method for culturing stellate astrocytes reveals spatially distinct Ca2+ signaling and vesicle recycling in astrocytic processes.</a> J Gen Physiol. 149 (4), (2016).</li>
<li>McCarthy, K. D., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+separate+astroglial+and+oligodendroglial+cell+cultures+from+rat+cerebral+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue.</a> J Cell Biol. 85 (3), 890-902 (1980).</li>
<li>Krencik, R., Zhang, S. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+functional+astroglial+subtypes+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of functional astroglial subtypes from human pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 6 (11), 1710-1717 (2011).</li>
<li>Morita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+regulation+of+calcium+oscillation+in+astrocytes+by+growth+factors+and+pro-inflammatory+cytokines+via+the+mitogen-activated+protein+kinase+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dual regulation of calcium oscillation in astrocytes by growth factors and pro-inflammatory cytokines via the mitogen-activated protein kinase cascade.</a> J Neurosci. 23 (34), 10944-10952 (2003).</li>
<li>Saura, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+cells+in+astroglial+cultures%3A+a+cautionary+note%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Microglial cells in astroglial cultures: a cautionary note.</a> J Neuroinflammation. 4, 26(2007).</li>
<li>Raponi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S100B+expression+defines+a+state+in+which+GFAP-expressing+cells+lose+their+neural+stem+cell+potential+and+acquire+a+more+mature+developmental+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">S100B expression defines a state in which GFAP-expressing cells lose their neural stem cell potential and acquire a more mature developmental stage.</a> Glia. 55 (2), 165-177 (2007).</li>
<li>Royo, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+AAV+serotypes+stably+transduce+primary+hippocampal+and+cortical+cultures+with+high+efficiency+and+low+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Specific AAV serotypes stably transduce primary hippocampal and cortical cultures with high efficiency and low toxicity.</a> Brain Res. 1190, 15-22 (2008).</li>
<li>Malarkey, E. B., Parpura, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+characteristics+of+vesicular+fusion+in+astrocytes%3A+examination+of+synaptobrevin+2-laden+vesicles+at+single+vesicle+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Temporal characteristics of vesicular fusion in astrocytes: examination of synaptobrevin 2-laden vesicles at single vesicle resolution.</a> J Physiol. 589, Pt 17 4271-4300 (2011).</li>
<li>Zamanian, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+analysis+of+reactive+astrogliosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genomic analysis of reactive astrogliosis.</a> J Neurosci. 2 (18), 6391-6410 (2012).</li>
<li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca%282%2B%29+signaling+in+astrocytes+from+Ip3r2%28-%2F-%29+mice+in+brain+slices+and+during+startle+responses+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Ca(2+) signaling in astrocytes from Ip3r2(-/-) mice in brain slices and during startle responses in vivo.</a> Nat Neurosci. 18 (5), 708-717 (2015).</li>
<li>Shigetomi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+calcium+microdomains+within+entire+astrocyte+territories+and+endfeet+with+GCaMPs+expressed+using+adeno-associated+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Imaging calcium microdomains within entire astrocyte territories and endfeet with GCaMPs expressed using adeno-associated viruses.</a> J Gen Physiol. 141 (5), 633-647 (2013).</li>
<li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Transgenic+Mouse+Lines+for+Selectively+Targeting+Astrocytes+and+Studying+Calcium+Signals+in+Astrocyte+Processes+In+Situ+and+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">New Transgenic Mouse Lines for Selectively Targeting Astrocytes and Studying Calcium Signals in Astrocyte Processes In Situ and In Vivo.</a> Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).</li>
<li>Otsu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+dynamics+in+astrocyte+processes+during+neurovascular+coupling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Calcium dynamics in astrocyte processes during neurovascular coupling.</a> Nat Neurosci. 18 (2), 210-218 (2015).</li>
<li>Agarwal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+Opening+of+the+Mitochondrial+Permeability+Transition+Pore+Induces+Microdomain+Calcium+Transients+in+Astrocyte+Processes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Transient Opening of the Mitochondrial Permeability Transition Pore Induces Microdomain Calcium Transients in Astrocyte Processes.</a> Neuron. 93 (3), 587-605 (2017).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Quatro etapas dentro do protocolo são fundamentais: 1) preparando a concentração HBEGF precisamente 5 ng/ml, uma vez que pequenos aumentos na concentração podem levar a culturas imaturas, por exemplo, 10 ng/mL HBEGF diferenciará de astrócitos4; 2) evita bolhas nas soluções que contêm tecidos ou células, que podem alterar o pH e impedir a saúde astrocyte; 3) pre-desenroscada mídia para atingir o pH ideal e a temperatura para o crescimento saudáveis astrócitos; 4) troca de ap...

Astrócitos influenciam a função cerebral através de suporte trófica, fluxo sanguíneo, sinalização sináptica e plasticidade e comunicação intercelular - todos os quais são mecanismos que giram em torno dos processos hamartomas finos. O protocolo AWESAM descrito aqui permite que o estudo desses processos sem interferência de neurônios e outro glia, que é útil , por exemplo, porque a expressão de muitas proteínas e até mesmo de Ca2 + sinalização se sobrepõem em toda célula cerebral diferente tipos. Além disso, este método supera as limitações das técnicas anteriormente disponíveis. Em particular, o nosso protocolo fornece na vivo-como morfologia (astrócitos estreladas com processos finos) e expressão gênica em um rápido, fácil e barata maneira.
Morfologia celular, expressão gênica e muitos outros processos regulatórios são diretamente influenciados pelo ambiente. Em um prato de cultura, refere-se a fatores liberados por células circundantes, mas também o meio no qual as células são cultivadas. Para astrócitos, HBEGF foi relatado anteriormente para induzir uma morfologia estrelado1 mas verificou-se, também, para diferenciar de astrócitos2. No entanto, concentrações de HBEGF foram usadas mais tarde para a geração mais na vivo-astrócitos como identificados por meio de sequenciamento de RNA em dois diferentes protocolos de3,4. Além disso, a morfologia astrocyte altera com a composição média, independentemente do protocolo4: Neurobasal médio com uma baixa concentração de HBEGF é ideal para o cultivo de astrócitos estrelados, enquanto outras composições médios (por exemplo, contendo soro DMEM) produzir células poligonais (mesmo em astrócitos recentemente isolados por immunopanning).
O protocolo AWESAM supera as desvantagens das técnicas anteriores para o cultivo de monoculturas astrocyte4. Técnicas anteriores para o cultivo de monoculturas astrocyte têm as seguintes desvantagens: morfologia poligonal, que é característico de astrócitos estrelado na vivo (método de MD)5; o comprimento e o custo do protocolo (astrócitos tomadas de células-tronco pluripotentes induzidas a preparar três meses e requer muitos reagentes, incluindo fatores de crescimento caros)6; as pequenas quantidades de material (método immunopanning)3; e a diferenciação dos astrócitos e exigência de uma matriz 3D (Puschmann et al.) 1 , 2. em contraste, o protocolo AWESAM fornece: no vivo-como morfologia (astrócitos estreladas com processos finos); um rápido, fácil e barato método; grandes quantidades de material; e a maioria na vivo-como expressão de gene em comparação com immunopanned e astrócitos MD. Além disso, permite a cultura 2D para o estudo da sinalização de Ca2 + e vesículas de reciclagem em finos processos e em eventos perto da membrana (por exemplo, microscopia TIRF não é possível em culturas 3D).
O método de MD tem sido usado extensivamente desde sua publicação em 19805, oferecendo uma técnica simples e rápida para monoculturas astrocyte poligonal. Em breve, o método de MD implica crescente neurónios misto no soro fetal bezerro (FCS)-contendo DMEM, seguido por etapas que enriquecem para astrócitos (como todas as outras células cerebrais tipos desanexar do prato) e mais cultura no mesmo meio a tremer. DMEM suplementado com FCS é usado para muitos outros tipos de células, variando de fibroblastos e adipócitos para linhas de células de câncer diferentes, os quais compartilham a morfologia poligonal exibida por astrócitos MD na cultura. Até o início dos anos 20007, pouco tinha sido dada a mídia sob medida para astrócitos, especificamente favorecer sua morfologia típica estrelada encontrado em vivo. Um protocolo publicado em 2011 alcançar tal morfologia estrelada: chamado o método immunopanning, emprega meio livre de soro otimizado para cultivo de astrócitos3. Usando este método, as células do cérebro recentemente isolada estão expostas a uma série de pratos revestidos com anticorpos que se destinam a proteínas de células específicas do tipo de célula superfície, enriquecer para astrócitos. Apesar do mais na vivo-como perfil morfologia e expressão de astrócitos immunopanned, a maioria dos estudos em vitro ainda depende do método de astrocyte MD. O método de MD é simples e rápido, enquanto o método de immunopanning é composto por etapas mais complexas e demoradas no primeiro dia da cultura (tais como longos períodos de digestão enzimática, estratificação cuidadosa das soluções de diferente densidade, immunopanning em si, e vários centrifugação passos - tudo isso antes de chapeamento). No entanto, usando o meio mais especializado, o método AWESAM oferece tanto a velocidade do método MD e o na vivo-como a morfologia do protocolo immunopanning.
Em geral, o protocolo AWESAM é útil para estudar mais na vivo-gosto de astrócitos em 2D monoculturas isolados dos neurônios e outro glia (como anteriormente caracterizadas4 por immunostainings immunoblots e sequenciamento de RNA). Ele permite o estudo de processos hamartomas finos e fornece grande acessibilidade para a visualização de Ca2 + sinalização espontânea e eventos perto da membrana (por exemplo, fotografada por microscopia TIRF).

<table><tbody><tr><td>0.05% trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td>warm in 37 &amp;ordm;C waterbath before use</td></tr><tr><td>0.25% trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td>warm in 37 &amp;ordm;C waterbath before use</td></tr><tr><td>B-27 supplement</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td>50X stock</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>100X stock</td></tr><tr><td>Penicillin / streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15070-063</td><td>50 stock; penicillin: 5000 U/ml; streptomycin: 5000 &amp;micro;g/ml</td></tr><tr><td>Neurobasal medium</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td>without L-glutamine</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>41966029</td><td></td></tr><tr><td>HBEGF</td><td>Sigma</td><td>4643</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14170112</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Gibco</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010049</td><td>1X</td></tr><tr><td>100 &amp;mu;m nylon cell strainer</td><td>BD</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Sigma</td><td>T8154&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture incubator</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Hera Cell 240i cell culture incubator</td><td></td></tr><tr><td>Laboratory shaker</td><td>Heidolph</td><td>Rotamax 120&amp;nbsp;</td><td>use inside cell culture incubator</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810 R&amp;nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

culturing in vivo-like murine astrocytes using the fast, simple, and inexpensive awesam protocol

O AWESAM (um low-custo easy stellate umstrocyte method) protocolo implica uma maneira rápida, simples e barata para gerar grandes quantidades de in vivo-como monoculturas de rato e rato astrocyte : As células do cérebro podem ser isoladas de regiões diferentes do cérebro, e após uma semana de cultura de células, as células não-hamartomas são sacudidas, colocando os pratos de cultura num agitador para 6 h na incubadora. Os astrócitos restantes são então passados para novas placas com meio astrocyte específicos (denominado NB + H). NB + H contém baixas concentrações de heparina-ligação EGF fator de crescimento semelhante (HBEGF), que é usado no lugar de soro no meio. Após ter crescido em NB + H, astrócitos AWESAM têm uma morfologia estrelada e processos bem característica. Além disso, estes astrócitos têm mais na vivo-como expressão do gene que astrócitos gerados pelos métodos anteriormente publicados. Imagem latente de CA2 + , dinâmica de vesículas e outros eventos perto da membrana, portanto, podem ser estudados no bem processos hamartomas em vitro, por exemplo, usando a célula viva confocal ou microscopia TIRF. Notavelmente, astrócitos AWESAM também apresentam espontânea Ca2 + sinalização semelhante de astrócitos na vivo.

Astrócitos que são cultivados co com neurônios e cultivados em meios NB + aparecem estrelados após 2 semanas da cultura (Figura 2). Além de NB + médio, os astrócitos co cultos também estão expostos a fatores desconhecidos neurônio-derivado que provavelmente contribuem para a sua sobrevivência e morfologia. Em contraste, astrócitos MD crescidos em DMEM + como monoculturas (após agitação fora outros tipos de células antes de passagem) aparecem p...

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Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

O protocolo AWESAM descrito aqui é ideal para o cultivo de astrócitos murino em isolamento de outras células do cérebro de forma rápida, simples e barato. Astrócitos AWESAM exposição espontânea Ca2 + sinalização, morfologia e gene expressão perfis semelhantes de astrócitos na vivo.

Cultivo In Vivo-gosto murino astrócitos usando o protocolo AWESAM rápida, simples e barato

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

8.4K visualizações.  University of Oxford. O protocolo AWESAM descrito aqui é ideal para o cultivo de astrócitos murino em isolamento de outras células do cérebro de forma rápida, simples e barato. Astrócitos AWESAM exposição espontânea Ca2 + sinalização, morfologia e gene expressão perfis semelhantes de astrócitos na vivo.

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Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes

Astrocytes are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be learned about their molecular and functional characteristics. In vitro astrocyte cell culture systems can be used to study the biological functions of these glial cells in detail. This video protocol shows how to obtain pure astrocytes by isolation and culture of mixed cortical cells of mouse pups. The method is based on the absence of viable neurons and the separation of astrocytes, oligodendrocytes and microglia, the three main glial cell populations of the central nervous system, in culture. Representative images during the first days of culture demonstrate the presence of a mixed cell population and indicate the timepoint, when astrocytes become confluent and should be separated from microglia and oligodendrocytes. Moreover, we demonstrate purity and astrocytic morphology of cultured astrocytes using immunocytochemical stainings for well established and newly described astrocyte markers. This culture system can be easily used to obtain pure mouse astrocytes and astrocyte-conditioned medium for studying various aspects of astrocyte biology.

Astrocytes have been recognized to be versatile cells participating in fundamental biological processes that are essential for normal brain development and function, and central nervous system repair. Here we present a rapid procedure to obtain pure mouse astrocyte cultures to study the biology of this major class of central nervous system cells.

Isolamento e Cultura de astrócitos corticais de rato

Astrocytes  are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be  learned about their molecular and functional characteristics. In ...

Neurociência

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

Current astrocytoma models are limited in their ability to define the roles of oncogenic mutations in specific brain cell types during disease pathogenesis and their utility for preclinical drug development. In order to design a better model system for these applications, phenotypically wild-type cortical astrocytes and neural stem cells (NSC) from conditional, genetically engineered mice (GEM) that harbor various combinations of floxed oncogenic alleles were harvested and grown in culture. Genetic recombination was induced in vitro using adenoviral Cre-mediated recombination, resulting in expression of mutated oncogenes and deletion of tumor suppressor genes. The phenotypic consequences of these mutations were defined by measuring proliferation, transformation, and drug response in vitro. Orthotopic allograft models, whereby transformed cells are stereotactically injected into the brains of immune-competent, syngeneic littermates, were developed to define the role of oncogenic mutations and cell type on tumorigenesis in vivo. Unlike most established human glioblastoma cell line xenografts, injection of transformed GEM-derived cortical astrocytes into the brains of immune-competent littermates produced astrocytomas, including the most aggressive subtype, glioblastoma, that recapitulated the histopathological hallmarks of human astrocytomas, including diffuse invasion of normal brain parenchyma. Bioluminescence imaging of orthotopic allografts from transformed astrocytes engineered to express luciferase was utilized to monitor in vivo tumor growth over time. Thus, astrocytoma models using astrocytes and NSC harvested from GEM with conditional oncogenic alleles provide an integrated system to study the genetics and cell biology of astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo and may be useful in preclinical drug development for these devastating diseases.

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

Phenotypically wild-type astrocytes and neural stem cells harvested from mice engineered with floxed, conditional oncogenic alleles and transformed via viral Cre-mediated recombination can be used to model astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo by orthotopic injection of transformed cells into brains of syngeneic, immune-competent littermates.

Modelagem astrocitoma Patogênese<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em&gt; Usando Cortical astrócitos ou células-tronco neurais de condicional, Geneticamente Modificadas Ratos

Current astrocytoma models are limited in their ability to define the roles of oncogenic mutations in specific brain cell types during disease ...

Monitoring Astrocyte Reactivity and Proliferation in Vitro Under Ischemic-Like Conditions

Ischemic stroke is a complex brain injury caused by a thrombus or embolus obstructing blood flow to parts of the brain. This leads to deprivation of oxygen and glucose, which causes energy failure and neuronal death. After an ischemic stroke insult, astrocytes become reactive and proliferate around the injury site as it develops. Under this scenario, it is difficult to study the specific contribution of astrocytes to the brain region exposed to ischemia. Therefore, this article introduces a methodology to study primary astrocyte reactivity and proliferation under an in vitro model of an ischemia-like environment, called oxygen glucose deprivation (OGD). Astrocytes were isolated from 1-4 day-old neonatal rats and the number of non-specific astrocytic cells was assessed using astrocyte selective marker Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) and nuclear staining. The period in which astrocytes are subjected to the OGD condition can be customized, as well as the percentage of oxygen they are exposed to. This flexibility allows scientists to characterize the duration of the ischemic-like condition in different groups of cells in vitro. This article discusses the timeframes of OGD that induce astrocyte reactivity, hypertrophic morphology, and proliferation as measured by immunofluorescence using Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA). Besides proliferation, astrocytes undergo energy and oxidative stress, and respond to OGD by releasing soluble factors into the cell medium. This medium can be collected and used to analyze the effects of molecules released by astrocytes in primary neuronal cultures without cell-to-cell interaction. In summary, this primary cell culture model can be efficiently used to understand the role of isolated astrocytes upon injury.

Monitoring Astrocyte Reactivity and Proliferation in Vitro Under Ischemic-Like Conditions

Ischemic stroke is a complex event in which the specific contribution of astrocytes to the affected brain region exposed to oxygen glucose deprivation (OGD) is difficult to study. This article introduces a methodology to obtain isolated astrocytes and study their reactivity and proliferation under OGD conditions.

Monitoramento de Astrocyte de reatividade e proliferação in Vitro sob condições isquêmicas

Ischemic stroke is a complex brain injury caused by a thrombus or embolus obstructing blood flow to parts of the brain. This leads to deprivation of ...

Live-imaging of Mitochondrial System in Cultured Astrocytes

While much attention has been given to mitochondrial alterations at the neuronal level, recent evidence demonstrates that mitochondrial dynamics and function in astrocytes are implicated in cognition. This article describes the method for time-lapse imaging of astrocyte cultures equipped with a mitochondrial biosensor: MitoTimer. MitoTimer is a powerful and unique tool to assess mitochondrial dynamics, mobility, morphology, biogenesis, and redox state. Here, the different procedures for culture, image acquisitions, and subsequent mitochondrial analysis are presented.

This article describes the method for mitochondrial time-lapse imaging of astrocyte cultures equipped with MitoTimer biosensor and the resulting multiparametric analysis of mitochondrial dynamics, mobility, morphology, biogenesis, redox state, and turnover.

Imagem ao vivo do Sistema Mitocondrial em Astrócitos Cultivados

While much attention has been given to mitochondrial alterations at the neuronal level, recent evidence demonstrates that mitochondrial dynamics and ...

Primary Cultures of Rat Astrocytes and Microglia and Their Use in the Study of Amyotrophic Lateral Sclerosis

This protocol demonstrates how to prepare primary cultures of glial cells, astrocytes, and microglia from the cortices of Sprague Dawley rats and how to use these cells for the purpose of studying the pathophysiology of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) in the rat hSOD1G93A model. First, the protocol shows how to isolate and culture astrocytes and microglia from postnatal rat cortices, and then how to characterize and test these cultures for purity by immunocytochemistry using the glial fibrillary acidic protein (GFAP) marker of astrocytes and the ionized calcium-binding adaptor molecule 1 (Iba1) microglial marker. In the next stage, methods are described for dye-loading (calcium-sensitive Fluo 4-AM) of cultured cells and the recordings of Ca2+ changes in video imaging experiments on live cells.
The examples of video recordings consist of: (1) cases of Ca2+ imaging of cultured astrocytes acutely exposed to immunoglobulin G (IgG) isolated from ALS patients, showing a characteristic and specific response compared to the response to ATP as demonstrated in the same experiment. Examples also show a more pronounced transient rise in intracellular calcium concentration evoked by ALS IgG in hSOD1G93A astrocytes compared to non-transgenic controls; (2) Ca2+ imaging of cultured astrocytes during a depletion of calcium stores by thapsigargin (Thg), a non-competitive inhibitor of the endoplasmic reticulum Ca2+ ATPase, followed by store-operated calcium entry elicited by the addition of calcium in the recording solution, which demonstrates the difference between Ca2+ store operation in hSOD1G93A and in non-transgenic astrocytes; (3) Ca2+ imaging of the cultured microglia showing predominantly a lack of response to ALS IgG, whereas ATP application elicited a Ca2+ change. This paper also emphasizes possible caveats and cautions regarding critical cell density and purity of cultures, choosing the correct concentration of the Ca2+ dye and dye-loading techniques.

We present here a protocol on how to prepare primary cultures of glial cells, astrocytes, and microglia from rat cortices for time-lapse video imaging of intracellular Ca2+ for research on pathophysiology of amyotrophic lateral sclerosis in the hSOD1G93A rat model.

Culturas Primárias de Astrócitos de Rato e Microglia e Seu Uso no Estudo da Esclerose Lateral Amiotrófica

This protocol demonstrates how to prepare primary cultures of glial cells, astrocytes, and microglia from the cortices of Sprague Dawley rats and how to ...

Isolation and Direct Neuronal Reprogramming of Mouse Astrocytes

Direct neuronal reprogramming is a powerful approach to generate functional neurons from different starter cell populations without passing through multipotent intermediates. This technique not only holds great promises in the field of disease modeling, as it allows to convert, for example, fibroblasts for patients suffering neurodegenerative diseases into neurons, but also represents a promising alternative for cell-based replacement therapies. In this context, a major scientific breakthrough was the demonstration that differentiated non-neural cells within the central nervous system, such as astrocytes, could be converted into functional neurons in vitro. Since then, in vitro direct reprogramming of astrocytes into neurons has provided substantial insights into the molecular mechanisms underlying forced identity conversion and the hurdles that prevent efficient reprogramming. However, results from in vitro&#160;experiments performed in different labs are difficult to compare due to differences in the methods used to isolate, culture, and reprogram astrocytes. Here, we describe a detailed protocol to reliably isolate and culture astrocytes with high purity from different regions of the central nervous system of mice at postnatal ages via magnetic cell sorting. Furthermore, we provide protocols to reprogram cultured astrocytes into neurons via viral transduction or DNA transfection. This streamlined and standardized protocol can be used to investigate the molecular mechanisms underlying cell identity maintenance, the establishment of a new neuronal identity, as well as the generation of specific neuronal subtypes and their functional properties.

Here we describe a detailed protocol to generate highly enriched cultures of astrocytes derived from different regions of the central nervous system of postnatal mice and their direct conversion into functional neurons by the forced expression of transcription factors.

Isolamento e Reprogramação Neuronal Direta de Astrócitos de Camundongos

Direct neuronal reprogramming is a powerful approach to generate functional neurons from different starter cell populations without passing through ...

Generating a Primary Culture of Astrocytes from a Rat Pup Brain

Source: Mili&#263;evi&#263;, K., et al., <a href="https://app.jove.com/v/63483">Primary Cultures of Rat Astrocytes and Microglia and Their Use in the Study of Amyotrophic Lateral Sclerosis.</a> J. Vis. Exp. (2022)
The video demonstrates a technique for culturing primary astrocytes from the rat cortex. The cortex is mechanically dissociated to obtain a homogeneous glial cell suspension, which is then plated on polypeptide-coated plates to promote selective proliferation of astrocytes. Subsequently, the astrocytes are enzymatically dissociated from the plates and transferred to fresh media, allowing the culture of pure astrocytes.

Gerando uma cultura primária de astrócitos a partir de um cérebro de filhote de rato

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Primary cell culture preparation

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JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuronal Culture Techniques

Primary Neuronal Culture

A Simple Technique to Isolate and Culture Murine Astrocytes

Source: Wolfes, A. C., et al., <a href="https://app.jove.com/v/56092">Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol.</a> J. Vis. Exp. (2018)
The video demonstrates a simple method to culture murine astrocytes in isolation from other brain cells. During culturing, by using astrocyte-specific media and inhibiting the adherence of non-astrocytic cells, the method selectively cultures astrocytes. These cultured astrocytes exhibit stellate morphology with fine processes.

Uma técnica simples para isolar e cultivar astrócitos murinos

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Rat or Mouse Brain Dissection
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Direct Neuronal Reprogramming of Mouse Astrocytes into Neurons

Source: Hersbach, B. A. et al., <a href="https://app.jove.com/v/64175">Isolation and Direct Neuronal Reprogramming of Mouse Astrocytes.</a> J. Vis. Exp. (2022) 
This video showcases the direct reprogramming of astrocytes expressing transforming factors into neurons. Transformation factors trigger a cascade of molecular events facilitating astrocyte-to-neuron conversion. The process is further supported by supplying specific agents and supplements through a neuronal differentiation medium.

Reprogramação neuronal direta de astrócitos de camundongos em neurônios

1. Seeding of astrocytes for reprogramming
NOTE: The following steps have to be performed under a biological safety cabinet with a safety level 1 (SL1).

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Advanced Neuronal Models

An In Vitro Method to Generate Astrocyte Scaffolds within Hydrogel Micro-columns

Source: Katiyar, K. S., et al. <a href="https://app.jove.com/v/55848">Three-dimensional Tissue Engineered Aligned Astrocyte Networks to Recapitulate Developmental Mechanisms and Facilitate Nervous System Regeneration.</a> J. Vis. Exp. (2018).
This video demonstrates a method to generate three-dimensional astrocyte scaffolds within hydrogel micro-columns. The inside of the microcolumns are coated with collagen. Astrocytes are introduced, which adhere to collagen and, with further incubation, self-assemble into a three-dimensional scaffold.

Um método in vitro para gerar andaimes de astrócitos dentro de microcolunas de hidrogel

1. Development of the Agarose Hydrogel Micro-columns

	Make an agarose 3% weight/volume (w/v) solution by weighing 3 g of agarose and transferring it to a ...