Os autores gostaria de agradecer Glenn Sanger-Hodgson, especialista em mídia na faculdade de medicina de FSU, pelo seu trabalho na produção de vídeo, edição e locução.
Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health (R01GM100474 e R01GM072611).

Os métodos descritos aqui e na seção 2 foram aprovados pelo Comitê de uso (IACUC) e Florida estado Universidade institucional Cuidado Animal e segue as directrizes estabelecidas no guia para o cuidado e uso de animais de laboratório, 8ª edição . Todos os animais utilizados no presente no presente protocolo são casa em um centro de animais de laboratório dedicado até o uso. Nenhuma experimentação na vivo foi realizado antes do sacrifício. Número de animais foram baseado na necessidade experimental usando a célula média e coleções de mielina, como um guia a fim de minimizar o uso.
Nota: Este protocolo descreve a geração de macrófagos derivados da medula óssea (BMDMs) (secção 1), a preparação dos restos de mielina fluorescente etiquetadas derivado do cérebro (seção 2), o procedimento geral para a análise de fagocitose de restos de mielina (seção 3), e o procedimento geral para análise de acumulação de lipídios de detritos de mielina (secção 4). Preparação do reagente, celular colheita e manipulação, coleção de mielina e rotulagem e ensaio de desempenho devem ser concluídas em uma fluxo de ar laminar de biossegurança do armário.
1. geração de macrófagos derivados da medula óssea primárias
<ol>
	<li>Preparação do meio de cultura completo macrófago (CMCM) Nota: geração de macrófagos da medula óssea requer o uso de fator colônia-estimulando do macrófago (M-CSF). Esta preparação utiliza mídia de fibroblasto murino condicionado L929 como fonte de M-CSF.<ol>
		<li>Gere mídia de fibroblasto murino condicionado L929 por cultivo de células em pratos de 145 mm com 50 mL de glicose elevada (4500 mg/L, L-glicose) Dulbecco modificado águia médio (DMEM) suplementado com 5% de soro de bezerro nascido novo (NCS) e penicilina/estreptomicina por 7 dias.</li>
		<li>Recolher meios de culturas em tubos de centrifuga conico de 50 mL e centrifugar durante 30 minutos a 3500 x g, 4 ° C.</li>
		<li>Filtrar sobrenadantes através de um filtro de seringa 0,2 µm para um novo tubo de centrifuga conico de 50 mL. Condicionado de mídia pode ser armazenadas a-80 ° C por até 6 meses.</li>
		<li>A glicose alta DMEM, adicionar 5% vol/vol NCS, 15% vol/vol L929 murino fibroblasto condicionado DMEM e 1% penicilina/estreptomicina. Meios de comunicação podem ser armazenados a 4 ° C durante 2-3 meses. Aquecido a 37 ° C antes do uso.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Coleção de células primárias da medula óssea e indução de macrófagos 
	Nota: Usando este um mouse protocolo irá gerar aproximadamente 20 milhões derivadas da medula óssea macrófagos (BMDMs).<ol>
		<li>Eutanásia o número desejado de semana de 8-10 ratos velhos usando padrão CO2 diretrizes de asfixia seguidos por deslocamento cervical.</li>
		<li>Higienizar o animal usando 70% (vol/vol) etanol: H2O, saturando o pelo.</li>
		<li>Cortar uma pequena abertura no abdômen e puxe cuidadosamente a pele para revelar o tecido subjacente. Tome cuidado para não perfurar a cavidade peritoneal.</li>
		<li>Remova ambas as pernas traseiras, começando no quadril e terminando na altura da tornozelo. Lugar do tecido coletado em um prato de Petri de 100mm contendo fosfato estéril de 5-10 mL tampão salino (PBS) suplementado com 1% penicilina/estreptomicina. 
		Nota: Quando processar vários animais certifique-se de manter os pratos no gelo para limitar a degradação do tecido.</li>
		<li>Retire o músculo e tecido conjuntivo do osso usando um bisturi. Apenas o fêmur e a tíbia são utilizados para coleta de célula, a fíbula pode ser descartada.</li>
		<li>Expor a cavidade da medula dos ossos recolhidos por aparar uma pequena secção de cada extremidade com um bisturi.</li>
		<li>Usando uma agulha 25g, irrigue as cavidades da medula com CMCM em um tubo de centrifuga conico de 50 mL. Os ossos aparecerá brancos, uma vez que eles têm sido suficientemente liberados.</li>
		<li>Concluída a coleta, agite aspirados com uma agulha de 18g por 30-90 s gerado uma suspensão de célula única. 
		Nota: Um passo de Lise opcional – glóbulos vermelhos (RBC) pode ser realizado neste momento. Recentemente tem sido sugerido que o teor de ferro intracelular pode influenciar os efeitos dos restos de mielina em macrófago polarização16. Para obter informações sobre a inclusão de uma etapa de Lise RBC referir-Trouplin et al. 17.</li>
		<li>Filtre a suspensão através de um filtro de célula estéril 70 µm para um novo tubo de centrifuga conico de 50 mL.</li>
		<li>Sementes coletadas células uniformemente em pratos de cultura celular de 145 mm com 15-20 mL CMCM. Use aproximadamente três pratos de cultura por rato sacrificado. Incube as culturas a 37 ° C, 5% de CO2.</li>
		<li>Após 72 horas lavar pratos uma vez com PBS estéril para remover as células não-aderentes, em seguida, adicione 15-20mL CMCM fresco. Incube as culturas por mais 4 dias a 37 ° C, 5% de CO2. Após 7 dias de cultura total, as células hematopoiéticas da medula óssea inicialmente isoladas será maduros BMDMs (Figura 1).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. geração de detritos de mielina fluorescente etiquetadas derivado do cérebro
Nota: Todos os reagentes podem ser armazenados a 4 ° C por até 1 mês.
<ol>
	<li>Preparação dos reagentes de coleção de restos de mielina
	<ol>
		<li>Preparar Tris· Solução-tampão de CL.<ol>
			<li>A 800mL água destilada deionizada H2O (ddiH2O) adicionar 20 mL de 1 M Tris· CL, pH 7,45 (concentração final de 20 mM) e 20 mL de 100mm Na2EDTA (concentração final de 2 mM).</li>
			<li>Ajuste o pH a 7,45. Ajuste o volume para 1000 mL com ddiH2solução de filtro de O. através de uma unidade de filtração 0,2 µm.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Prepare a solução de sacarose 1M.<ol>
			<li>A 100 mL de Tris· CL solução de tampão, adicionar 68,46 g de sacarose. Ajustar o volume de 200 mL com Tris· Solução-tampão de CL. Filtre a solução através de uma unidade de filtração de 0,2 µm.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Preparar 200 mL de solução de sacarose de 0,32 M diluindo a solução 1 M com a Tris· CL 0.83:0.16 de solução tampão (vol/vol).</li>
		<li>Preparar 150 mL de solução de sacarose de 0,83 M diluindo a solução 1 M com a Tris· CL 0.83:0.16 de solução tampão (vol/vol).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Coleção de restos de mielina bruto derivado do cérebro 
	Nota: O método de coleta descrito aqui é para o isolamento dos restos de mielina bruto.<ol>
		<li>Eutanásia em ratos de 10-12 8-10 semanas de idade usando padrão CO2 diretrizes de asfixia seguidas por deslocamento cervical.</li>
		<li>Dissecar o cérebro e os coloque em um prato de 100 mm, contendo 10 mL de solução de sacarose de 0,32 M.</li></ol></li></ol>Mantenha o prato no gelo.
		<li>Usando a tesoura cirúrgica estéril, cortar o cérebro em pedaços de aproximadamente 5 mm3 no tamanho.</li>
		<li>Transferir o tecido para um tubo de centrifuga conico de 50 mL e adicionar cerca de 30 mL de solução de sacarose de 0,32 M.</li>
		<li>Homogeneizar com um homogenizador giratório portátil estéril, até que seja alcançada uma solução suave.</li>
		<li>Dilua o cérebro homogeneizado até um volume final de 90 mL com solução de sacarose de 0,32 M.</li>
		<li>Para seis tubos de 38,5 mL paredes finas polipropileno se, adicione 20 mL de solução de sacarose de 0,83 M.</li>
		<li>Delicadamente, adicione a solução de cérebro homogeneizado para o topo da solução de sacarose de 0,83 M, tomando cuidado para não misturar as duas camadas.</li>
		<li>Contrapeso de cada tubo com a solução de sacarose de 0,32 M.</li>
		<li>Centrifugar a 100.000 x g por 45 min a 4° C, usando um apropriado pre-refrigeração rotor se. Conjunto rotor aceleração e desaceleração para seus valores mínimos para reduzir a perda de restos de mielina.</li>
		<li>Recolha os restos de mielina da interface das duas densidades de sacarose. 
		Nota: os detritos devem aparecer como uma faixa branca em direção ao centro do tubo.</li>
		<li>Combinar os restos de mielina bruto em um tubo de centrifuga conico de 50 mL e ajustar o volume a cerca de 35 mL, usando Tris· Solução-tampão de CL.</li>
		<li>Homogeneizar os restos de mielina bruto com um homogenizador giratório portátil estéril para 30-60 s.</li>
		<li>Divida uniformente a suspensão entre 6 tubos se limpa e equilíbrio com um volume adequado de Tris· Solução-tampão de CL.</li>
		<li>Centrifugar a 100.000 x g por 45 min a 4° C, usando um apropriado pre-refrigeração rotor se. Conjunto rotor aceleração e desaceleração para seus valores máximos.</li>
		<li>Como sólidas brancas pelotas agora será visíveis, desprezar o sobrenadante e ressuspender as pelotas em 10-15 mL de Tris· Solução-tampão de CL.</li>
		<li>Divida uniformente a suspensão entre 2 tubos se limpa e equilíbrio com um volume adequado de Tris· Solução-tampão de CL.</li>
		<li>Centrifugar novamente a 100.000 x g durante 45 min a 4 ° C, usando um apropriado pre-refrigeração rotor se. Conjunto rotor aceleração e desaceleração para seus valores máximos.</li>
		<li>Desprezar o sobrenadante e ressuspender as bolas em 5-6 mL de PBS estéril e dividir a suspensão entre um número adequado de tubos de microcentrífuga pré-pesados 1,5 mL.</li>
		<li>Centrifugar a 22.000 x g durante 10 minutos a 4 ° C.</li>
		<li>Desprezar o sobrenadante e determinar o peso das pelotas de restos de mielina.</li>
		<li>Re-suspenda as pelotas em PBS para uma concentração final de 100 mg/mL. 
		Nota: dez ou doze cérebro é suficiente para produzir 10-15 mL de restos de mielina de 100 mg/mL. Os restos de mielina podem ser loja a-80 ° C por 6 meses.</li>
	
	
	<li>Os restos de mielina fluorescente rotulagem
	<ol>
		<li>Prepare a solução 50 µM carboxyfluorescein succinimidil éster (CFSE) imediatamente antes do uso.<ol>
			<li>Usando o PBS estéril, dilua uma solução stock de 5 mM de CFSE preparado com 100% dimetilsulfóxido (DMSO) a uma concentração final de trabalho de 50 µM.</li>
			<li>Filtrar a solução através de um filtro de seringa 0,2 µm.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Descongele a quantidade desejada de restos de mielina de 100 mg/mL e ressuspender com uma agulha estéril de 29 g. 
		Nota: congelar os restos de mielina fará com que a largar a solução que exigem re-suspensão antes do uso.</li>
		<li>Transferi os restos de mielina para um tubo de centrífuga de micro pré-pesados 1,5 mL.</li>
		<li>Centrifugar a 14.800 x g durante 10 minutos a 4° C. Desprezar o sobrenadante.</li>
		<li>Resuspenda os restos de mielina em 200 µ l de solução CFSE por restos de mielina 100 µ l peletizado.</li>
		<li>Incube durante 30 min à temperatura (RT), protegida da luz.</li>
		<li>Centrifugar a 14.800 x g durante 10 minutos a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante.</li>
		<li>Resuspenda o pellet em 600-800 µ l de tampão de lavagem (0,2 µm filtro esterilizado glicina 100mm em PBS).</li>
		<li>Centrifugar a 14.800 x g durante 10 minutos a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante.</li>
		<li>Repita as etapas 2.3.8-2.3.9 mais duas vezes.</li>
		<li>Após a lavagem final, determinar o peso da pelota de restos de mielina e ressuspender a 100 mg/mL com PBS estéril. Nota: Os restos de mielina rotulado podem ser loja a-80 ° C por até 6 meses.</li>
	</ol>
	</li>

3. a mielina ensaio de fagocitose de detritos
Nota: O seguinte é o método básico para observar a fagocitose de restos de mielina fluorescente etiquetadas. Adição de outros tratamentos e condições experimentais precisará ser otimizado pelo investigador.
<ol>
	<li>Preparação de placas de tratamento
	<ol>
		<li>Para cada placa de 145 mm, colete BMDMs maduros em um tubo de centrifuga conico de 15 mL com 5-6 mL de ácido etilenodiaminotetracético de 10mm (EDTA) em fosfato salino de Dulbecco (dPBS) (pH 7,4). 
		Nota: Não utilize tripsina pois ele pode alterar o estado de ativação de células18.</li>
		<li>Adicione um volume igual de CMCM pré-aquecido a cada tubo de células coletadas.</li>
		<li>Centrifugar a 180 x g por 8 min a 20 ° C. Desprezar o sobrenadante.</li>
		<li>Ressuspender as células em CMCM e contagem.</li>
		<li>A cada poço de uma placa de cultura de células 24 poços, adicione 1 x 105 células em 1 mL de CMCM.</li>
		<li>Incube a 37 ° C, 5% de CO2 por 24 h.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Análise e tratamento de resíduos de mielina
	<ol>
		<li>Adicione 10 µ l de 100 mg/mL CFSE rotulado os restos de mielina de cada bem (concentração final de 1 mg/mL).</li>
		<li>Incube durante 1-3 horas a 37 ° C, 5% de CO2.</li>
		<li>Lave a placa 3 vezes com PBS estéril para remover restos de mielina não engolido.</li>
		<li>Adicione 400 µ l de paraformaldeído 4% a cada poço. Incubar durante 30 min à RT.</li>
		<li>Lave a placa 2 vezes com PBS estéril.</li>
		<li>Adicione 400 µ l de solução de Hoechst 33258 a cada poço. Incube durante 5 min à RT, protegido da luz.</li>
		<li>Lave pratos 2 vezes com PBS estéril.</li>
		<li>Adicione 200 µ l de Fluoro-gel com tampão Tris a cada poço para reduzir fotobranqueamento.</li>
		<li>Células de imagem usando um microscópio capaz de epi-fluorescente invertido. 
		Nota: Os excitação e emissão de comprimentos de onda de CFSE são 494 nm e 521 nm, respectivamente.</li>
		<li>Divida o número de células positivas CFSE pelo número de núcleos para determinar a absorção de restos de mielina relativo.</li>
		<li>Antes da imagem latente, manter as placas por até 7 dias a 4 ° C, protegido da luz.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. quantificação dos lipídios intracelulares através de coloração de vermelho-O óleo
Nota: O seguinte é o método básico para a observação de lipídios intracelulares de mielina-detritos derivados.O uso de CFSE rotulado os restos de mielina não é recomendado para quantificação fluorescente de ORO de coloração devido à sobreposição espectral. Adição de outros tratamentos e condições experimentais precisará ser otimizado pelo investigador.
<ol>
	<li>Preparação de soluções de coloração
	<ol>
		<li>Prepare a solução de coloração vermelho-O óleo (ORO) 0,5%.<ol>
			<li>Lentamente, adicionar 100 mL de propilenoglicol 100% (1,2-propanodiol) a 0,5 g de ORO (1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol), agitando.</li>
			<li>Aqueça a 95 ° C por 15 min ou até que todas as partículas grandes são dissolvidas. 
			Nota: Não aqueça acima de 100 ° C.</li>
			<li>Filtrar a solução através de um pedaço de papel de filtro, enquanto ainda quente em um novo recipiente.</li>
			<li>Permitir que a solução legal durante a noite no RT. solução pode ser armazenada por até 1 ano no RT</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Prepare a solução de glicol de propileno de 85%.<ol>
			<li>Adicione 85 mL de propilenoglicol 100% para 15 mL de ddiH2O. mexa até misturado. Solução pode ser armazenada por até 1 ano no RT</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Preparação de placas de tratamento
	<ol>
		<li>Prepare uma placa de 24 seguindo o método descrito na seção 3.</li>
		<li>Incube a 37 ° C, 5% de CO2 por 24 h.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Tratamento de detritos de mielina
	<ol>
		<li>Adicione 10 µ l de restos de mielina de 100 mg/mL a cada poço (concentração final de 1 mg/mL).</li>
		<li>Incube durante 1-3 h a 37 ° C, 5% de CO2.</li>
		<li>Lave a placa 3 vezes com PBS estéril para remover restos de mielina não digerido. Nota: Neste ponto, placas podem também sofrer fixação imediata ou CMCM fresca pode ser adicionada, e células retornou a incubação por pontos de tempo adicional.</li>
		<li>Adicione 400 µ l de paraformaldeído 4% a cada poço. Incubar durante 30 min à RT.</li>
		<li>Lave a placa 2 vezes com PBS estéril então, procced à mancha.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Coloração de ORO e análise
	<ol>
		<li>Lave a placa fixa 3 vezes com ddiH2O.</li>
		<li>Adicione 400 µ l de propileno glicol de 100% a cada poço e incubar durante 5 min à RT 
		Nota: isto irá reduzir o reporte de ddiH2O.</li>
		<li>Aspirar o propilenoglicol e adicione 400 µ l de solução ORO a cada poço.</li>
		<li>Incubar durante 8 min a 60 ° C.</li>
		<li>Aspire a solução ORO. Em seguida, adicione 400 µ l de 85% propilenoglicol a cada poço e incubar durante 5 minumintes no RT</li>
		<li>Lavar a placa 3 vezes com ddiH2O.</li>
		<li>Adicione 400 µ l de solução de Hoechst 33258 a cada poço. Incube durante 5 min à RT, protegido da luz.</li>
		<li>Lave pratos 2 vezes com PBS estéril.</li>
		<li>Adicione 200 µ l de Fluoro-gel com tampão Tris a cada poço.</li>
		<li>Células de imagem usando um microscópio capaz de epi-fluorescente invertido. ORO pode ser fotografada usando um conjunto padrão de filtro vermelho Texas ou DsRed.</li>
		<li>Quantificar de retenção relativo lipídios determinando a área positiva de ORO em cada campo de imagem e dividindo-o pelo número de núcleos.</li>
		<li>Manter as placas durante 7 dias a 4 ° C protegido da luz.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+biology+in+development,+homeostasis+and+disease.">Macrophage biology in development, homeostasis and disease.</a> Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).</li><li>Unanue, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen-presenting+function+of+the+macrophage.">Antigen-presenting function of the macrophage.</a> Annu Rev Immunol. 2, 395-428 (1984).</li><li>Cavaillon, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokines+and+macrophages.">Cytokines and macrophages.</a> Biomed Pharmacother. 48 (10), 445-453 (1994).</li><li>Ren, Y., Savill, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis:+the+importance+of+being+eaten.">Apoptosis: the importance of being eaten.</a> Cell Death Differ. 5 (7), 563-568 (1998).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+in+spinal+cord+injury:+phenotypic+and+functional+change+from+exposure+to+myelin+debris.">Macrophages in spinal cord injury: phenotypic and functional change from exposure to myelin debris.</a> Glia. 63 (4), 635-651 (2015).</li><li>Goodrum, J. F., Earnhardt, T., Goines, N., Bouldin, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+of+myelin+lipids+during+degeneration+and+regeneration+of+peripheral+nerve:+an+autoradiographic+study.">Fate of myelin lipids during degeneration and regeneration of peripheral nerve: an autoradiographic study.</a> J Neurosci. 14 (1), 357-367 (1994).</li><li>Greenhalgh, A. D., David, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+the+Phagocytic+Response+of+Microglia+and+Peripheral+Macrophages+after+Spinal+Cord+Injury+and+Its+Effects+on+Cell+Death.">Differences in the Phagocytic Response of Microglia and Peripheral Macrophages after Spinal Cord Injury and Its Effects on Cell Death.</a> J Neurosci. 34 (18), 6316 (2014).</li><li>Sun, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+activates+FAK/Akt/NF-kappaB+pathways+and+provokes+CR3-dependent+inflammatory+response+in+murine+system.">Myelin activates FAK/Akt/NF-kappaB pathways and provokes CR3-dependent inflammatory response in murine system.</a> PLoS One. 5 (2), e9380 (2010).</li><li>Gensel, J. C., Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+activation+and+its+role+in+repair+and+pathology+after+spinal+cord+injury.">Macrophage activation and its role in repair and pathology after spinal cord injury.</a> Brain Res. , 1-11 (2015).</li><li>Bourre, J. M., Pollet, S., Daudu, O., Le Saux, F., Baumann, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+consists+of+a+continuum+of+particles+of+different+density+with+varying+lipid+composition:+major+differences+are+found+between+normal+mice+and+quaking+mutants.">Myelin consists of a continuum of particles of different density with varying lipid composition: major differences are found between normal mice and quaking mutants.</a> Biochimie. 59 (10), 819-824 (1977).</li><li>Larocca, J. N., Norton, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Current Protocols in Cell Biology. , (2001).</li><li>Norton, W. T., Poduslo, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelination+in+rat+brain:+method+of+myelin+isolation.">Myelination in rat brain: method of myelin isolation.</a> J Neurochem. 21 (4), 749-757 (1973).</li><li>Wang, X. Q., Duan, X. M., Liu, L. H., Fang, Y. Q., Tan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carboxyfluorescein+diacetate+succinimidyl+ester+fluorescent+dye+for+cell+labeling.">Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester fluorescent dye for cell labeling.</a> Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 37 (6), 379-385 (2005).</li><li>Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+dyes+for+lymphocyte+migration+and+proliferation+studies.">Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies.</a> Immunol Cell Biol. 77 (6), 499-508 (1999).</li><li>Deutsch, M. J., Schriever, S. C., Roscher, A. A., Ensenauer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+image+analysis+approach+for+lipid+droplet+size+quantitation+of+Oil+Red+O-stained+cultured+cells.">Digital image analysis approach for lipid droplet size quantitation of Oil Red O-stained cultured cells.</a> Anal Biochem. 445, 87-89 (2014).</li><li>Kroner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNF+and+increased+intracellular+iron+alter+macrophage+polarization+to+a+detrimental+M1+phenotype+in+the+injured+spinal+cord.">TNF and increased intracellular iron alter macrophage polarization to a detrimental M1 phenotype in the injured spinal cord.</a> Neuron. 83 (5), 1098-1116 (2014).</li><li>Trouplin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marrow-derived+Macrophage+Production.">Marrow-derived Macrophage Production.</a> J Vis Exp. (81), e50966 (2013).</li><li>Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Detachment+Methods+on+M2+Macrophage+Phenotype+and+Function.">Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function.</a> J Immunol Methods. 426, 56-61 (2015).</li><li>Guo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescuing+macrophage+normal+function+in+spinal+cord+injury+with+embryonic+stem+cell+conditioned+media.">Rescuing macrophage normal function in spinal cord injury with embryonic stem cell conditioned media.</a> Mol Brain. 9 (1), 48 (2016).</li><li>Bosco, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+synthetic+matrix+metalloproteinase+inhibitor+reduces+human+mesenchymal+stem+cell+adipogenesis.">A new synthetic matrix metalloproteinase inhibitor reduces human mesenchymal stem cell adipogenesis.</a> PLOS ONE. 12 (2), e0172925 (2017).</li><li>Ram&#237;rez-Zacar&#237;as, J. L., Castro-Mu&#241;ozledo, F., Kuri-Harcuch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+adipose+conversion+and+triglycerides+by+staining+intracytoplasmic+lipids+with+oil+red+O.">Quantitation of adipose conversion and triglycerides by staining intracytoplasmic lipids with oil red O.</a> Histochem. 97 (6), 493-497 (1992).</li><li>Koopman, R., Schaart, G., Hesselink, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimisation+of+oil+red+staining+permits+combination+with+immunofluorescence+and+automated+quantification+of+lipids.">Optimisation of oil red staining permits combination with immunofluorescence and automated quantification of lipids.</a> Histochem Cell Biol. 116 (1), 63-68 (2001).</li><li>Fang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide-Induced+Macrophage+Inflammatory+Response+Is+Regulated+by+SHIP.">Lipopolysaccharide-Induced Macrophage Inflammatory Response Is Regulated by SHIP.</a> J Immunol. 173 (1), (2004).</li><li>Martinez, F. O., Sica, A., Mantovani, A., Locati, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+activation+and+polarization.">Macrophage activation and polarization.</a> Front Biosci. 13, (2008).</li><li>Mosser, D. M., Edwards, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+full+spectrum+of+macrophage+activation.">Exploring the full spectrum of macrophage activation.</a> Nat Rev Immunol. 8 (12), 958-969 (2008).</li></ol>

Os autores têm sem divulgações.

Os procedimentos descritos aqui utilizam ambos recém isolados restos de mielina CNS bruto e macrófagos derivados da medula óssea primários. Para reduzir despesas do animais, é recomendável que os cérebros e células da medula óssea de cada rato ser colhidas no momento do sacrifício. Dois pesquisadores trabalhando juntos podem preparar ambos os materiais simultaneamente. Alternativamente, os cérebros podem ser armazenados a-80 ° C em PBS suplementadas com antibióticos antes de isolamento de restos de mielina. ...

Macrófagos derivados da medula óssea (BMDMs) são um elo importante entre os sistemas imune inatos e adaptativos. Como células apresentadoras de (APCs), eles podem se comunicar com os linfócitos através de ambos apresentação de antigénios e liberação de citocinas1,2,3. No entanto, como fagócitos profissionais, sua principal função é limpar patógenos, células envelhecidas e restos celulares1,4. Na sequência de uma lesão na medula espinal (SCI), quantidades substanciais de restos de mielina é gerada a partir de oligodendrócitos moribundos, o tipo de célula responsável pela CNS axônio mielinização5. Nós e os outros têm mostrado que o afastamento dos restos de mielina é sobretudo da responsabilidade de infiltração BMDMs5,6,7. No entanto, dentro da lesão da medula espinhal com a duração de sites de restos de mielina tem sido sugerida para deslocar estas células normalmente anti-inflamatórios no sentido de um estado pro-inflamatórios5,8,9. Como principais mediadores neuro-inflamação na medula espinhal lesada, BMDMs são alvos clínicos importantes.
Para ajudar a investigar a influência da BMDMs na medula espinhal lesada, desenvolvemos um modelo in vitro para estudar diretamente como BMDMs responder aos restos de mielina. Para melhorar a relevância biológica, tanto BMDMs murino primários e os restos de mielina recentemente isoladas são usados nestas investigações. Como tal, os métodos apresentados aqui também detalham o isolamento e a cultura de BMDMs murino primários e derivado de uma técnica de gradiente de sacarose modificada usada para isolar o CNS murino mielina detritos10,11,12. Os restos de mielina podem prontamente ser rotulados com um corante fluorescente, carboxyfluorescein succinimidil éster (CFSE), para acompanhar que sua internalização por BMDMs. CFSE é bem adequada para esta aplicação, porque é não citotóxicas e suas licenças de espectro estreito fluorescente multiplexação com outras fluorescentes sondas13,14. Após a fagocitose, lipídios de restos de mielina são transportados através de lisossomos e empacotados como lipídios neutros em gotículas de lipídios intracelular5. Para quantificar este acúmulo intracelular de lipídios, apresentamos um óleo vermelho O ORO () método otimizado para análise quantitativa de imagem de coloração. Este método de coloração simples produz resultados reprodutíveis robustos e quantificação de15. Esses métodos facilitam o estudo da mielina detritos fagocitose e lipídios de retenção com equipamento especializado limitada.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="669">
	<tbody>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:42px;width:180px;">DMEM</td>
			<td style="width:149px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:115px;">SH30243.01</td>
			<td style="width:225px;">High glucose with L-glutamine, sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:63px;width:180px;">Penicillin-Streptomycin Solution</td>
			<td style="width:149px;">Corning</td>
			<td style="width:115px;">30-002-CI</td>
			<td style="width:225px;">100X Solution</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:42px;width:180px;">New Born Calf Serum (NCS)</td>
			<td style="width:149px;">Rocky Mountain Biologics</td>
			<td style="width:115px;">NBS-BBT-5XM</td>
			<td style="width:225px;">United States Origin</td>
		</tr>
		<tr height="83">
			<td height="83" style="height:83px;width:180px;">NCTC clone 929 [L cell, L-929, derivative of Strain L]&#160;</td>
			<td style="width:149px;">ATCC</td>
			<td style="width:115px;">CCL-1</td>
			<td style="width:225px;">L929 Cell Line of Conditioned Media Preparation</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:42px;width:180px;">24-well Cell Culture Plates</td>
			<td style="width:149px;">VWR</td>
			<td style="width:115px;">10062-896&#160;</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:180px;">Cell Culture Dish</td>
			<td style="width:149px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:115px;">639960</td>
			<td style="width:225px;">Polystyrine, 145/20mm</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:42px;width:180px;">CFSE Cell Proliferation Kit</td>
			<td style="width:149px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:115px;">C34570</td>
			<td style="width:225px;">DMSO for Reconsitution Provided</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:42px;width:180px;">Fluoro-gel with Tris Buffer&#160;</td>
			<td style="width:149px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:115px;">17985-11</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:180px;">Oil Red O</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:115px;">O0625</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:180px;">Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Materials</td>
			<td style="width:149px;">Company</td>
			<td style="width:115px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:225px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:42px;width:180px;">Ultracentrifuge Tubes</td>
			<td style="width:149px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:115px;">326823</td>
			<td style="width:225px;">Thinwall, Polypropylene, 38.5 mL, 25 x 89 mm</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:63px;width:180px;">SW 32 Ti Ultracentrifuge Rotor</td>
			<td style="width:149px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:115px;">369650</td>
			<td style="width:225px;">SW 32 Ti Rotor, Swinging Bucket, Titanium</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:42px;width:180px;">Hand Held Rotary Homogenizer</td>
			<td style="width:149px;">Fisher Science</td>
			<td style="width:115px;">08-451-71</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro phagocytosis of myelin debris by bone marrow-derived macrophages

Macrófagos derivados da medula óssea (BMDMs) são leucócitos maduros que servem a um papel fisiológico crítico como fagócitos profissionais capazes de limpar uma variedade de partículas. Normalmente, BMDMs são restritas do sistema nervoso central (SNC), mas após uma lesão, podem facilmente se infiltrar. Uma vez dentro o tecido lesado do CNS, BMDMs são o tipo de célula primária responsável para a liberação de restos celulares derivados de lesões, incluindo grandes quantidades de detritos de mielina rica de lipídios. As ramificações neuropatológicas da fagocitose de detritos infiltração e mielina BMDM dentro o CNS são complexas e não é bem compreendido. Os protocolos descritos aqui, permitem direto em vitro estudo da BMDMs no contexto de lesão de CNS. Nós cobrimos murino BMDM isolamento e cultura, preparação de restos de mielina e ensaios para avaliar a fagocitose de restos de mielina BMDM. Estas técnicas produzem resultados quantificáveis robustos, sem a necessidade de equipamento especializado significativo ou materiais, no entanto, podem ser facilmente personalizadas para atender às necessidades dos pesquisadores.

Tratamento de BMDMs com CFSE rotulado os restos de mielina deve produzir interiorização clara (Figura 2). Enquanto um tempo de 3 horas de interação é suficiente para BMDMs fagocitar suficiente restos de mielina adicionado para a deteção de jusante robusto, acúmulo intracelular pode ser observado com tão pouco quanto 1 hora da interação. No entanto, alguns restos de mielina ainda podem estar presentes na superfície das células após a lavagem. Isto pode ser devido à lavagem insu...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Phagocytosis of Myelin Debris by Bone Marrow-Derived Macrophages at JoVE.com

In Vitro Phagocytosis of Myelin Debris by Bone Marrow-Derived Macrophages

Apresentamos métodos para avaliar a capacidade fagocitária de primários macrófagos murino derivadas da medula óssea, usando os restos de mielina fluorescente etiquetadas e lipídios intracelulares da gota mancha.

In Vitro Fagocitose de restos de mielina por macrófagos derivados de medula óssea

Bone marrow-derived macrophages (BMDMs) are mature leukocytes that serve a critical physiological role as professional phagocytes capable of clearing a ...

in-vitro-phagocytosis-myelin-debris-bone-marrow-derived

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Vitro Phagocytosis of Myelin Debris by Bone Marrow-Derived Macrophages

12.6K visualizações.  Florida State University. Apresentamos métodos para avaliar a capacidade fagocitária de primários macrófagos murino derivadas da medula óssea, usando os restos de mielina fluorescente etiquetadas e lipídios intracelulares da gota mancha.

Vídeo: In Vitro Phagocytosis of Myelin Debris by Bone Marrow-Derived Macrophages

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

Transfecção de células de camundongo por Ganglionares da Retina In vivo Eletroporação

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Neurociência

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be stimulated by neuronally-released transmitter. However, the ability of astrocytic receptors to exhibit plasticity in response to changes in neuronal activity has received little attention. Here we describe a model system that can be used to globally scale up or down astrocytic group I metabotropic glutamate receptors (mGluRs) in acute brain slices. Included are methods on how to prepare parasagittal hippocampal slices, construct chambers suitable for long-term slice incubation, bidirectionally manipulate neuronal action potential frequency, load astrocytes and astrocyte processes with fluorescent Ca2+ indicator, and measure changes in astrocytic Gq GPCR activity by recording spontaneous and evoked astrocyte Ca2+ events using confocal microscopy. In essence, a &#8220;calcium roadmap&#8221; is provided for how to measure plasticity of astrocytic Gq GPCRs. Applications of the technique for study of astrocytes are discussed. Having an understanding of how astrocytic receptor signaling is affected by changes in neuronal activity has important implications for both normal synaptic function as well as processes underlying neurological disorders and neurodegenerative disease.

Here we describe an adaptation of protocols used to induce homeostatic plasticity in neurons for the study of plasticity of astrocytic G protein-coupled receptors. Recently used to examine changes in astrocytic group I mGluRs in juvenile mice, the method can be applied to measure scaling of various astrocytic GPCRs, in tissue from adult mice in situ and in vivo, and to gain a better appreciation of the sensitivity of astrocytic receptors to changes in neuronal activity.

Induzir Plasticidade de astrocítica Receptores de Manipulação de Neuronal queima de moeda

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise from extra-retinal sources. Ex vivo ERG provides an efficient method to dissect the function of retinal cells directly from an intact isolated retina of animals or donor eyes. In addition, ex vivo ERG can be used to test the efficacy and safety of potential therapeutic agents on retina tissue from animals or humans. We show here how commercially available in vivo ERG systems can be used to conduct ex vivo ERG recordings from isolated mouse retinas. We combine the light stimulation, electronic and heating units of a standard in vivo system with custom-designed specimen holder, gravity-controlled perfusion system and electromagnetic noise shielding to record low-noise ex vivo ERG signals simultaneously from two retinas with the acquisition software included in commercial in vivo systems. Further, we demonstrate how to use this method in combination with pharmacological treatments that remove specific ERG components in order to dissect the function of certain retinal cell types.

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Ex vivo ERG can be used to record electrical activity of retinal cells directly from isolated intact retinas of animals or humans. We demonstrate here how common in vivo ERG systems can be adapted for ex vivo ERG recordings in order to dissect the electrical activity of retinal cells.

Simultâneo<em&gt; Ex vivo</em&gt; Teste Funcional de Dois retinas por<em&gt; In vivo</em&gt; Sistema Eletrorretinograma

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes

Astrocytes are the major cell type in the brain and directly contact synapses and blood vessels. Although microglial cells have been considered the major immune cells and only phagocytes in the brain, recent studies have shown that astrocytes also participate in various phagocytic processes, such as developmental synapse elimination and clearance of amyloid beta plaques in Alzheimer&#39;s disease (AD). Despite these findings, the efficiency of astrocyte engulfment and degradation of their targets is unclear compared with that of microglia. This lack of information is mostly due to the lack of an assay system in which the kinetics of astrocyte- and microglia-mediated phagocytosis are easily comparable. To achieve this goal, we have developed a long-term live-imaging in vitro phagocytosis assay to evaluate the phagocytic capacity of purified astrocytes and microglia. In this assay, real-time detection of engulfment and degradation is possible using pH indicator-conjugated synaptosomes, which emit bright red fluorescence in acidic organelles, such as lysosomes. Our novel assay provides simple and effective detection of phagocytosis through live-imaging. In addition, this in vitro phagocytosis assay can be used as a screening platform to identify chemicals and compounds that can enhance or inhibit the phagocytic capacity of astrocytes. As synaptic pruning malfunction and pathogenic protein accumulation have been shown to cause mental disorders or neurodegenerative diseases, chemicals and compounds that modulate the phagocytic capacity of glial cells should be helpful in treating various neurological disorders.

A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes

This protocol presents an in vitro live-imaging phagocytosis assay to measure the phagocytic capacity of astrocytes. Purified rat astrocytes and microglia are used along with pH indicator-conjugated synaptosomes. This method can detect real-time engulfment and degradation kinetics and provides a suitable screening platform to identify factors modulating astrocyte phagocytosis.

Um romance imagens Live In Vitro e fagocitose mediada por ensaio de Astrocyte usando pH sinaptossomas conjugada com indicador

Astrocytes are the major cell type in the brain and directly contact synapses and blood vessels. Although microglial cells have been considered the major ...

Ocular Kinematics Measured by In Vitro Stimulation of the Cranial Nerves in the Turtle

After animals are euthanized, their tissues begin to die. Turtles offer an advantage because of a longer survival time of their tissues, especially when compared to warm-blooded vertebrates. Because of this, in vitro experiments in turtles can be performed for extended periods of time to investigate the neural signals and control of their target actions. Using an isolated head preparation, we measured the kinematics of eye movements in turtles, and their modulation by electrical signals carried by cranial nerves. After the brain was removed from the skull, leaving the cranial nerves intact, the dissected head was placed in a gimbal to calibrate eye movements. Glass electrodes were attached to cranial nerves (oculomotor, trochlear, and abducens) and stimulated with currents to evoke eye movements. We monitored eye movements with an infrared video tracking system and quantified rotations of the eyes. Current pulses with a range of amplitudes, frequencies, and train durations were used to observe effects on responses. Because the preparation is separated from the brain, the efferent pathway going to muscle targets can be examined in isolation to investigate neural signaling in the absence of centrally processed sensory information.

Ocular Kinematics Measured by In Vitro Stimulation of the Cranial Nerves in the Turtle

This protocol describes how to use an in vitro isolated turtle head preparation to measure the kinematics of their eye movements. After removal of the brain from the cranium, cranial nerves can be stimulated with currents to quantify rotations of the eye and changes in pupil sizes.

Cinemática ocular medida na Vitro estimulação dos nervos cranianos na tartaruga

After animals are euthanized, their tissues begin to die. Turtles offer an advantage because of a longer survival time of their tissues, especially when ...

Modeling Charcot-Marie-Tooth Disease In Vitro by Transfecting Mouse Primary Motoneurons

Neurodegeneration of spinal motoneurons (MNs) is implicated in a large spectrum of neurological disorders including amyotrophic lateral sclerosis, Charcot-Marie-Tooth disease, and spinal muscular atrophy, which are all associated with muscular atrophy. Primary cultures of spinal MNs have been used widely to demonstrate the involvement of specific genes in such diseases and characterize the cellular consequences of their mutations. This protocol models a primary MN culture derived from the seminal work of Henderson and colleagues more than twenty years ago. First, we detail a method of dissecting the anterior horns of the spinal cord from a mouse embryo and isolating the MNs from neighboring cells using a density gradient. Then, we present a new way of efficiently transfecting MNs with expression plasmids using magnetofection. Finally, we illustrate how to fix and immunostain primary MNs. Using neurofilament mutations that cause Charcot-Marie-Tooth disease type 2, this protocol demonstrates a qualitative approach to expressing proteins of interest and studying their involvement in MN growth, maintenance, and survival.

Modeling Charcot-Marie-Tooth Disease In Vitro by Transfecting Mouse Primary Motoneurons

The goal of this technique is to prepare a highly enriched culture of primary motoneurons (MNs) from murine spinal cord. To evaluate the consequences of mutations causing MN diseases, we describe here the isolation of these isolated MNs and their transfection by magnetofection.

Doença de Charcot-Marie-Tooth In Vitro de modelagem por Transfecting Mouse motoneurônios primários

Neurodegeneration of spinal motoneurons (MNs) is implicated in a large spectrum of neurological disorders including amyotrophic lateral sclerosis, ...

Disruption of Frontal Lobe Neural Synchrony During Cognitive Control by Alcohol Intoxication

Decision making relies on dynamic interactions of distributed, primarily frontal brain regions. Extensive evidence from functional magnetic resonance imaging (fMRI) studies indicates that the anterior cingulate (ACC) and the lateral prefrontal cortices (latPFC) are essential nodes subserving cognitive control. However, because of its limited temporal resolution, fMRI cannot accurately reflect the timing and nature of their presumed interplay. The present study combines distributed source modeling of the temporally precise magnetoencephalography (MEG) signal with structural MRI in the form of &#34;brain movies&#34; to: (1) estimate the cortical areas involved in cognitive control (&#34;where&#34;), (2) characterize their temporal sequence (&#34;when&#34;), and (3) quantify the oscillatory dynamics of their neural interactions in real time. Stroop interference was associated with greater event-related theta (4 - 7 Hz) power in the ACC during conflict detection followed by sustained sensitivity to cognitive demands in the ACC and latPFC during integration and response preparation. A phase-locking analysis revealed co-oscillatory interactions between these areas indicating their increased neural synchrony in theta band during conflict-inducing incongruous trials. These results confirm that theta oscillations are fundamental to long-range synchronization needed for integrating top-down influences during cognitive control. MEG reflects neural activity directly, which makes it suitable for pharmacological manipulations in contrast to fMRI that is sensitive to vasoactive confounds. In the present study, healthy social drinkers were given a moderate alcohol dose and placebo in a within-subject design. Acute intoxication attenuated theta power to Stroop conflict and dysregulated co-oscillations between the ACC and latPFC, confirming that alcohol is detrimental to neural synchrony subserving cognitive control. It interferes with goal-directed behavior that may result in deficient self-control, contributing to compulsive drinking. In sum, this method can provide insight into real-time interactions during cognitive processing and can characterize the selective sensitivity to pharmacological challenge across relevant neural networks.

This experiment uses an anatomically-constrained magnetoencephalography (aMEG) method to examine brain oscillatory dynamics and long-range functional synchrony during engagement of cognitive control as a function of acute alcohol intoxication.

Interrupção do lóbulo Frontal sincronia Neural durante controle cognitivo por intoxicação alcoólica

Decision making relies on dynamic interactions of distributed, primarily frontal brain regions. Extensive evidence from functional magnetic resonance ...

Real-time In Vitro Monitoring of Odorant Receptor Activation by an Odorant in the Vapor Phase

Olfactory perception begins with the interaction of odorants with odorant receptors (OR) expressed by olfactory sensory neurons (OSN). Odor recognition follows a combinatorial coding scheme, where one OR can be activated by a set of odorants and one odorant can activate a combination of ORs. Through such combinatorial coding, organisms can detect and discriminate between a myriad of volatile odor molecules. Thus, an odor at a given concentration can be described by an activation pattern of ORs, which is specific to each odor. In that sense, cracking the mechanisms that the brain uses to perceive odor requires the understanding odorant-OR interactions. This is why the olfaction community is committed to &#34;de-orphanize&#34;&#160;these receptors. Conventional in vitro systems used to identify odorant-OR interactions have utilized incubating cell media with odorant, which is distinct from the natural detection of odors via vapor odorants dissolution into nasal mucosa before interacting with ORs. Here, we describe a new method that allows for real-time monitoring of OR activation via vapor-phase odorants. Our method relies on measuring cAMP release by luminescence using the Glosensor assay. It bridges current gaps between in vivo and in vitro approaches and provides a basis for a biomimetic volatile chemical sensor.

Physiologically, odorant receptors are activated by odorant molecules inhaled in the vapor phase. However, most in vitro systems utilize liquid phase odorant stimulation. Here, we present a method that allows real-time in vitro monitoring of odorant receptor activation upon odorant stimulation in vapor phase.

Em tempo real em Vitro monitoramento da ativação do Odorant Receptor por um odorante na fase de Vapor

Olfactory perception begins with the interaction of odorants with odorant receptors (OR) expressed by olfactory sensory neurons (OSN). Odor recognition ...

Rapid Isolation of Dorsal Root Ganglion Macrophages

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after peripheral nerve injury. Peripheral monocytic cells, including macrophages, are known to respond to a tissue injury through phagocytosis, antigen presentation, and cytokine release. Emerging evidence has implicated the contribution of dorsal root ganglia macrophages to neuropathic pain development and axonal repair in the context of nerve injury. Rapidly phenotyping (or &#8220;rapid isolation of&#8221;) the response of dorsal root ganglia macrophages in the context of nerve injury is desired to identify the unknown neuroimmune factors. Here we demonstrate how our lab rapidly and effectively isolates macrophages from the dorsal root ganglia using an enzyme-free mechanical dissociation protocol. The samples are kept on ice throughout to limit cellular stress. This protocol is far less time consuming compared to the standard enzymatic protocol and has been routinely used for our Fluorescence-activated Cell Sorting analysis.

Here we present a mechanical dissociation protocol to rapidly isolate macrophages from the dorsal root ganglion for phenotyping and functional analysis.

Isolação rápida de macrófagos dorsal do gânglio da raiz

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after ...

Positron Emission Tomography Imaging for In Vivo Measuring of Myelin Content in the Lysolecithin Rat Model of Multiple Sclerosis

Multiple sclerosis (MS) is a neuroinflammatory disease with expanding axonal and neuronal degeneration and demyelination in the central nervous system, leading to motor dysfunctions, psychical disability, and cognitive impairment during MS progression. Positron emission tomography (PET) is an imaging technique able to quantify in vivo cellular and molecular alterations.
Radiotracers with affinity to intact myelin can be used for in vivo imaging of myelin content changes over time. It is possible to detect either an increase or decrease in myelin content, what means this imaging technique can detect demyelination and remyelination processes of the central nervous system. In this protocol we demonstrate how to use PET imaging to detect myelin changes in the lysolecithin rat model, which is a model of focal demyelination lesion (induced by stereotactic injection) (i.e., a model of multiple sclerosis disease). 11C-PIB PET imaging was performed at baseline, and 1 week and 4 weeks after stereotaxic injection of lysolecithin 1% in the right striatum (4 &#181;L) and corpus callosum (3 &#181;L) of the rat brain, allowing quantification of focal demyelination (injection site after 1 week) and the remyelination process (injection site at 4 weeks).
Myelin PET imaging is an interesting tool for monitoring in vivo changes in myelin content which could be useful for monitoring demyelinating disease progression and therapeutic response.

Positron Emission Tomography Imaging for In Vivo Measuring of Myelin Content in the Lysolecithin Rat Model of Multiple Sclerosis

This protocol has the aim of monitoring in vivo myelin changes (demyelination and remyelination) by positron emission tomography (PET) imaging in an animal model of multiple sclerosis.

Tomografia de emissão de pósitrons para medição in vivo de conteúdo de mielina no modelo de rato de lysolecithin de esclerose múltipla

Multiple sclerosis (MS) is a neuroinflammatory disease with expanding axonal and neuronal degeneration and demyelination in the central nervous system, ...