Reconhecemos que o financiamento do Conselho Europeu de investigação (7. º PQ/260916), a Alexander von Humboldt-Stiftung (Sofja Kovalevskaja) e a Deutsche Forschungsgemeinschaft (DE1951 e SFB889).

Todas as experiências com animais aqui descritas foram realizadas em conformidade com as orientações para o bem-estar animal alemão.
Nota: A linha do tempo e as etapas principais do protocolo são ilustradas na Figura 1.
1. preparações
<ol><li>
Prepare as seguintes soluções.
	<ol>
<li>Preparar DMEM + para cultivo poligonais astrócitos MD: DMEM com 10% FCS, 100 de U de penicilina e estreptomicina 100 de µ g/mL.</li>
		<li>Prepare-se para cultivo astrócitos estrelados NB + H: neurobasal médio com 5 ng/mL HBEGF, 1 x suplemento B-27, 1 suplemento de glutamina x, penicilina de U 100 e 100 estreptomicina µ g/mL. Nota: Alíquotas de altas concentrações de HBEGF podem ser preparadas e armazenadas a-20 ° C a ser adicionado ao meio, sempre que necessário.</li>
		<li>Prepare o suporte de dissecação (10 mM HEPES em HBSS).</li>
		<li>Prepare alíquotas de 6-7 mL de 0,05% do trypsin-EDTA e 6-7 mL 0,25% do trypsin-EDTA em tubos de 15 mL. Estas podem ser armazenadas a-20 ° C e descongeladas em banho maria a 37 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>O dia antes de começar o protocolo, casaco pratos de cultura de tecidos tratados de 10 cm com 5 mL de 0,04% o polyethylenimine (PEI) cada.</li>
	<li>No dia seguinte, retire o PEI e lavar a louça com água deionizada, destilada duas vezes. Adicionar 12 mL de DMEM + para cada placa e pre-equilibrar na incubadora a 37 ° C e 5% de CO2 pelo menos 30 min antes de chapear pilhas.</li>
	<li>Preparar a área de dissecação: em uma capa de dissecação de fluxo laminar, coloque dois pratos de Petri de 10 cm preenchido com meio de dissecação no gelo. Para cada área do cérebro a ser isolado (por exemplo, córtex, hipocampo), prepare um 15-tubo preenchido com 14 mL de meio de dissecação e manter no gelo. Pulverizador ferramentas de dissecação (tesouras bem, Dumont #3 e #5 pinças) com 70% de etanol e coloque ao lado do microscópio de dissecação do capuz.</li>
</ol>2. o rato ou dissecação do cérebro de rato
Nota: Ambos os ratos e ratazanas podem ser usadas. Mais velho do P8 também podem ser utilizados animais (nós testamos até P12), mas remover as meninges se tornará cada vez mais difícil. Além disso, o rendimento da célula e a saúde vão diminuir, desde que as células do cérebro de animais mais velhos serão formaram processos intrincados e conexões que podem quebrar durante a dissociação do tecido, levando à morte celular aumentada. Preparações corticais são descritas aqui, mas outras regiões do cérebro também podem ser usados.
<ol><li>Coloque 0,05% do trypsin-EDTA em banho maria a 37 ° C.</li>
	<li>Eutanásia em animais (ratos grávidos para E19 filhotes ou animais P0-P8) levantando lentamente a concentração de CO2 e isolar o cérebro. As etapas a seguir requerem técnica estéril.</li>
	<li>
Se trabalhar com tecido embrionário, primeiro remova os embriões no útero e abra os sacos embrionários, então imediatamente cortou a cabeça com uma tesoura. Quando todas as cabeças são cortadas, transferi-los em meio de dissecação pre-cooled.
	<ol>
<li>Uma vez que as cabeças estão submersos no meio, abra a pele e o crânio (os dois são muito moles em animais jovens) com fórceps e pitada do cerebelo. Alavanca com cuidado o resto do cérebro acima e do crânio. Nota: Dois a quatro E19 embriões produzem tecido suficiente para pelo menos oito pratos de 10cm de astrócitos corticais chapeados em 500.000 células por prato no dia de dissecação.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para filhotes recém-nascidos ou mais velhos, cortou a cabeça com uma tesoura e isolar o cérebro medialmente cortando a pele em uma linha reta na parte de trás da cabeça até a ponta do nariz. Puxe a pele de lado e cuidadosamente corte o crânio esquerdo e direito, em seguida, elevador osso do crânio. Cortar o cerebelo e alavanca o resto do cérebro acima e do crânio. Nota: Dois ou três filhotes de P0-P8 produzem tecido suficiente para pelo menos oito pratos de 10cm de astrócitos corticais chapeados em 500.000 células por prato no dia de dissecação.</li>
	<li>Separe o córtex da estrutura subjacente do mesencéfalo. Coloque a pinça dentro da fissura longitudinal entre os hemisférios, mova a pinça entre o córtex e mesencéfalo estruturas de um hemisfério (perpendicular à fissura longitudinal) para beliscar cada hemisfério livre.</li>
	<li>Usando a pinça, remover todas as meninges de cada hemisfério (e seu hipocampo), em seguida, separar o hipocampo. Se hippocampal astrócitos são necessários, mova cada hipocampo para um tubo de 15 mL cheio com 14 mL de meio de dissecação no gelo.</li>
	<li>Remova mais áreas do córtex de cada hemisfério se regiões específicas são necessárias (por exemplo, o córtex frontal). Corte qualquer tecido cortical a ser usado para a geração de astrócitos em pedaços não maiores que 1 mm3. Recolha todos os pedaços de tecido cortical em um tubo de 15 mL separado cheio com meio de dissecação no gelo.</li>
</ol>3. dissociação e digestão do tecido
<ol><li>Uma vez que todas as peças de tecido são coletadas, esperar por eles para resolver a parte inferior do tubo e, em seguida, Aspire tanto médio quanto possível.</li>
	<li>Adicionar 2-3 mL de 0,05% do trypsin-EDTA usando uma pipeta sorológica e incubar os tubos num banho de água de 37 ° C por 20 min. Nota: Versão do trypsin-EDTA todos da pipeta rapidamente para misturar as peças de tecido e deixar repousar novamente.</li>
	<li>Aspire cuidadosamente com o tripsina-EDTA, deixando pedaços de tecido em como pouco líquido quanto possível, na parte inferior do tubo.</li>
	<li>Adicione 5 mL de meio de dissecação pre-cooled para lavar fora o restante do trypsin-EDTA. Pipetar para o lado da parte superior do tubo para alcançar misturando as peças de tecido.</li>
	<li>Aspire o meio de dissecação e deixar os pedaços de tecido em como pouco líquido quanto possível. Repita essa etapa de lavagem com meio pre-cooled dissecação mais duas vezes.</li>
	<li>Após a etapa de lavagem final, adicione 1 mL de DMEM + (aquecido à temperatura) usando uma ponta da pipeta 1.000 µ l e triture o tecido pipetando cima e para baixo sem a introdução de bolhas. Nota: É importante evitar a produção de bolhas, como isso pode mudar o pH da solução, para que os astrócitos são bastante sensíveis.</li>
	<li>Coloque um filtro de célula de 100 µm na abertura de um tubo de 50 mL e pre-molhado o filtro com 4,5 mL de DMEM pre-cooled +.</li>
	<li>Pipetar 1 mL da suspensão de tecido dissociado no filtro da célula e adicionar outro 4,5 mL pre-refrigeração DMEM + lavar as células através do filtro de célula.</li>
</ol>4. célula chapeamento para enriquecimento do Astrocyte por passagem
<ol><li>Conte as células, por exemplo, por diluir 10 µ l da suspensão celular com 10 µ l trypan azul e pipetagem a mistura para um hemocytometer.</li>
	<li>Placa de 500.000 células em 12 mL DMEM + por prato de 10 cm. Nota: DMEM + é útil para o crescimento de hamartomas, mais ainda do que para os neurônios ou microglia. Durante a agitação, as forças físicas atuando sobre as lamelas de vidro dentro de poços são muito mais fortes do que aqueles atuando sobre os pratos de 10 cm (sem lamelas). Se as células são sacudidas em placas de 24-bem, eles se tornam insalubres ou morrem. Só placa astrócitos em placas de 24 poços após agitação.</li>
	<li>Manter as culturas celulares na incubadora a 37 ° C e 5% de CO2 por sete dias.</li>
	<li>No dia 6, no dia anterior a tremer e a passagem de células, prepare as placas de cultura de PEI-revestido, conforme descrito na etapa 5.</li>
</ol>5. as células de passagem
<ol><li>
No dia anterior passagem, revestimento placas de cultura celular com PEI de 0,04%.
	<ol>
<li>Por imunocitoquímica, transdução viral ou transfeccao Plasmideo, use placas de 24 poços ou 6-poços (cada um contendo um esterilizado 12 mm ou 25 mm lamela de vidro, respectivamente).</li>
		<li>Esterilizar as lamelas de vidro de incubação em etanol a 70% pelo menos 1 h e, em seguida, lave três vezes em água destilada, deionizada antes de colocar as lamelas em poços.</li>
		<li>Adicione pelo menos 70 µ l PEI 0,04% por 12mm lamela em placas de 24 poços e 600 µ l 0,04% PEI por lamela de 25 mm em placas 6-boas.</li>
		<li>Por Western blot ou análise de RNA-Seq, os pratos de 10 cm, já que contém as células após a dissecação podem continuar a ser utilizados. Pratos só precisam ser sacudido, em seguida, as células são lavadas com PBS 1x e tratadas com NB + H (não transferir para novos pratos).</li>
	</ol>
</li>
	<li>No dia em vitro (DIV) 7 após a dissecação, coloque os pratos de 10 cm com células em DMEM + num agitador de laboratório na incubadora e agitar os pratos a 110 rpm para 6 h.</li>
	<li>Lave o PEI de lamelas revestidos com água deionizada, destilada duas vezes. Adicione meio NB + H para as placas (500 µ l por alvéolo para placas de 24 poços e 2 mL por bem para placas boas 6). Pre-equilibrar as placas na incubadora a 37 ° C e 5% CO2 enquanto tremem os pratos de 10 cm, ou pelo menos 30 min.</li>
	<li>20-30 min antes do final do abanar de 6h, pré-aquecer 1 x PBS, DMEM +, NB + H e 0,25% do trypsin-EDTA a 37 ° C em banho-maria.</li>
	<li>Após 6 h de tremer, tirar os pratos da cultura o agitador e substitua imediatamente o meio (que contém abalada-fora os neurônios, oligodendrócitos e micróglia) com 10ml pré aquecido 1X PBS por prato. Nota: É importante aspirar imediatamente o velho meio contendo células isoladas para evitar as células não-hamartomas anexar novamente.</li>
	<li>Remover a PBS e adicionar 3 mL previamente aquecido do trypsin-EDTA por prato. Incube cada prato por 4 min na incubadora a 37 ° C e 5% de CO2. Nota: Se preparar amostras para Western blot ou RNA-Seq, não adicione do trypsin-EDTA. Em vez disso, substituir a PBS com 12ml pré aquecido NB + H, após o qual culturas podem ser colocadas de volta na incubadora.</li>
	<li>Adicione 5 mL DMEM + previamente aquecido para o 3 mL do trypsin-EDTA em cada prato, pipetar as células fora do prato usando uma pipeta sorológica 5ml e coletar a suspensão de células em um tubo de 50 mL. Nota: Pipetar diretamente do fundo do prato - o piso do prato deve tornar-se mais claro, como separar as células. Só uso soro contendo médio (no lugar de DMEM +), como soro inactivates tripsina.</li>
	<li>Centrifugar a suspensão de eritrócitos a 3.220 x g a 20 ° C por 4 min.</li>
	<li>Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 1 mL pré aquecido NB + H.</li>
</ol>6. célula chapeamento para culturas de Astrocyte Final
<ol><li>Conte as células.</li>
	<li>Placa de 20.000 células por poço em placas de 6 boas (em 2 mL de meio de NB + H por alvéolo) ou 5.000 células por poço em placas de 24 poços (em 500 médio NB + H µ l por alvéolo).</li>
	<li>Manter as culturas de células na incubadora a 37 ° C e 5% de CO2 até tratamento adicional ou análise.</li>
	<li>Troca de meio a meio de uma vez por semana. Nota: Em ambientes de baixa-nutriente, astrócitos parem se proliferando, mas qualquer microglia restante irão proliferar (embora em nossa experiência, não microglia apareceu em culturas AWESAM). Troca de meio a meio de uma vez por semana evita enriquecimento de qualquer potencialmente restantes microglia8, e as monoculturas permanecem saudáveis pelo menos três semanas.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Puschmann, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioactive+3D+cell+culture+system+minimizes+cellular+stress+and+maintains+the+in+vivo-like+morphological+complexity+of+astroglial+cells.">Bioactive 3D cell culture system minimizes cellular stress and maintains the in vivo-like morphological complexity of astroglial cells.</a> Glia. 61 (3), 432-440 (2013).</li><li>Puschmann, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HB-EGF+affects+astrocyte+morphology,+proliferation,+differentiation,+and+the+expression+of+intermediate+filament+proteins.">HB-EGF affects astrocyte morphology, proliferation, differentiation, and the expression of intermediate filament proteins.</a> J Neurochem. 128 (6), 878-889 (2014).</li><li>Foo, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+method+for+the+purification+and+culture+of+rodent+astrocytes.">Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes.</a> Neuron. 71 (5), 799-811 (2011).</li><li>Wolfes, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+culturing+stellate+astrocytes+reveals+spatially+distinct+Ca2++signaling+and+vesicle+recycling+in+astrocytic+processes.">A novel method for culturing stellate astrocytes reveals spatially distinct Ca2+ signaling and vesicle recycling in astrocytic processes.</a> J Gen Physiol. 149 (4), (2016).</li><li>McCarthy, K. D., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+separate+astroglial+and+oligodendroglial+cell+cultures+from+rat+cerebral+tissue.">Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue.</a> J Cell Biol. 85 (3), 890-902 (1980).</li><li>Krencik, R., Zhang, S. -. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+AAV+serotypes+stably+transduce+primary+hippocampal+and+cortical+cultures+with+high+efficiency+and+low+toxicity.">Specific AAV serotypes stably transduce primary hippocampal and cortical cultures with high efficiency and low toxicity.</a> Brain Res. 1190, 15-22 (2008).</li><li>Malarkey, E. B., Parpura, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+characteristics+of+vesicular+fusion+in+astrocytes:+examination+of+synaptobrevin+2-laden+vesicles+at+single+vesicle+resolution.">Temporal characteristics of vesicular fusion in astrocytes: examination of synaptobrevin 2-laden vesicles at single vesicle resolution.</a> J Physiol. 589, 4271-4300 (2011).</li><li>Zamanian, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+analysis+of+reactive+astrogliosis.">Genomic analysis of reactive astrogliosis.</a> J Neurosci. 2 (18), 6391-6410 (2012).</li><li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca(2+)+signaling+in+astrocytes+from+Ip3r2(-/-)+mice+in+brain+slices+and+during+startle+responses+in+vivo.">Ca(2+) signaling in astrocytes from Ip3r2(-/-) mice in brain slices and during startle responses in vivo.</a> Nat Neurosci. 18 (5), 708-717 (2015).</li><li>Shigetomi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+calcium+microdomains+within+entire+astrocyte+territories+and+endfeet+with+GCaMPs+expressed+using+adeno-associated+viruses.">Imaging calcium microdomains within entire astrocyte territories and endfeet with GCaMPs expressed using adeno-associated viruses.</a> J Gen Physiol. 141 (5), 633-647 (2013).</li><li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Transgenic+Mouse+Lines+for+Selectively+Targeting+Astrocytes+and+Studying+Calcium+Signals+in+Astrocyte+Processes+In+Situ+and+In+Vivo.">New Transgenic Mouse Lines for Selectively Targeting Astrocytes and Studying Calcium Signals in Astrocyte Processes In Situ and In Vivo.</a> Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).</li><li>Otsu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+dynamics+in+astrocyte+processes+during+neurovascular+coupling.">Calcium dynamics in astrocyte processes during neurovascular coupling.</a> Nat Neurosci. 18 (2), 210-218 (2015).</li><li>Agarwal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+Opening+of+the+Mitochondrial+Permeability+Transition+Pore+Induces+Microdomain+Calcium+Transients+in+Astrocyte+Processes.">Transient Opening of the Mitochondrial Permeability Transition Pore Induces Microdomain Calcium Transients in Astrocyte Processes.</a> Neuron. 93 (3), 587-605 (2017).</li></ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Quatro etapas dentro do protocolo são fundamentais: 1) preparando a concentração HBEGF precisamente 5 ng/ml, uma vez que pequenos aumentos na concentração podem levar a culturas imaturas, por exemplo, 10 ng/mL HBEGF diferenciará de astrócitos4; 2) evita bolhas nas soluções que contêm tecidos ou células, que podem alterar o pH e impedir a saúde astrocyte; 3) pre-desenroscada mídia para atingir o pH ideal e a temperatura para o crescimento saudáveis astrócitos; 4) troca de ap...

Astrócitos influenciam a função cerebral através de suporte trófica, fluxo sanguíneo, sinalização sináptica e plasticidade e comunicação intercelular - todos os quais são mecanismos que giram em torno dos processos hamartomas finos. O protocolo AWESAM descrito aqui permite que o estudo desses processos sem interferência de neurônios e outro glia, que é útil , por exemplo, porque a expressão de muitas proteínas e até mesmo de Ca2 + sinalização se sobrepõem em toda célula cerebral diferente tipos. Além disso, este método supera as limitações das técnicas anteriormente disponíveis. Em particular, o nosso protocolo fornece na vivo-como morfologia (astrócitos estreladas com processos finos) e expressão gênica em um rápido, fácil e barata maneira.
Morfologia celular, expressão gênica e muitos outros processos regulatórios são diretamente influenciados pelo ambiente. Em um prato de cultura, refere-se a fatores liberados por células circundantes, mas também o meio no qual as células são cultivadas. Para astrócitos, HBEGF foi relatado anteriormente para induzir uma morfologia estrelado1 mas verificou-se, também, para diferenciar de astrócitos2. No entanto, concentrações de HBEGF foram usadas mais tarde para a geração mais na vivo-astrócitos como identificados por meio de sequenciamento de RNA em dois diferentes protocolos de3,4. Além disso, a morfologia astrocyte altera com a composição média, independentemente do protocolo4: Neurobasal médio com uma baixa concentração de HBEGF é ideal para o cultivo de astrócitos estrelados, enquanto outras composições médios (por exemplo, contendo soro DMEM) produzir células poligonais (mesmo em astrócitos recentemente isolados por immunopanning).
O protocolo AWESAM supera as desvantagens das técnicas anteriores para o cultivo de monoculturas astrocyte4. Técnicas anteriores para o cultivo de monoculturas astrocyte têm as seguintes desvantagens: morfologia poligonal, que é característico de astrócitos estrelado na vivo (método de MD)5; o comprimento e o custo do protocolo (astrócitos tomadas de células-tronco pluripotentes induzidas a preparar três meses e requer muitos reagentes, incluindo fatores de crescimento caros)6; as pequenas quantidades de material (método immunopanning)3; e a diferenciação dos astrócitos e exigência de uma matriz 3D (Puschmann et al.) 1 , 2. em contraste, o protocolo AWESAM fornece: no vivo-como morfologia (astrócitos estreladas com processos finos); um rápido, fácil e barato método; grandes quantidades de material; e a maioria na vivo-como expressão de gene em comparação com immunopanned e astrócitos MD. Além disso, permite a cultura 2D para o estudo da sinalização de Ca2 + e vesículas de reciclagem em finos processos e em eventos perto da membrana (por exemplo, microscopia TIRF não é possível em culturas 3D).
O método de MD tem sido usado extensivamente desde sua publicação em 19805, oferecendo uma técnica simples e rápida para monoculturas astrocyte poligonal. Em breve, o método de MD implica crescente neurónios misto no soro fetal bezerro (FCS)-contendo DMEM, seguido por etapas que enriquecem para astrócitos (como todas as outras células cerebrais tipos desanexar do prato) e mais cultura no mesmo meio a tremer. DMEM suplementado com FCS é usado para muitos outros tipos de células, variando de fibroblastos e adipócitos para linhas de células de câncer diferentes, os quais compartilham a morfologia poligonal exibida por astrócitos MD na cultura. Até o início dos anos 20007, pouco tinha sido dada a mídia sob medida para astrócitos, especificamente favorecer sua morfologia típica estrelada encontrado em vivo. Um protocolo publicado em 2011 alcançar tal morfologia estrelada: chamado o método immunopanning, emprega meio livre de soro otimizado para cultivo de astrócitos3. Usando este método, as células do cérebro recentemente isolada estão expostas a uma série de pratos revestidos com anticorpos que se destinam a proteínas de células específicas do tipo de célula superfície, enriquecer para astrócitos. Apesar do mais na vivo-como perfil morfologia e expressão de astrócitos immunopanned, a maioria dos estudos em vitro ainda depende do método de astrocyte MD. O método de MD é simples e rápido, enquanto o método de immunopanning é composto por etapas mais complexas e demoradas no primeiro dia da cultura (tais como longos períodos de digestão enzimática, estratificação cuidadosa das soluções de diferente densidade, immunopanning em si, e vários centrifugação passos - tudo isso antes de chapeamento). No entanto, usando o meio mais especializado, o método AWESAM oferece tanto a velocidade do método MD e o na vivo-como a morfologia do protocolo immunopanning.
Em geral, o protocolo AWESAM é útil para estudar mais na vivo-gosto de astrócitos em 2D monoculturas isolados dos neurônios e outro glia (como anteriormente caracterizadas4 por immunostainings immunoblots e sequenciamento de RNA). Ele permite o estudo de processos hamartomas finos e fornece grande acessibilidade para a visualização de Ca2 + sinalização espontânea e eventos perto da membrana (por exemplo, fotografada por microscopia TIRF).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="898">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">0.05% trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:171px;">Gibco</td>
			<td style="width:344px;">25300054</td>
			<td style="width:167px;">warm in 37 &#186;C waterbath before use</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.25% trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td>warm in 37 &#186;C waterbath before use</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">B-27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>50X stock</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>100X stock</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Penicillin / streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070-063</td>
			<td>50 stock; penicillin: 5000 U/ml; streptomycin: 5000 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td>without L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41966029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HBEGF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>4643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14170112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">FCS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10437028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010049</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">100 &#956;m nylon cell strainer</td>
			<td>BD</td>
			<td style="width:344px;">352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Trypan Blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8154&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cell culture incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Hera Cell 240i cell culture incubator</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Laboratory shaker</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td>Rotamax 120&#160;</td>
			<td>use inside cell culture incubator</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810 R&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culturing in vivo-like murine astrocytes using the fast, simple, and inexpensive awesam protocol

O AWESAM (um low-custo easy stellate umstrocyte method) protocolo implica uma maneira rápida, simples e barata para gerar grandes quantidades de in vivo-como monoculturas de rato e rato astrocyte : As células do cérebro podem ser isoladas de regiões diferentes do cérebro, e após uma semana de cultura de células, as células não-hamartomas são sacudidas, colocando os pratos de cultura num agitador para 6 h na incubadora. Os astrócitos restantes são então passados para novas placas com meio astrocyte específicos (denominado NB + H). NB + H contém baixas concentrações de heparina-ligação EGF fator de crescimento semelhante (HBEGF), que é usado no lugar de soro no meio. Após ter crescido em NB + H, astrócitos AWESAM têm uma morfologia estrelada e processos bem característica. Além disso, estes astrócitos têm mais na vivo-como expressão do gene que astrócitos gerados pelos métodos anteriormente publicados. Imagem latente de CA2 + , dinâmica de vesículas e outros eventos perto da membrana, portanto, podem ser estudados no bem processos hamartomas em vitro, por exemplo, usando a célula viva confocal ou microscopia TIRF. Notavelmente, astrócitos AWESAM também apresentam espontânea Ca2 + sinalização semelhante de astrócitos na vivo.

Astrócitos que são cultivados co com neurônios e cultivados em meios NB + aparecem estrelados após 2 semanas da cultura (Figura 2). Além de NB + médio, os astrócitos co cultos também estão expostos a fatores desconhecidos neurônio-derivado que provavelmente contribuem para a sua sobrevivência e morfologia. Em contraste, astrócitos MD crescidos em DMEM + como monoculturas (após agitação fora outros tipos de células antes de passagem) aparecem p...

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Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

O protocolo AWESAM descrito aqui é ideal para o cultivo de astrócitos murino em isolamento de outras células do cérebro de forma rápida, simples e barato. Astrócitos AWESAM exposição espontânea Ca2 + sinalização, morfologia e gene expressão perfis semelhantes de astrócitos na vivo.

Cultivo In Vivo-gosto murino astrócitos usando o protocolo AWESAM rápida, simples e barato

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

8.3K visualizações.  University of Oxford. O protocolo AWESAM descrito aqui é ideal para o cultivo de astrócitos murino em isolamento de outras células do cérebro de forma rápida, simples e barato. Astrócitos AWESAM exposição espontânea Ca2 + sinalização, morfologia e gene expressão perfis semelhantes de astrócitos na vivo.

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Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

Rápido Micro-iontoforese de glutamato e GABA: uma ferramenta útil para investigar Integração Synaptic

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Neurociência

Consensus Brain-derived Protein, Extraction Protocol for the Study of Human and Murine Brain Proteome Using Both 2D-DIGE and Mini 2DE Immunoblotting

Two-dimensional gel electrophoresis (2DE) is a powerful tool to uncover proteome modifications potentially related to different physiological or pathological conditions. Basically, this technique is based on the separation of proteins according to their isoelectric point in a first step, and secondly according to their molecular weights by SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). In this report an optimized sample preparation protocol for little amount of human post-mortem and mouse brain tissue is described. This method enables to perform both two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis (2D-DIGE) and mini 2DE immunoblotting. The combination of these approaches allows one to not only find new proteins and/or protein modifications in their expression thanks to its compatibility with mass spectrometry detection, but also a new insight into markers validation. Thus, mini-2DE coupled to western blotting permits to identify and validate post-translational modifications, proteins catabolism and provides a qualitative comparison among different conditions and/or treatments. Herein, we provide a method to study components of protein aggregates found in AD and Lewy body dementia such as the amyloid-beta peptide and the alpha-synuclein. Our method can thus be adapted for the analysis of the proteome and insoluble proteins extract from human brain tissue and mice models too. In parallel, it may provide useful information for the study of molecular and cellular pathways involved in neurodegenerative diseases as well as potential novel biomarkers and therapeutic targets.

A common protein extraction protocol using urea/thiourea/SDS buffer for human and mice brain tissue allows indentification of proteins by 2D-DIGE and their subsequent characterization by mini 2DE immunoblotting. This method enables one to obtain more reproducible and reliable results from human biopsies and experimental models.

Proteína Consenso Brain-derivada, protocolo de extração para o Estudo do cérebro humano e murino Proteome Usando ambas 2D DIGE e Mini 2DE Immunoblotting

Two-dimensional gel electrophoresis (2DE) is a powerful tool to uncover proteome modifications potentially related to different physiological or ...

A Simple and Inexpensive Method for Determining Cold Sensitivity and Adaptation in Mice

Cold hypersensitivity is a serious clinical problem, affecting a broad subset of patients and causing significant decreases in quality of life. The cold plantar assay allows the objective and inexpensive assessment of cold sensitivity in mice, and can quantify both analgesia and hypersensitivity. Mice are acclimated on a glass plate, and a compressed dry ice pellet is held against the glass surface underneath the hindpaw. The latency to withdrawal from the cooling glass is used as a measure of cold sensitivity.
Cold sensation is also important for survival in regions with seasonal temperature shifts, and in order to maintain sensitivity animals must be able to adjust their thermal response thresholds to match the ambient temperature. The Cold Plantar Assay (CPA) also allows the study of adaptation to changes in ambient temperature by testing the cold sensitivity of mice at temperatures ranging from 30 &#176;C to 5 &#176;C. Mice are acclimated as described above, but the glass plate is cooled to the desired starting temperature using aluminum boxes (or aluminum foil packets) filled with hot water, wet ice, or dry ice. The temperature of the plate is measured at the center using a filament T-type thermocouple probe. Once the plate has reached the desired starting temperature, the animals are tested as described above.
This assay allows testing of mice at temperatures ranging from innocuous to noxious. The CPA yields unambiguous and consistent behavioral responses in uninjured mice and can be used to quantify both hypersensitivity and analgesia. This protocol describes how to use the CPA to measure cold hypersensitivity, analgesia, and adaptation in mice.

The Cold Plantar Assay (CPA) measures cold responsiveness between 30 &#176;C and 5 &#176;C, and can also measure cold adaptation. This protocol describes how to use the CPA to measure cold hypersensitivity, analgesia, and adaptation in mice.

Um método simples e barato para a determinação da sensibilidade Fria e Adaptação no Mice

Cold hypersensitivity is a serious clinical problem, affecting a broad subset of patients and causing significant decreases in quality of life.  The cold ...

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify their functional and structural properties, a condition called reactive astrogliosis. Here, a protocol for assessment of the morphological properties of astrocytes is presented. This protocol includes quantification of 12 different parameters i.e. the surface area and volume of the tissue covered by an astrocyte (astrocyte territory), the entire astrocyte including branches, cell body, and nucleus, as well as total length and number of branches, the intensity of fluorescence immunoreactivity of antibodies used for astrocyte detection, and astrocyte density (number/1,000 &#181;m2). For this purpose three-dimensional (3D) confocal microscopic images were created, and 3D image analysis software such as Volocity 6.3 was used for measurements. Rat brain tissue exposed to amyloid beta1-40 (A&#946;1-40) with or without a therapeutic&#160;intervention was used to present the method. This protocol can also be used for 3D morphometric analysis of other cells from either in vivo or in vitro conditions.

Astrocytes in the CNS change their functional and structural properties in response to harmful stimuli. This report presents a protocol for assessment of three-dimensional astrocyte morphology in diseased conditions or after therapeutic interventions.

Protocolo para tridimensional confocal morfométrica Análise de astrócitos

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

We describe a protocol for measuring ethanol self-administration in fruit flies (Drosophila melanogaster) as a proxy for changes in reward states. We demonstrate a simple way to tap into the fly reward system, modify experiences related to natural reward, and use voluntary ethanol consumption as a measure for changes in reward states. The approach serves as a relevant tool to study the neurons and genes that play a role in experience-mediated changes of internal state. The protocol is composed of two discrete parts: exposing the flies to rewarding and nonrewarding experiences, and assaying voluntary ethanol consumption as a measure of the motivation to obtain a drug reward. The two parts can be used independently to induce the modulation of experience as an initial step for further downstream assays or as an independent two-choice feeding assay, respectively. The protocol does not require a complicated setup and can therefore be applied in any laboratory with basic fly culture tools.

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

We describe a protocol for inducing rewarding and nonrewarding experiences in fruit flies (Drosophila melanogaster) using voluntary ethanol consumption as a measure for changes in reward states.

Uma maneira simples para medir alterações na Recompensa comportamento de busca Usando<em&gt; Drosophila melanogaster</em

We describe a protocol for measuring ethanol self-administration in fruit flies (Drosophila melanogaster) as a proxy for changes in reward states. We ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the molecular and cellular basis of higher brain functions. A whole-mount preparation of adult brains with well-preserved morphology is critical for such whole brain-based studies, but can be technically challenging and time-consuming. This protocol describes an easy-to-learn, one-step dissection approach of an adult fly head in less than 10 s, while keeping the intact brain attached to the rest of the body to facilitate subsequent processing steps. The procedure helps remove most of the eye and tracheal tissues normally associated with the brain that can interfere with the later imaging step, and also places less demand on the quality of the dissecting forceps. Additionally, we describe a simple method that allows convenient flipping of the mounted brain samples on a coverslip, which is important for imaging both sides of the brains with similar signal intensity and quality. As an example of the protocol, we present an analysis of dopaminergic (DA) neurons in adult brains of WT (w1118) flies. The high efficacy of the dissection method makes it particularly useful for large-scale adult brain-based studies in Drosophila.

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

The adult Drosophila brain is a valuable system for studying neuronal circuitry, higher brain functions, and complex disorders. An efficient method to dissect whole brain tissue from the small fly head will facilitate brain-based studies. Here we describe a simple, one-step dissection protocol of adult brains with well-preserved morphology.

Um de uma etapa simples protocolo de dissecação para Whole mount-Preparação do Adulto<em&gt; Drosophila</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Analyzing the Size, Shape, and Directionality of Networks of Coupled Astrocytes

It has become increasingly clear that astrocytes modulate neuronal function not only at the synaptic and single-cell levels, but also at the network level. Astrocytes are strongly connected to each other through gap junctions and coupling through these junctions is dynamic and highly regulated. An emerging concept is that astrocytic functions are specialized and adapted to the functions of the neuronal circuit with which they are associated. Therefore, methods to measure various parameters of astrocytic networks are needed to better describe the rules governing their communication and coupling and to further understand their functions.
Here, using the image analysis software (e.g., ImageJFIJI), we describe a method to analyze confocal images of astrocytic networks revealed by dye-coupling. These methods allow for 1) an automated and unbiased detection of labeled cells, 2) calculation of the size of the network, 3) computation of the preferential orientation of dye spread within the network, and 4) repositioning of the network within the area of interest.
This analysis can be used to characterize astrocytic networks of a particular area, compare networks of different areas associated to different functions, or compare networks obtained under different conditions that have different effects on coupling. These observations may lead to important functional considerations. For instance, we analyze the astrocytic networks of a trigeminal nucleus, where we have previously shown that astrocytic coupling is essential for the ability of neurons to switch their firing patterns from tonic to rhythmic bursting1. By measuring the size, confinement, and preferential orientation of astrocytic networks in this nucleus, we can build hypotheses about functional domains that they circumscribe. Several studies suggest that several other brain areas, including the barrel cortex, lateral superior olive, olfactory glomeruli, and sensory nuclei in the thalamus and visual cortex, to name a few, may benefit from a similar analysis.

Here we present a protocol to assess the organization of astrocytic networks. The described method minimizes bias to provide descriptive measures of these networks such as cell count, size, area, and position within a nucleus. Anisotropy is assessed with a vectorial analysis.

Analisando o tamanho, forma e direcionalidade das redes de astrócitos acoplados

It has become increasingly clear that astrocytes modulate neuronal function not only at the synaptic and single-cell levels, but also at the network ...

An Emerging Target Paradigm to Evoke Fast Visuomotor Responses on Human Upper Limb Muscles

To reach towards a seen object, visual information has to be transformed into motor commands. Visual information such as the object&#8217;s color, shape, and size are processed and integrated within numerous brain areas, then ultimately relayed to the motor periphery. In some instances, a reaction is needed as fast as possible. These fast visuomotor transformations, and their underlying neurological substrates, are poorly understood in humans as they have lacked a reliable biomarker. Stimulus-locked responses (SLRs) are short latency (&#60;100 ms) bursts of electromyographic (EMG) activity representing the first wave of muscle recruitment influenced by visual stimulus presentation. SLRs provide a quantifiable output of rapid visuomotor transformations, but SLRs have not been consistently observed in all subjects in past studies. Here we describe a new, behavioral paradigm featuring the sudden emergence of a moving target below an obstacle that consistently evokes robust SLRs. Human participants generated visually guided reaches toward or away from the emerging target using a robotic manipulandum while surface electrodes recorded EMG activity from the pectoralis major muscle. In comparison to previous studies that investigated SLRs using static stimuli, the SLRs evoked with this emerging target paradigm were larger, evolved earlier, and were present in all participants. Reach reaction times (RTs) were also expedited in the emerging target paradigm. This paradigm affords numerous opportunities for modification that could permit systematic study of the impact of various sensory, cognitive, and motor manipulations on fast visuomotor responses. Overall, our results demonstrate that an emerging target paradigm is capable of consistently and robustly evoking activity within a fast visuomotor system.

Presented here is a behavioral paradigm that elicits robust fast visuomotor responses on human upper limb muscles during visually guided reaches.

Um paradigma de alvo emergente para evocar respostas rápidas do visuomotor sobre músculos dos membros superiores humanos

To reach towards a seen object, visual information has to be transformed into motor commands. Visual information such as the object&#8217;s color, shape, ...

In vitro Modeling for Neurological Diseases using Direct Conversion from Fibroblasts to Neuronal Progenitor Cells and Differentiation into Astrocytes

Research on neurological disorders focuses primarily on the impact of neurons on disease mechanisms. Limited availability of animal models severely impacts the study of cell type specific contributions to disease. Moreover, animal models usually do not reflect variability in mutations and disease courses seen in human patients. Reprogramming methods for generation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) have revolutionized patient specific research and created valuable tools for studying disease mechanisms. However, iPSC technology has disadvantages such as time, labor commitment, clonal selectivity and loss of epigenetic markers. Recent modifications of these methods allow more direct generation of cell lineages or specific cell types, bypassing clonal isolation or a pluripotent stem cell state. We have developed a rapid direct conversion method to generate induced Neuronal Progenitor Cells (iNPCs) from skin fibroblasts utilizing retroviral vectors in combination with neuralizing media. The iNPCs can be differentiated into neurons (iNs) oligodendrocytes (iOs) and astrocytes (iAs). iAs production facilitates rapid drug and disease mechanism testing as differentiation from iNPCs only takes 5 days. Moreover, iAs are easy to work with and are generated in pure populations at large numbers. We developed a highly reproducible co-culture assay using mouse GFP+ neurons and patient derived iAs to evaluate potential therapeutic strategies for numerous neurological and neurodegenerative disorders. Importantly, the iA assays are scalable to 384-well format facilitating the evaluation of multiple small molecules in one plate. This approach allows simultaneous therapeutic evaluation of multiple patient cell lines with diverse genetic background. Easy production and storage of iAs and capacity to screen multiple compounds in one assay renders this methodology adaptable for personalized medicine.

We describe a protocol to reprogram human skin-derived fibroblasts into induced Neuronal Progenitor Cells (iNPCs), and their subsequent differentiation into induced Astrocytes (iAs). This method leads to fast and reproducible generation of iNPCs and iAs in large quantities.

Modelagem in vitro para doenças neurológicas usando conversão direta de fibroblastos para células progenitoras neuronais e diferenciação em astrócitos

Research on neurological disorders focuses primarily on the impact of neurons on disease mechanisms. Limited availability of animal models severely ...

Imaging Mitochondrial Ca2+ Uptake in Astrocytes and Neurons using Genetically Encoded Ca2+ Indicators (GECIs)

Mitochondrial Ca2+ plays a critical role in controlling cytosolic Ca2+ buffering, energy metabolism, and cellular signal transduction. Overloading of mitochondrial Ca2+ contributes to various pathological conditions, including neurodegeneration and apoptotic cell death in neurological diseases. Here we present a cell-type specific and mitochondria targeting molecular approach for mitochondrial Ca2+ imaging in astrocytes and neurons in vitro and in vivo. We constructed DNA plasmids encoding mitochondria-targeting genetically encoded Ca2+ indicators (GECIs) GCaMP5G or GCaMP6s (GCaMP5G/6s) with astrocyte- and neuron-specific promoters gfaABC1D and CaMKII and mitochondria-targeting sequence (mito-). For in vitro mitochondrial Ca2+ imaging, the plasmids were transfected in cultured astrocytes and neurons to express GCaMP5G/6s. For in vivo mitochondrial Ca2+ imaging, adeno-associated viral vectors (AAVs) were prepared and injected into the mouse brains to express GCaMP5G/6s in mitochondria in astrocytes and neurons. Our approach provides a useful means to image mitochondrial Ca2+ dynamics in astrocytes and neurons to study the relationship between cytosolic and mitochondrial Ca2+ signaling, as well as astrocyte-neuron interactions.

Imaging Mitochondrial Ca2+ Uptake in Astrocytes and Neurons using Genetically Encoded Ca2+ Indicators GECIs

This proctocol aims to provide a method for in vitro and in vivo mitochondrial Ca2+ imaging in astrocytes and neurons.

Imagem Mitocondrial Ca2+ Absorção em Astrócitos e Neurônios usando Indicadores Ca2+ Codificados Geneticamente (GECIs)

Mitochondrial Ca2+ plays a critical role in controlling cytosolic Ca2+ buffering, energy metabolism, and cellular signal transduction. Overloading of ...