Os autores gostaria de agradecer Glenn Sanger-Hodgson, especialista em mídia na faculdade de medicina de FSU, pelo seu trabalho na produção de vídeo, edição e locução.
Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health (R01GM100474 e R01GM072611).

Os métodos descritos aqui e na seção 2 foram aprovados pelo Comitê de uso (IACUC) e Florida estado Universidade institucional Cuidado Animal e segue as directrizes estabelecidas no guia para o cuidado e uso de animais de laboratório, 8ª edição . Todos os animais utilizados no presente no presente protocolo são casa em um centro de animais de laboratório dedicado até o uso. Nenhuma experimentação na vivo foi realizado antes do sacrifício. Número de animais foram baseado na necessidade experimental usando a célula média e coleções de mielina, como um guia a fim de minimizar o uso.
Nota: Este protocolo descreve a geração de macrófagos derivados da medula óssea (BMDMs) (secção 1), a preparação dos restos de mielina fluorescente etiquetadas derivado do cérebro (seção 2), o procedimento geral para a análise de fagocitose de restos de mielina (seção 3), e o procedimento geral para análise de acumulação de lipídios de detritos de mielina (secção 4). Preparação do reagente, celular colheita e manipulação, coleção de mielina e rotulagem e ensaio de desempenho devem ser concluídas em uma fluxo de ar laminar de biossegurança do armário.
1. geração de macrófagos derivados da medula óssea primárias
<ol>
	<li>Preparação do meio de cultura completo macrófago (CMCM) Nota: geração de macrófagos da medula óssea requer o uso de fator colônia-estimulando do macrófago (M-CSF). Esta preparação utiliza mídia de fibroblasto murino condicionado L929 como fonte de M-CSF.<ol>
		<li>Gere mídia de fibroblasto murino condicionado L929 por cultivo de células em pratos de 145 mm com 50 mL de glicose elevada (4500 mg/L, L-glicose) Dulbecco modificado águia médio (DMEM) suplementado com 5% de soro de bezerro nascido novo (NCS) e penicilina/estreptomicina por 7 dias.</li>
		<li>Recolher meios de culturas em tubos de centrifuga conico de 50 mL e centrifugar durante 30 minutos a 3500 x g, 4 ° C.</li>
		<li>Filtrar sobrenadantes através de um filtro de seringa 0,2 µm para um novo tubo de centrifuga conico de 50 mL. Condicionado de mídia pode ser armazenadas a-80 ° C por até 6 meses.</li>
		<li>A glicose alta DMEM, adicionar 5% vol/vol NCS, 15% vol/vol L929 murino fibroblasto condicionado DMEM e 1% penicilina/estreptomicina. Meios de comunicação podem ser armazenados a 4 ° C durante 2-3 meses. Aquecido a 37 ° C antes do uso.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Coleção de células primárias da medula óssea e indução de macrófagos 
	Nota: Usando este um mouse protocolo irá gerar aproximadamente 20 milhões derivadas da medula óssea macrófagos (BMDMs).<ol>
		<li>Eutanásia o número desejado de semana de 8-10 ratos velhos usando padrão CO2 diretrizes de asfixia seguidos por deslocamento cervical.</li>
		<li>Higienizar o animal usando 70% (vol/vol) etanol: H2O, saturando o pelo.</li>
		<li>Cortar uma pequena abertura no abdômen e puxe cuidadosamente a pele para revelar o tecido subjacente. Tome cuidado para não perfurar a cavidade peritoneal.</li>
		<li>Remova ambas as pernas traseiras, começando no quadril e terminando na altura da tornozelo. Lugar do tecido coletado em um prato de Petri de 100mm contendo fosfato estéril de 5-10 mL tampão salino (PBS) suplementado com 1% penicilina/estreptomicina. 
		Nota: Quando processar vários animais certifique-se de manter os pratos no gelo para limitar a degradação do tecido.</li>
		<li>Retire o músculo e tecido conjuntivo do osso usando um bisturi. Apenas o fêmur e a tíbia são utilizados para coleta de célula, a fíbula pode ser descartada.</li>
		<li>Expor a cavidade da medula dos ossos recolhidos por aparar uma pequena secção de cada extremidade com um bisturi.</li>
		<li>Usando uma agulha 25g, irrigue as cavidades da medula com CMCM em um tubo de centrifuga conico de 50 mL. Os ossos aparecerá brancos, uma vez que eles têm sido suficientemente liberados.</li>
		<li>Concluída a coleta, agite aspirados com uma agulha de 18g por 30-90 s gerado uma suspensão de célula única. 
		Nota: Um passo de Lise opcional – glóbulos vermelhos (RBC) pode ser realizado neste momento. Recentemente tem sido sugerido que o teor de ferro intracelular pode influenciar os efeitos dos restos de mielina em macrófago polarização16. Para obter informações sobre a inclusão de uma etapa de Lise RBC referir-Trouplin et al. 17.</li>
		<li>Filtre a suspensão através de um filtro de célula estéril 70 µm para um novo tubo de centrifuga conico de 50 mL.</li>
		<li>Sementes coletadas células uniformemente em pratos de cultura celular de 145 mm com 15-20 mL CMCM. Use aproximadamente três pratos de cultura por rato sacrificado. Incube as culturas a 37 ° C, 5% de CO2.</li>
		<li>Após 72 horas lavar pratos uma vez com PBS estéril para remover as células não-aderentes, em seguida, adicione 15-20mL CMCM fresco. Incube as culturas por mais 4 dias a 37 ° C, 5% de CO2. Após 7 dias de cultura total, as células hematopoiéticas da medula óssea inicialmente isoladas será maduros BMDMs (Figura 1).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. geração de detritos de mielina fluorescente etiquetadas derivado do cérebro
Nota: Todos os reagentes podem ser armazenados a 4 ° C por até 1 mês.
<ol>
	<li>Preparação dos reagentes de coleção de restos de mielina
	<ol>
		<li>Preparar Tris· Solução-tampão de CL.<ol>
			<li>A 800mL água destilada deionizada H2O (ddiH2O) adicionar 20 mL de 1 M Tris· CL, pH 7,45 (concentração final de 20 mM) e 20 mL de 100mm Na2EDTA (concentração final de 2 mM).</li>
			<li>Ajuste o pH a 7,45. Ajuste o volume para 1000 mL com ddiH2solução de filtro de O. através de uma unidade de filtração 0,2 µm.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Prepare a solução de sacarose 1M.<ol>
			<li>A 100 mL de Tris· CL solução de tampão, adicionar 68,46 g de sacarose. Ajustar o volume de 200 mL com Tris· Solução-tampão de CL. Filtre a solução através de uma unidade de filtração de 0,2 µm.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Preparar 200 mL de solução de sacarose de 0,32 M diluindo a solução 1 M com a Tris· CL 0.83:0.16 de solução tampão (vol/vol).</li>
		<li>Preparar 150 mL de solução de sacarose de 0,83 M diluindo a solução 1 M com a Tris· CL 0.83:0.16 de solução tampão (vol/vol).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Coleção de restos de mielina bruto derivado do cérebro 
	Nota: O método de coleta descrito aqui é para o isolamento dos restos de mielina bruto.<ol>
		<li>Eutanásia em ratos de 10-12 8-10 semanas de idade usando padrão CO2 diretrizes de asfixia seguidas por deslocamento cervical.</li>
		<li>Dissecar o cérebro e os coloque em um prato de 100 mm, contendo 10 mL de solução de sacarose de 0,32 M.</li></ol></li></ol>Mantenha o prato no gelo.
		<li>Usando a tesoura cirúrgica estéril, cortar o cérebro em pedaços de aproximadamente 5 mm3 no tamanho.</li>
		<li>Transferir o tecido para um tubo de centrifuga conico de 50 mL e adicionar cerca de 30 mL de solução de sacarose de 0,32 M.</li>
		<li>Homogeneizar com um homogenizador giratório portátil estéril, até que seja alcançada uma solução suave.</li>
		<li>Dilua o cérebro homogeneizado até um volume final de 90 mL com solução de sacarose de 0,32 M.</li>
		<li>Para seis tubos de 38,5 mL paredes finas polipropileno se, adicione 20 mL de solução de sacarose de 0,83 M.</li>
		<li>Delicadamente, adicione a solução de cérebro homogeneizado para o topo da solução de sacarose de 0,83 M, tomando cuidado para não misturar as duas camadas.</li>
		<li>Contrapeso de cada tubo com a solução de sacarose de 0,32 M.</li>
		<li>Centrifugar a 100.000 x g por 45 min a 4° C, usando um apropriado pre-refrigeração rotor se. Conjunto rotor aceleração e desaceleração para seus valores mínimos para reduzir a perda de restos de mielina.</li>
		<li>Recolha os restos de mielina da interface das duas densidades de sacarose. 
		Nota: os detritos devem aparecer como uma faixa branca em direção ao centro do tubo.</li>
		<li>Combinar os restos de mielina bruto em um tubo de centrifuga conico de 50 mL e ajustar o volume a cerca de 35 mL, usando Tris· Solução-tampão de CL.</li>
		<li>Homogeneizar os restos de mielina bruto com um homogenizador giratório portátil estéril para 30-60 s.</li>
		<li>Divida uniformente a suspensão entre 6 tubos se limpa e equilíbrio com um volume adequado de Tris· Solução-tampão de CL.</li>
		<li>Centrifugar a 100.000 x g por 45 min a 4° C, usando um apropriado pre-refrigeração rotor se. Conjunto rotor aceleração e desaceleração para seus valores máximos.</li>
		<li>Como sólidas brancas pelotas agora será visíveis, desprezar o sobrenadante e ressuspender as pelotas em 10-15 mL de Tris· Solução-tampão de CL.</li>
		<li>Divida uniformente a suspensão entre 2 tubos se limpa e equilíbrio com um volume adequado de Tris· Solução-tampão de CL.</li>
		<li>Centrifugar novamente a 100.000 x g durante 45 min a 4 ° C, usando um apropriado pre-refrigeração rotor se. Conjunto rotor aceleração e desaceleração para seus valores máximos.</li>
		<li>Desprezar o sobrenadante e ressuspender as bolas em 5-6 mL de PBS estéril e dividir a suspensão entre um número adequado de tubos de microcentrífuga pré-pesados 1,5 mL.</li>
		<li>Centrifugar a 22.000 x g durante 10 minutos a 4 ° C.</li>
		<li>Desprezar o sobrenadante e determinar o peso das pelotas de restos de mielina.</li>
		<li>Re-suspenda as pelotas em PBS para uma concentração final de 100 mg/mL. 
		Nota: dez ou doze cérebro é suficiente para produzir 10-15 mL de restos de mielina de 100 mg/mL. Os restos de mielina podem ser loja a-80 ° C por 6 meses.</li>
	
	
	<li>Os restos de mielina fluorescente rotulagem
	<ol>
		<li>Prepare a solução 50 µM carboxyfluorescein succinimidil éster (CFSE) imediatamente antes do uso.<ol>
			<li>Usando o PBS estéril, dilua uma solução stock de 5 mM de CFSE preparado com 100% dimetilsulfóxido (DMSO) a uma concentração final de trabalho de 50 µM.</li>
			<li>Filtrar a solução através de um filtro de seringa 0,2 µm.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Descongele a quantidade desejada de restos de mielina de 100 mg/mL e ressuspender com uma agulha estéril de 29 g. 
		Nota: congelar os restos de mielina fará com que a largar a solução que exigem re-suspensão antes do uso.</li>
		<li>Transferi os restos de mielina para um tubo de centrífuga de micro pré-pesados 1,5 mL.</li>
		<li>Centrifugar a 14.800 x g durante 10 minutos a 4° C. Desprezar o sobrenadante.</li>
		<li>Resuspenda os restos de mielina em 200 µ l de solução CFSE por restos de mielina 100 µ l peletizado.</li>
		<li>Incube durante 30 min à temperatura (RT), protegida da luz.</li>
		<li>Centrifugar a 14.800 x g durante 10 minutos a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante.</li>
		<li>Resuspenda o pellet em 600-800 µ l de tampão de lavagem (0,2 µm filtro esterilizado glicina 100mm em PBS).</li>
		<li>Centrifugar a 14.800 x g durante 10 minutos a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante.</li>
		<li>Repita as etapas 2.3.8-2.3.9 mais duas vezes.</li>
		<li>Após a lavagem final, determinar o peso da pelota de restos de mielina e ressuspender a 100 mg/mL com PBS estéril. Nota: Os restos de mielina rotulado podem ser loja a-80 ° C por até 6 meses.</li>
	</ol>
	</li>

3. a mielina ensaio de fagocitose de detritos
Nota: O seguinte é o método básico para observar a fagocitose de restos de mielina fluorescente etiquetadas. Adição de outros tratamentos e condições experimentais precisará ser otimizado pelo investigador.
<ol>
	<li>Preparação de placas de tratamento
	<ol>
		<li>Para cada placa de 145 mm, colete BMDMs maduros em um tubo de centrifuga conico de 15 mL com 5-6 mL de ácido etilenodiaminotetracético de 10mm (EDTA) em fosfato salino de Dulbecco (dPBS) (pH 7,4). 
		Nota: Não utilize tripsina pois ele pode alterar o estado de ativação de células18.</li>
		<li>Adicione um volume igual de CMCM pré-aquecido a cada tubo de células coletadas.</li>
		<li>Centrifugar a 180 x g por 8 min a 20 ° C. Desprezar o sobrenadante.</li>
		<li>Ressuspender as células em CMCM e contagem.</li>
		<li>A cada poço de uma placa de cultura de células 24 poços, adicione 1 x 105 células em 1 mL de CMCM.</li>
		<li>Incube a 37 ° C, 5% de CO2 por 24 h.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Análise e tratamento de resíduos de mielina
	<ol>
		<li>Adicione 10 µ l de 100 mg/mL CFSE rotulado os restos de mielina de cada bem (concentração final de 1 mg/mL).</li>
		<li>Incube durante 1-3 horas a 37 ° C, 5% de CO2.</li>
		<li>Lave a placa 3 vezes com PBS estéril para remover restos de mielina não engolido.</li>
		<li>Adicione 400 µ l de paraformaldeído 4% a cada poço. Incubar durante 30 min à RT.</li>
		<li>Lave a placa 2 vezes com PBS estéril.</li>
		<li>Adicione 400 µ l de solução de Hoechst 33258 a cada poço. Incube durante 5 min à RT, protegido da luz.</li>
		<li>Lave pratos 2 vezes com PBS estéril.</li>
		<li>Adicione 200 µ l de Fluoro-gel com tampão Tris a cada poço para reduzir fotobranqueamento.</li>
		<li>Células de imagem usando um microscópio capaz de epi-fluorescente invertido. 
		Nota: Os excitação e emissão de comprimentos de onda de CFSE são 494 nm e 521 nm, respectivamente.</li>
		<li>Divida o número de células positivas CFSE pelo número de núcleos para determinar a absorção de restos de mielina relativo.</li>
		<li>Antes da imagem latente, manter as placas por até 7 dias a 4 ° C, protegido da luz.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. quantificação dos lipídios intracelulares através de coloração de vermelho-O óleo
Nota: O seguinte é o método básico para a observação de lipídios intracelulares de mielina-detritos derivados.O uso de CFSE rotulado os restos de mielina não é recomendado para quantificação fluorescente de ORO de coloração devido à sobreposição espectral. Adição de outros tratamentos e condições experimentais precisará ser otimizado pelo investigador.
<ol>
	<li>Preparação de soluções de coloração
	<ol>
		<li>Prepare a solução de coloração vermelho-O óleo (ORO) 0,5%.<ol>
			<li>Lentamente, adicionar 100 mL de propilenoglicol 100% (1,2-propanodiol) a 0,5 g de ORO (1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol), agitando.</li>
			<li>Aqueça a 95 ° C por 15 min ou até que todas as partículas grandes são dissolvidas. 
			Nota: Não aqueça acima de 100 ° C.</li>
			<li>Filtrar a solução através de um pedaço de papel de filtro, enquanto ainda quente em um novo recipiente.</li>
			<li>Permitir que a solução legal durante a noite no RT. solução pode ser armazenada por até 1 ano no RT</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Prepare a solução de glicol de propileno de 85%.<ol>
			<li>Adicione 85 mL de propilenoglicol 100% para 15 mL de ddiH2O. mexa até misturado. Solução pode ser armazenada por até 1 ano no RT</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Preparação de placas de tratamento
	<ol>
		<li>Prepare uma placa de 24 seguindo o método descrito na seção 3.</li>
		<li>Incube a 37 ° C, 5% de CO2 por 24 h.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Tratamento de detritos de mielina
	<ol>
		<li>Adicione 10 µ l de restos de mielina de 100 mg/mL a cada poço (concentração final de 1 mg/mL).</li>
		<li>Incube durante 1-3 h a 37 ° C, 5% de CO2.</li>
		<li>Lave a placa 3 vezes com PBS estéril para remover restos de mielina não digerido. Nota: Neste ponto, placas podem também sofrer fixação imediata ou CMCM fresca pode ser adicionada, e células retornou a incubação por pontos de tempo adicional.</li>
		<li>Adicione 400 µ l de paraformaldeído 4% a cada poço. Incubar durante 30 min à RT.</li>
		<li>Lave a placa 2 vezes com PBS estéril então, procced à mancha.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Coloração de ORO e análise
	<ol>
		<li>Lave a placa fixa 3 vezes com ddiH2O.</li>
		<li>Adicione 400 µ l de propileno glicol de 100% a cada poço e incubar durante 5 min à RT 
		Nota: isto irá reduzir o reporte de ddiH2O.</li>
		<li>Aspirar o propilenoglicol e adicione 400 µ l de solução ORO a cada poço.</li>
		<li>Incubar durante 8 min a 60 ° C.</li>
		<li>Aspire a solução ORO. Em seguida, adicione 400 µ l de 85% propilenoglicol a cada poço e incubar durante 5 minumintes no RT</li>
		<li>Lavar a placa 3 vezes com ddiH2O.</li>
		<li>Adicione 400 µ l de solução de Hoechst 33258 a cada poço. Incube durante 5 min à RT, protegido da luz.</li>
		<li>Lave pratos 2 vezes com PBS estéril.</li>
		<li>Adicione 200 µ l de Fluoro-gel com tampão Tris a cada poço.</li>
		<li>Células de imagem usando um microscópio capaz de epi-fluorescente invertido. ORO pode ser fotografada usando um conjunto padrão de filtro vermelho Texas ou DsRed.</li>
		<li>Quantificar de retenção relativo lipídios determinando a área positiva de ORO em cada campo de imagem e dividindo-o pelo número de núcleos.</li>
		<li>Manter as placas durante 7 dias a 4 ° C protegido da luz.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
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(81), e50966 (2013).</li><li>Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Detachment+Methods+on+M2+Macrophage+Phenotype+and+Function.">Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function.</a> J Immunol Methods. 426, 56-61 (2015).</li><li>Guo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescuing+macrophage+normal+function+in+spinal+cord+injury+with+embryonic+stem+cell+conditioned+media.">Rescuing macrophage normal function in spinal cord injury with embryonic stem cell conditioned media.</a> Mol Brain. 9 (1), 48 (2016).</li><li>Bosco, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+synthetic+matrix+metalloproteinase+inhibitor+reduces+human+mesenchymal+stem+cell+adipogenesis.">A new synthetic matrix metalloproteinase inhibitor reduces human mesenchymal stem cell adipogenesis.</a> PLOS ONE. 12 (2), e0172925 (2017).</li><li>Ram&#237;rez-Zacar&#237;as, J. L., Castro-Mu&#241;ozledo, F., Kuri-Harcuch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+adipose+conversion+and+triglycerides+by+staining+intracytoplasmic+lipids+with+oil+red+O.">Quantitation of adipose conversion and triglycerides by staining intracytoplasmic lipids with oil red O.</a> Histochem. 97 (6), 493-497 (1992).</li><li>Koopman, R., Schaart, G., Hesselink, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimisation+of+oil+red+staining+permits+combination+with+immunofluorescence+and+automated+quantification+of+lipids.">Optimisation of oil red staining permits combination with immunofluorescence and automated quantification of lipids.</a> Histochem Cell Biol. 116 (1), 63-68 (2001).</li><li>Fang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide-Induced+Macrophage+Inflammatory+Response+Is+Regulated+by+SHIP.">Lipopolysaccharide-Induced Macrophage Inflammatory Response Is Regulated by SHIP.</a> J Immunol. 173 (1), (2004).</li><li>Martinez, F. O., Sica, A., Mantovani, A., Locati, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+activation+and+polarization.">Macrophage activation and polarization.</a> Front Biosci. 13, (2008).</li><li>Mosser, D. M., Edwards, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+full+spectrum+of+macrophage+activation.">Exploring the full spectrum of macrophage activation.</a> Nat Rev Immunol. 8 (12), 958-969 (2008).</li></ol>

Os autores têm sem divulgações.

Os procedimentos descritos aqui utilizam ambos recém isolados restos de mielina CNS bruto e macrófagos derivados da medula óssea primários. Para reduzir despesas do animais, é recomendável que os cérebros e células da medula óssea de cada rato ser colhidas no momento do sacrifício. Dois pesquisadores trabalhando juntos podem preparar ambos os materiais simultaneamente. Alternativamente, os cérebros podem ser armazenados a-80 ° C em PBS suplementadas com antibióticos antes de isolamento de restos de mielina. ...

Macrófagos derivados da medula óssea (BMDMs) são um elo importante entre os sistemas imune inatos e adaptativos. Como células apresentadoras de (APCs), eles podem se comunicar com os linfócitos através de ambos apresentação de antigénios e liberação de citocinas1,2,3. No entanto, como fagócitos profissionais, sua principal função é limpar patógenos, células envelhecidas e restos celulares1,4. Na sequência de uma lesão na medula espinal (SCI), quantidades substanciais de restos de mielina é gerada a partir de oligodendrócitos moribundos, o tipo de célula responsável pela CNS axônio mielinização5. Nós e os outros têm mostrado que o afastamento dos restos de mielina é sobretudo da responsabilidade de infiltração BMDMs5,6,7. No entanto, dentro da lesão da medula espinhal com a duração de sites de restos de mielina tem sido sugerida para deslocar estas células normalmente anti-inflamatórios no sentido de um estado pro-inflamatórios5,8,9. Como principais mediadores neuro-inflamação na medula espinhal lesada, BMDMs são alvos clínicos importantes.
Para ajudar a investigar a influência da BMDMs na medula espinhal lesada, desenvolvemos um modelo in vitro para estudar diretamente como BMDMs responder aos restos de mielina. Para melhorar a relevância biológica, tanto BMDMs murino primários e os restos de mielina recentemente isoladas são usados nestas investigações. Como tal, os métodos apresentados aqui também detalham o isolamento e a cultura de BMDMs murino primários e derivado de uma técnica de gradiente de sacarose modificada usada para isolar o CNS murino mielina detritos10,11,12. Os restos de mielina podem prontamente ser rotulados com um corante fluorescente, carboxyfluorescein succinimidil éster (CFSE), para acompanhar que sua internalização por BMDMs. CFSE é bem adequada para esta aplicação, porque é não citotóxicas e suas licenças de espectro estreito fluorescente multiplexação com outras fluorescentes sondas13,14. Após a fagocitose, lipídios de restos de mielina são transportados através de lisossomos e empacotados como lipídios neutros em gotículas de lipídios intracelular5. Para quantificar este acúmulo intracelular de lipídios, apresentamos um óleo vermelho O ORO () método otimizado para análise quantitativa de imagem de coloração. Este método de coloração simples produz resultados reprodutíveis robustos e quantificação de15. Esses métodos facilitam o estudo da mielina detritos fagocitose e lipídios de retenção com equipamento especializado limitada.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30243.01</td><td>High glucose with L-glutamine, sodium pyruvate</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin Solution</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td>100X Solution</td></tr><tr><td>New Born Calf Serum (NCS)</td><td>Rocky Mountain Biologics</td><td>NBS-BBT-5XM</td><td>United States Origin</td></tr><tr><td>NCTC clone 929 [L cell, L-929, derivative of Strain L]&amp;nbsp;</td><td>ATCC</td><td>CCL-1</td><td>L929 Cell Line of Conditioned Media Preparation</td></tr><tr><td>24-well Cell Culture Plates</td><td>VWR</td><td>10062-896&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Cell Culture Dish</td><td>Greiner Bio-One</td><td>639960</td><td>Polystyrine, 145/20mm</td></tr><tr><td>CFSE Cell Proliferation Kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>C34570</td><td>DMSO for Reconsitution Provided</td></tr><tr><td>Fluoro-gel with Tris Buffer&amp;nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>17985-11</td><td></td></tr><tr><td>Oil Red O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>O0625</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Materials&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Ultracentrifuge Tubes</td><td>Beckman Coulter</td><td>326823</td><td>Thinwall, Polypropylene, 38.5 mL, 25 x 89 mm</td></tr><tr><td>SW 32 Ti Ultracentrifuge Rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>369650</td><td>SW 32 Ti Rotor, Swinging Bucket, Titanium</td></tr><tr><td>Hand Held Rotary Homogenizer</td><td>Fisher Science</td><td>08-451-71</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro phagocytosis of myelin debris by bone marrow-derived macrophages

Macrófagos derivados da medula óssea (BMDMs) são leucócitos maduros que servem a um papel fisiológico crítico como fagócitos profissionais capazes de limpar uma variedade de partículas. Normalmente, BMDMs são restritas do sistema nervoso central (SNC), mas após uma lesão, podem facilmente se infiltrar. Uma vez dentro o tecido lesado do CNS, BMDMs são o tipo de célula primária responsável para a liberação de restos celulares derivados de lesões, incluindo grandes quantidades de detritos de mielina rica de lipídios. As ramificações neuropatológicas da fagocitose de detritos infiltração e mielina BMDM dentro o CNS são complexas e não é bem compreendido. Os protocolos descritos aqui, permitem direto em vitro estudo da BMDMs no contexto de lesão de CNS. Nós cobrimos murino BMDM isolamento e cultura, preparação de restos de mielina e ensaios para avaliar a fagocitose de restos de mielina BMDM. Estas técnicas produzem resultados quantificáveis robustos, sem a necessidade de equipamento especializado significativo ou materiais, no entanto, podem ser facilmente personalizadas para atender às necessidades dos pesquisadores.

Tratamento de BMDMs com CFSE rotulado os restos de mielina deve produzir interiorização clara (Figura 2). Enquanto um tempo de 3 horas de interação é suficiente para BMDMs fagocitar suficiente restos de mielina adicionado para a deteção de jusante robusto, acúmulo intracelular pode ser observado com tão pouco quanto 1 hora da interação. No entanto, alguns restos de mielina ainda podem estar presentes na superfície das células após a lavagem. Isto pode ser devido à lavagem insu...

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In Vitro Phagocytosis of Myelin Debris by Bone Marrow-Derived Macrophages

Apresentamos métodos para avaliar a capacidade fagocitária de primários macrófagos murino derivadas da medula óssea, usando os restos de mielina fluorescente etiquetadas e lipídios intracelulares da gota mancha.

In Vitro Fagocitose de restos de mielina por macrófagos derivados de medula óssea

Bone marrow-derived macrophages (BMDMs) are mature leukocytes that serve a critical physiological role as professional phagocytes capable of clearing a ...

in-vitro-phagocytosis-myelin-debris-bone-marrow-derived

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Vitro Phagocytosis of Myelin Debris by Bone Marrow-Derived Macrophages

12.7K visualizações.  Florida State University. Apresentamos métodos para avaliar a capacidade fagocitária de primários macrófagos murino derivadas da medula óssea, usando os restos de mielina fluorescente etiquetadas e lipídios intracelulares da gota mancha.

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Depletion and Reconstitution of Macrophages in Mice

Macrophages are critical players in the innate immune response to infectious challenge or injury, initiating the innate immune response and directing the acquired immune response. Macrophage dysfunction can lead to an inability to mount an appropriate immune response and as such, has been implicated in many disease processes, including inflammatory bowel diseases. Macrophages display polarized phenotypes that are broadly divided into two categories. Classically activated macrophages, activated by stimulation with IFN&gamma; or LPS, play an essential role in response to bacterial challenge whereas alternatively activated macrophages, activated by IL-4 or IL-13, participate in debris scavenging and tissue remodeling and have been implicated in the resolution phase of inflammation. During an inflammatory response in vivo, macrophages are found amid a complex mixture of infiltrating immune cells and may participate by exacerbating or resolving inflammation. To define the role of macrophages in situ in a whole animal model, it is necessary to examine the effect of depleting macrophages from the complex environment. To ask questions about the role of macrophage phenotype in situ, phenotypically defined polarized macrophages can be derived ex vivo, from bone marrow aspirates and added back to mice, with or without prior depletion of macrophages. In the protocol presented here clodronate-containing liposomes, versus PBS injected controls, were used to deplete colonic macrophages during dextran sodium sulfate (DSS)-induced colitis in mice. In addition, polarized macrophages were derived ex vivo and transferred to mice by intravenous injection. A caveat to this approach is that clodronate-containing liposomes deplete all professional phagocytes, including both dendritic cells and macrophages so to ensure the effect observed by depletion is macrophage-specific, reconstitution of phenotype by adoptive transfer of macrophages is necessary. Systemic macrophage depletion in mice can also be achieved by backcrossing mice onto a CD11b-DTR background, which is an excellent complementary approach. The advantage of clodronate-containing liposome-mediated depletion is that it does not require the time and expense involved in backcrossing mice and it can be used in mice regardless of the background of the mice (C57BL/6, BALB/c, or mixed background).

Macrophages play a central role in homeostasis and pathology in many tissues. The protocol presented here describes methods for depleting macrophages in vivo, deriving polarized macrophages from bone marrow aspirates, and adoptively transferring macrophages into mice. These techniques allow determination of the role that polarized macrophages play in health and disease.

Depleção e reconstituição de macrófagos em Ratos

Macrophages are critical players in the innate  immune response to infectious challenge or injury, initiating the innate immune  response and directing ...

Imunologia e Infecção

Bone Marrow-derived Macrophage Production

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because of their powerful microbicidal activities. Macrophages are widely distributed throughout the body and are present in the lymphoid organs, liver, lungs, gastrointestinal tract, central nervous system, bone, and skin. Because of their repartition, they participate in a wide range of physiological and pathological processes. Macrophages are highly versatile cells that are able to recognize microenvironmental alterations and to maintain tissue homeostasis. Numerous pathogens have evolved mechanisms to use macrophages as Trojan horses to survive, replicate in, and infect both humans and animals and to propagate throughout the body. The recent explosion of interest in evolutionary, genetic, and biochemical aspects of host-pathogen interactions has renewed scientific attention regarding macrophages. Here, we describe a procedure to isolate and cultivate macrophages from murine bone marrow that will provide large numbers of macrophages for studying host-pathogen interactions as well as other processes.

Macrophages have long been recognized as a critical component of the innate and adaptive immune responses. The recent explosion of knowledge pertaining to evolutionary, genetic, and biochemical aspects of the interaction between macrophages and microbes has renewed scientific attention to macrophages. This article describes a method to differentiate macrophages from mouse bone marrow.

Medula Óssea derivadas de macrófagos Produção

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because ...

Study of Phagolysosome Biogenesis in Live Macrophages

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome maturation is the complex and tightly regulated process during which a nascent phagosome undergoes drastic transformation through well-orchestrated interactions with various cellular organelles and compartments in the cytoplasm. This process, which is essential for the physiological function of phagocytic cells by endowing phagosomes with their lytic and bactericidal properties, culminates in fusion of phagosomes with lysosomes and biogenesis of phagolysosomes which is considered to be the last and critical stage of maturation for phagosomes. In this report, we describe a live cell imaging based method for qualitative and quantitative analysis of the dynamic process of lysosome to phagosome content delivery, which is a hallmark of phagolysosome biogenesis. This approach uses IgG-coated microbeads as a model for phagocytosis and fluorophore-conjugated dextran molecules as a luminal lysosomal cargo probe, in order to follow the dynamic delivery of lysosmal content to the phagosomes in real time in live macrophages using time-lapse imaging and confocal laser scanning microscopy. Here we describe in detail the background, the preparation steps and the step-by-step experimental setup to enable easy and precise deployment of this method in other labs. Our described method is simple, robust, and most importantly, can be easily adapted to study phagosomal interactions and maturation in different systems and under various experimental settings such as use of various phagocytic cells types, loss-of-function experiments, different probes, and phagocytic particles.

Estudo da fagolisossomo Biogenesis em macrófagos ao vivo

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

An Engulfment Assay: A Protocol to Assess Interactions Between CNS Phagocytes and Neurons

Phagocytosis is a process in which a cell engulfs material (entire cell, parts of a cell, debris, etc.) in its surrounding extracellular environment and subsequently digests this material, commonly through lysosomal degradation. Microglia are the resident immune cells of the central nervous system (CNS) whose phagocytic function has been described in a broad range of conditions from neurodegenerative disease (e.g., beta-amyloid clearance in Alzheimer&#8217;s disease) to development of the healthy brain (e.g., synaptic pruning)1-6. The following protocol is an engulfment assay developed to visualize and quantify microglia-mediated engulfment of presynaptic inputs in the developing mouse retinogeniculate system7. While this assay was used to assess microglia function in this particular context, a similar approach may be used to assess other phagocytes throughout the brain (e.g., astrocytes) and the rest of the body (e.g., peripheral macrophages) as well as other contexts in which synaptic remodeling occurs (e.g. ,brain injury/disease).

Microglia are the resident immune cells of the central nervous system (CNS) with a high capacity to phagocytose or engulf material in their extracellular environment. Here, a broadly applicable, reliable, and highly quantitative assay for visualizing and measuring microglia-mediated engulfment of synaptic components is described.

Uma imersão Ensaio: Um protocolo para avaliar Interações entre CNS fagócitos e Neurônios

Phagocytosis is a process in which a cell engulfs material (entire cell, parts of a cell, debris, etc.) in its surrounding extracellular environment and ...

Neurociência

Metabolic Characterization of Polarized M1 and M2 Bone Marrow-derived Macrophages Using Real-time Extracellular Flux Analysis

Specific metabolic pathways are increasingly being recognized as critical hallmarks of macrophage subsets. While LPS-induced classically activated M1 or M(LPS) macrophages are pro-inflammatory, IL-4 induces alternative macrophage activation and these so-called M2 or M(IL-4) support resolution of inflammation and wound healing. Recent evidence shows the crucial role of metabolic reprogramming in the regulation of M1 and M2 macrophage polarization. 
In this manuscript, an extracellular flux analyzer is applied to assess the metabolic characteristics of naive, M1 and M2 polarized mouse bone marrow-derived macrophages. This instrument uses pH and oxygen sensors to measure the extracellular acidification rate (ECAR) and oxygen consumption rate (OCR), which can be related to glycolytic and mitochondrial oxidative metabolism. As such, both glycolysis and mitochondrial oxidative metabolism can be measured in real-time in one single assay.
Using this technique, we demonstrate here that inflammatory M1 macrophages display enhanced glycolytic metabolism and reduced mitochondrial activity. Conversely, anti-inflammatory M2 macrophages show high mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) and are characterized by an enhanced spare respiratory capacity (SRC). 
The presented functional assay serves as a framework to investigate how particular cytokines, pharmacological compounds, gene knock outs or other interventions affect the macrophage&#8217;s metabolic phenotype and inflammatory status.

Metabolic reprogramming is a characteristic and prerequisite for M1 and M2 macrophage polarization. This manuscript describes an assay for the measurement of fundamental parameters of glycolysis and mitochondrial function in mouse bone marrow-derived macrophages. This tool can be applied to investigate how particular factors affect the macrophage&#8217;s metabolism and phenotype.

Caracterização metabólica de Polarizada M1 e M2 macrófagos da medula óssea derivadas usando análises em tempo real do fluxo extracelular

Specific metabolic pathways are increasingly being recognized as critical hallmarks of macrophage subsets. While LPS-induced classically activated M1 or ...

Mesenchymal Stem Cell Regulation of Macrophage Phagocytosis; Quantitation and Imaging

Mesenchymal stem cells (MSC) have traditionally been studied for their regenerative properties, but more recently, their immunoregulatory characteristics have been at the forefront. They interact with and regulate immune cell activity. The focus of this study is the MSC regulation of macrophage phagocytic activity. Macrophage (M&#934;) phagocytosis is an important part of the innate immune system response to infection, and the mechanisms through which MSC modulate this response are under active investigation. Presented here is a method to study M&#934; phagocytosis of non-opsonized zymosan particles conjugated to a pH-sensitive fluorescent molecule while in co-culture with MSC. As phagocytic activity increases and the labeled zymosan particles are enclosed within the acidic environment of the phagolysosome, the fluorescence intensity of the pH-sensitive molecule increases. With the appropriate excitation and emission wavelengths, phagocytic activity is measured using a fluorescent spectrophotometer and kinetic data is presented as changes in relative fluorescent units over a 70 min period. To support this quantitative data, the change in the phagocytic activity is visualized using dynamic imaging. Results using this method demonstrate that when in co-culture, MSC enhance M&#934; phagocytosis of non-opsonized zymosan of both naive and IFN-&#947; treated M&#934;. These data add to the current knowledge of MSC regulation of the innate immune system. This method can be applied in future investigations to fully delineate the underlying cellular and molecular mechanisms.

Presented here is a protocol to quantify and produce dynamic images of mesenchymal stem cell (MSC) mediated regulation of macrophage (M&#934;) phagocytosis of non-opsonized yeast (zymosan) particles that are conjugated to a pH-sensitive fluorescent molecule.

Regulação de células-tronco mesenquimais da fagocitose macrófago; Quantitação e Imagem

Mesenchymal stem cells (MSC) have traditionally been studied for their regenerative properties, but more recently, their immunoregulatory characteristics ...

Flow Cytometry Approach to Characterize Phagocytic Properties of Acutely-Isolated Adult Microglia and Brain Macrophages In Vitro

Microglia and central nervous system (CNS)-infiltrating macrophages, collectively called CNS mononuclear phagocytes (CNS-MPs), play central roles in neurological diseases including neurodegeneration and stroke. CNS-MPs are involved in phagocytic clearance of pathological proteins, debris and neuronal synapses, each with distinct underlying molecular pathways. Characterizing these phagocytic properties can provide a functional readout that compliments molecular profiling of microglia using traditional flow cytometry, transcriptomics and proteomics approaches. Phagocytic profiling of microglia has relied on microscopic visualization and in vitro cultures of mouse neonatal microglia. The former approach suffers from limited sampling while the latter approach is inherently poorly reflective of the true in vivo state of adult CNS-MPs. This paper describes optimized protocols to phenotype phagocytic properties of acutely-isolated mouse CNS-MPs by flow cytometry. CNS-MPs are acutely isolated from adult mouse brain using mechanical dissociation followed by density gradient centrifugation, incubated with fluorescent microspheres or fluorescent A&#946; fibrils, washed, and then labeled with panels of antibodies against surface markers (CD11b, CD45). Using this approach, it is possible to compare phagocytic properties of brain-resident microglia with CNS-infiltrating macrophages and then assess the effect of aging and disease pathology on these phagocytic phenotypes. This rapid method also holds potential to functionally phenotype acutely-isolated human CNS-MPs from post-mortem or surgical brain specimens. Additionally, specific mechanisms of phagocytosis by CNS-MP subsets can be investigated by inhibiting select phagocytic pathways.

<meta charset="utf8"></head><body>Abordagem de citometria de fluxo para caracterizar propriedades fagocíticas de micróglia adulta e macrófagos cerebrais agudamente isolados in vitro

Assessment of phagocytic properties of microglia and brain macrophages can provide a valuable functional dimension to molecular profiling studies. We describe a validated protocol that uses flow cytometry to rapidly and reliably quantify phagocytosis of fluorescent microspheres and amyloid beta fibrils by acutely-isolated microglia and brain macrophages from mouse models.

Abordagem de citometria de fluxo para caracterizar propriedades fagocíticas de micróglia adulta e macrófagos cerebrais agudamente isolados in vitro

Microglia and central nervous system (CNS)-infiltrating macrophages, collectively called CNS mononuclear phagocytes (CNS-MPs), play central roles in ...

Isolation and Culture of Bone Marrow-Derived Macrophages from Mice

Macrophages have important effector functions in homeostasis and inflammation. These cells are present in every tissue in the body and have the important ability to change their profile according to the stimuli present in the microenvironment. Cytokines can profoundly affect macrophage physiology, especially IFN-&#947; and interleukin 4, generating M1 and M2 types respectively. Because of the versatility of these cells, the production of a population of bone marrow-derived macrophages can be a basic step in many experimental models of cell biology. The aim of this protocol is to help researchers in the isolation and culture of macrophages derived from bone marrow progenitors. Bone marrow progenitors from pathogen-free C57BL/6 mice are transformed into macrophages upon exposure to macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) that, in this protocol, is obtained from the supernatant of the murine fibroblast lineage L-929. After incubation, mature macrophages are available for use from the 7th to the 10th day. A single animal can be the source of approximately 2 x 107 macrophages. Therefore, it is an ideal protocol for obtaining large amounts of primary macrophages using basic methods of cell culture.

The present protocol describes the isolation and culture of bone marrow-derived macrophages from mice.

Isolamento e cultura de macrófagos derivados da medula óssea de camundongos

Macrophages have important effector functions in homeostasis and inflammation. These cells are present in every tissue in the body and have the important ...

In vitro Quantitative Imaging Assay for Phagocytosis of Dead Neuroblastoma Cells by iPSC-Macrophages

Microglia orchestrate neuroimmune responses in several neurodegenerative diseases, including Parkinson&#39;s disease and Alzheimer&#39;s disease. Microglia clear up dead and dying neurons through the process of efferocytosis, a specialized form of phagocytosis. The phagocytosis function can be disrupted by environmental or genetic risk factors that affect microglia. This paper presents a rapid and simple in vitro&#160;microscopy protocol for studying microglial efferocytosis in an induced pluripotent stem cell (iPSC) model of microglia, using a human neuroblastoma cell line (SH-SY5Y) labeled with a pH-sensitive dye for the phagocytic cargo. The procedure results in a high yield of dead neuroblastoma cells, which display surface phosphatidylserine, recognized as an &#34;eat-me&#34; signal by phagocytes. The 96-well plate assay is suitable for live-cell time-lapse imaging, or the plate can be successfully fixed prior to further processing and quantified by high-content microscopy. Fixed-cell high-content microscopy enables the assay to be scaled up for screening of small molecule inhibitors or assessing the phagocytic function of genetic variant iPSC lines. While this assay was developed to study phagocytosis of whole dead neuroblastoma cells by iPSC-macrophages, the assay can be easily adapted for other cargoes relevant to neurodegenerative diseases, such as synaptosomes and myelin, and other phagocytic cell types.

Neurodegenerative diseases are associated with dysregulated microglia functions. This article outlines an in vitro assay of phagocytosis of neuroblastoma cells by iPSC-macrophages. Quantitative microscopy readouts are described for both live-cell time-lapse imaging and fixed-cell high-content imaging.

In Vitro Fagocitose de restos de mielina por macrófagos derivados de medula óssea

Resumo

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Depleção e reconstituição de macrófagos em Ratos

Medula Óssea derivadas de macrófagos Produção

Estudo da fagolisossomo Biogenesis em macrófagos ao vivo

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Caracterização metabólica de Polarizada M1 e M2 macrófagos da medula óssea derivadas usando análises em tempo real do fluxo extracelular

Regulação de células-tronco mesenquimais da fagocitose macrófago; Quantitação e Imagem

Abordagem de citometria de fluxo para caracterizar propriedades fagocíticas de micróglia adulta e macrófagos cerebrais agudamente isolados in vitro

Abordagem de citometria de fluxo para caracterizar propriedades fagocíticas de micróglia adulta e macrófagos cerebrais agudamente isolados in vitro

Isolamento e cultura de macrófagos derivados da medula óssea de camundongos

Ensaio de imagem quantitativa in vitro para fagocitose de células de neuroblastoma morto por iPSC-Macrófagos