Die Autoren möchten Glenn Sanger-Hodgson, Medien-Spezialist an der FSU College of Medicine für seine Arbeit in video-Produktion, Bearbeitung und Voice-over zu danken.
Diese Arbeit wurde von der National Institutes of Health (R01GM100474 und R01GM072611) unterstützt.

Die Methoden hier beschrieben und in Abschnitt 2 von der Florida State University institutionelle Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) genehmigt worden und folgt die Vorgaben in der Anleitung zur Pflege und Verwendung von Labortieren,8 Auflage . Alle Tiere, die in diesem in diesem Protokoll verwendeten sind Haus in einem speziellen Labor Tier bis zur Verwendung. Keine in-Vivo -Experimente wurde durchgeführt vor opfern. Tierzahlen beruhten auf experimentelle Notwendigkeit durchschnittliche Zelle und Myelin Sammlungen als Leitfaden verwenden, um die Nutzung zu minimieren.
Hinweis: Dieses Protokoll beschreibt die Generation von Knochenmark stammenden Makrophagen (BMDMs) (Abschnitt 1), die Vorbereitung von Eindringmittel beschrifteten Gehirn abgeleitet Myelin Schutt (Abschnitt 2), das allgemeine Verfahren für die Analyse von Myelin Schutt Phagozytose (Abschnitt 3), und das allgemeine Verfahren für die Analyse der Myelin Schutt Lipid Akkumulation (Abschnitt 4). Reagenz-Vorbereitung, Zelle Ernte und Manipulation, Myelin-Sammlung und Kennzeichnung und Testleistung sollte in einem laminaren Luftstrom Biosafety Kabinett abgeschlossen sein.
1. Generation der primären Knochenmark stammenden Makrophagen
<ol>
	<li>Erstellung von kompletten Makrophagen Kulturmedium (CMCM) Hinweis: Makrophagen-Generation aus dem Knochenmark erfordert den Einsatz von Makrophagen Kolonie-stimulierende Faktor (M-CSF). Dieses Präparat nutzt L929 murine Fibroblasten konditioniert Medien als Quelle für M-CSF.<ol>
		<li>Generieren Sie L929 murine Fibroblasten konditioniert Medien durch Kultivierung Zellen in 145 mm Schalen mit 50 mL des hohen Glukose (4500 mg/L L-Glukose) Dulbecco geändert Eagle Medium (DMEM) für 7 Tage mit 5 % neue geboren Kälberserum (NCS) und Penicillin/Streptomycin ergänzt.</li>
		<li>Sammeln Sie Medien aus Kulturen in 50 mL konische Zentrifuge Röhren und Zentrifuge für 30 Minuten bei 3500 X g, 4 ° C.</li>
		<li>Filtern Sie Überstände durch einen 0,2 µm Spritze Filter in eine neue konische Zentrifugenröhrchen 50 mL. Konditionierte Medien können bis zu 6 Monaten bei-80 ° C aufbewahrt werden.</li>
		<li>Um hohe Glukose DMEM, fügen Sie 5 % Vol/Vol NCS, 15 % Vol/Vol L929 murine Fibroblasten bedingt DMEM und 1 % Penicillin/Streptomycin. Medien können 2-3 Monate bei 4 ° C aufbewahrt werden. Auf 37 ° C vor dem Gebrauch warm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sammlung von primären Knochenmark-Zellen und Makrophagen Induktion 
	Hinweis: Mit diesem Protokoll eine Maus erzeugt etwa 20 Millionen Knochenmark stammenden Makrophagen (BMDMs).<ol>
		<li>Einschläfern Sie die gewünschte Anzahl von 8-10 Wochen alte Mäusen mit CO2 Erstickung Standardrichtlinien durch zervikale Dislokation gefolgt.</li>
		<li>Desinfizieren Sie das Tier mit 70 % Ethanol (Vol/Vol): H2O, das Fell zu sättigen.</li>
		<li>Schneiden Sie eine kleine Öffnung in den Bauch und ziehen Sie vorsichtig wieder die Haut um das darunter liegende Gewebe sichtbar zu machen. Achten Sie darauf, keine Punktion der Bauchhöhle.</li>
		<li>Entfernen Sie beide Hinterbeine an der Hüfte beginnend und endend am Knöchel. Ort der gesammelten Gewebe in eine 100 mm Petrischale mit 5-10 mL sterile Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) ergänzt mit 1 % Penicillin/Streptomycin. 
		Hinweis: Beim Verarbeiten mehrerer Tiere achten, Gerichte auf Eis, Gewebe Abbau zu begrenzen zu halten.</li>
		<li>Entfernen Sie Muskel- und Bindegewebe aus dem Knochen mit einem Skalpell. Nur das Femur und Tibia dienen zur Zellentnahme, die Fibula verworfen werden kann.</li>
		<li>Aussetzen des Knochenmark-Hohlraums der gesammelten Knochen durch einen kleinen Ausschnitt von jedem Ende mit einem Skalpell zu trimmen.</li>
		<li>Mit einer 25g Nadel, spülen Sie das Knochenmark Hohlräume mit CMCM in einem konischen Zentrifugenröhrchen 50 mL. Die Knochen werden weiß angezeigt, sobald sie ausreichend geleert wurden.</li>
		<li>Nach Abschluss der Sammlung agitieren Sie Aspiraten mit einer Nadel 18g für 30-90 s erzeugt eine einzelne Zellsuspension. 
		Hinweis: Ein optionale Erythrozyten (RBC) Lyse Schritt kann zu diesem Zeitpunkt ausgeführt werden. Es wurde vor kurzem vermutet, dass die intrazelluläre Eisengehalt der Auswirkungen von Myelin Schutt auf Makrophagen Polarisation16beeinflussen kann. Informationen über die Einbeziehung von RBC Zerstörung Schritt finden Sie unter Trouplin Et Al. 17.</li>
		<li>Filtern Sie die Aussetzung durch eine 70 µm sterile Zelle Sieb in eine neue konische Zentrifugenröhrchen 50 mL.</li>
		<li>Samen Zellen gleichmäßig in 145 mm Zelle Kultur Speisen mit 15-20 mL CMCM gesammelt. Verwenden Sie ca. drei Kultur Gerichte per Mausklick geopfert. Inkubation bei 37 ° C, 5 % CO2Kulturen.</li>
		<li>Nach 72 Stunden Platten einmal mit sterilen PBS waschen, nicht anhaftende Zellen zu entfernen, fügen Sie dann 15-20mL frische CMCM. Weitere 4 Tage bei 37 ° C, 5 % CO2inkubieren Sie Kulturen. Nach 7 Tagen der gesamten Kultur werden die blutbildenden Knochenmarkzellen zunächst isoliert Reifen BMDMs (Abbildung 1).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Generation von Eindringmittel beschrifteten Brain-Derived Myelin Schutt
Hinweis: Alle Reagenzien können bis zu 1 Monat bei 4 ° C aufbewahrt werden.
<ol>
	<li>Vorbereitung von Myelin Schutt Sammlung Reagenzien
	<ol>
		<li>Tris· vorbereiten CL-Pufferlösung.<ol>
			<li>800mL hinzufügen destilliertem entionisiertem H2O (DdiH2O), 20 mL 1 M Tris· CL, pH 7,45 (20 mM Endkonzentration) und 20 mL 100 mm Na2EDTA (2 mM Endkonzentration).</li>
			<li>Stellen Sie ein pH-Wert um 7.45 Uhr. Stellen Sie die Lautstärke auf 1000 mL mit DdiH2O. Filter-Lösung durch einen 0,2 µm Filtrationseinheit.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Bereiten Sie 1 M Saccharoselösung.<ol>
			<li>Auf 100 mL Tris· CL Puffer-Lösung, fügen Sie 68,46 g Saccharose. Lautstärke auf 200 mL mit Tris· CL-Pufferlösung. Filtern Sie die Lösung durch eine Filteranlage von 0,2 µm.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Bereiten Sie 200 mL von 0,32 M Saccharose-Lösung durch Verdünnung der Lösung 1 M mit der Tris· CL-Puffer-Lösung 0.83:0.16 (Vol/Vol).</li>
		<li>Bereiten Sie 150 mL 0,83 M Saccharose-Lösung durch Verdünnung der Lösung 1 M mit der Tris· CL-Puffer-Lösung 0.83:0.16 (Vol/Vol).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sammlung von Brain-derived Rohöl Myelin Schutt 
	Hinweis: Die hier beschriebene Methode der Sammlung ist für die Isolierung von Rohöl Myelin Schutt.<ol>
		<li>Einschläfern Sie 10-12 Mäuse 8-10 Wochen alt mit CO2 Erstickung Standardrichtlinien gefolgt von zervikale Dislokation.</li>
		<li>Sezieren Sie die Gehirne zu und legen Sie sie in eine 100 mm Schale mit 10 mL von 0,32 M Saccharoselösung.</li></ol></li></ol>Halten Sie die Schüssel auf dem Eis.
		<li>Mit sterile chirurgische Schere schneiden die Gehirne in Stücke ca. 5 mm3 in der Größe.</li>
		<li>Übertragen Sie das Gewebe auf einer konischen Zentrifugenröhrchen 50 mL und ca. 30 mL 0,32 M Saccharoselösung.</li>
		<li>Homogenisieren Sie mit einer sterilen Handheld rotary Homogenisator, bis eine glatte Lösung erreicht ist.</li>
		<li>Verdünnen Sie die homogenisierte Gehirne zu einem Endvolumen von 90 mL mit 0,32 M Saccharoselösung.</li>
		<li>Hinzugeben Sie auf sechs 38,5 mL dünnwandigen Polypropylen Ultrazentrifugen Rohre 20 mL 0,83 M Saccharoselösung.</li>
		<li>Fügen Sie sanft die homogenisierte Gehirn-Lösung an die Spitze der 0,83 M Saccharoselösung, kümmert sich nicht um die beiden Schichten zu mischen.</li>
		<li>Jedes Rohr mit den 0,32 M Saccharoselösung auszugleichen.</li>
		<li>Zentrifuge bei 100.000 x g 45 min bei 4° C mit einer geeigneten vorgekühlt Ultrazentrifugen Rotor. Setzen Sie Rotor Beschleunigungs- und Verzögerungswerte auf ihre minimale Werte um Myelin Schutt zu reduzieren.</li>
		<li>Sammeln Sie die Myelin-Trümmer von der Schnittstelle der beiden Saccharose dichten. 
		Hinweis: Schutt erscheint als ein weißes Band in Richtung der Mitte des Rohres.</li>
		<li>Kombinieren Sie die grobe Myelin Trümmer in eine konische Zentrifugenröhrchen 50 mL und stellen Sie die Lautstärke auf ca. 35 mL mit Tris· CL-Pufferlösung.</li>
		<li>Die grobe Myelin Trümmer mit einem sterilen Handheld rotary Homogenisator für 30-60 s zu homogenisieren.</li>
		<li>Unterteilen Sie gleichmäßig den Schwebezustand zwischen 6 saubere Ultrazentrifugen Rohre und Balance mit einem entsprechenden Volumen des Tris· CL-Pufferlösung.</li>
		<li>Zentrifuge bei 100.000 x g 45 min bei 4° C mit einer geeigneten vorgekühlt Ultrazentrifugen Rotor. Rotor Beschleunigungs- und Verzögerungswerte auf ihre maximale Werte einstellen</li>
		<li>Als feste weiße Pellets jetzt sichtbar sein werden, verwerfen Sie den Überstand und wieder auszusetzen Sie, die Pellets in 10-15 mL Tris· CL-Pufferlösung.</li>
		<li>Unterteilen Sie gleichmäßig den Schwebezustand zwischen 2 sauber Ultrazentrifugen Röhren und Balance mit einem entsprechenden Volumen des Tris· CL-Pufferlösung.</li>
		<li>Zentrifuge vorgekühlt wieder bei 100.000 x g 45 min bei 4 ° C mit einer geeigneten Ultrazentrifugen Rotor. Rotor Beschleunigungs- und Verzögerungswerte auf ihre maximale Werte einstellen</li>
		<li>Verwerfen Sie den Überstand und Aufschwemmen Sie der Pellets in 5-6 mL sterile PBS und teilen Sie den Schwebezustand zwischen einer angemessenen Zahl von vorgewogene 1,5 mL Mikro-Zentrifuge Röhren.</li>
		<li>Zentrifuge bei 22.000 x g für 10 min bei 4 ° C.</li>
		<li>Verwerfen Sie den Überstand und bestimmen Sie das Gewicht der Myelin-Schutt-Pellets.</li>
		<li>Wieder aussetzen Sie, die Pellets in PBS, eine Endkonzentration von 100 mg/mL. 
		Hinweis: zehn bis zwölf Gehirne ist genug, um 10-15 mL 100 mg/mL Myelin Schutt zu produzieren. Myelin Trümmer kann Speicher bei-80 ° C für 6 Monate sein.</li>
	
	
	<li>Myelin Schutt fluoreszierende Kennzeichnung
	<ol>
		<li>Bereiten Sie die 50 µM Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester (CFSE) Lösung unmittelbar vor der Anwendung.<ol>
			<li>Verwendung von sterilen PBS verdünnen Sie eine 5 mM-Stammlösung von CFSE-mit 100 % Dimethyl Sulfoxid (DMSO), eine Endkonzentration von Arbeiten von 50 µM vorbereitet.</li>
			<li>Filtern Sie Lösung durch einen 0,2 µm Spritze Filter.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Tauen Sie die gewünschte Menge von 100 mg/mL Myelin Schutt und erneut mit einer sterilen 29 g Nadel auszusetzen. 
		Hinweis: Einfrieren den Myelin-Schutt wird dazu führen, dass aus der Lösung erfordern Wiederfreisetzung vor Gebrauch fallen.</li>
		<li>Übertragen Sie Myelin Schutt auf eine vorgewogene 1,5 mL Mikro-Zentrifugenröhrchen.</li>
		<li>Zentrifuge bei 14.800 x g für 10 min bei 4° C. Verwerfen Sie den überstand.</li>
		<li>Aufzuwirbeln Sie die Myelin-Trümmer in 200 µL der CFSE-Lösung pro 100 µL Myelin Schutt pelleted.</li>
		<li>Inkubieren Sie für 30 min bei Raumtemperatur (RT) vor Licht geschützt werden.</li>
		<li>Zentrifuge bei 14.800 x g für 10 min bei 4 ° C. Verwerfen Sie den überstand.</li>
		<li>Das Pellet in 600-800 µL Waschpuffer Aufschwemmen (0,2 µm-Filter sterilisiert 100 mM Glycin mit PBS-Puffer).</li>
		<li>Zentrifuge bei 14.800 x g für 10 min bei 4 ° C. Verwerfen Sie den überstand.</li>
		<li>Wiederholen Sie die Schritte 2.3.8-2.3.9 zweimal mehr.</li>
		<li>Bestimmen Sie nach der letzten Wäsche, das Gewicht des Pellet-Myelin Schutt und wieder auszusetzen Sie bis 100 mg/mL mit sterilen PBS. Bemerkung: Beschriftete Myelin Schutt kann Shop bei-80 ° C für bis zu 6 Monaten.</li>
	</ol>
	</li>

(3) Myelin Schutt Phagozytose Assay
Hinweis: Im folgenden ist die grundlegende Methode zur Beobachtung von Phagozytose Eindringmittel beschrifteten Myelin Schutt. Zusatz von anderen Behandlungen und experimentellen Bedingungen wird durch den Prüfarzt optimiert werden müssen.
<ol>
	<li>Vorbereitung der Behandlung Platten
	<ol>
		<li>Für jede Platte 145 mm Reifen BMDMs in eine 15 mL konische Zentrifugenröhrchen mit 5-6 mL 10 mM Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA) in Dulbeccos Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (dPBS) (pH 7,4) sammeln. 
		Hinweis: Verwenden Sie Trypsin nicht, da es den Aktivierungsstatus der Zellen18verändern kann.</li>
		<li>Jedes Rohr gesammelt Zellen ein gleiches Volumen des vorgewärmten CMCM hinzufügen.</li>
		<li>Zentrifuge bei 180 X g für 8 min bei 20 ° C. Verwerfen Sie den überstand.</li>
		<li>Wieder aussetzen Sie Zellen in CMCM und Count.</li>
		<li>Fügen Sie in jede Vertiefung einer 24-Well-Zelle-Kultur-Platte 1 x 105 Zellen in 1 mL der CMCM hinzu.</li>
		<li>Inkubation bei 37 ° C, 5 % CO2 für 24 h.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Myelin Schutt Behandlung und Analyse
	<ol>
		<li>Fügen Sie 10 µL von 100 mg/mL CFSE Myelin Schutt in jede Vertiefung (1 mg/mL Endkonzentration) beschriftet.</li>
		<li>1-3 Stunden bei 37 ° C, 5 % CO2inkubieren.</li>
		<li>Waschen Sie die Platte 3 Mal mit sterilen PBS, nicht verschlungen Myelin Ablagerungen zu entfernen.</li>
		<li>400 µL 4 % Paraformaldehyd in jede Vertiefung hinzufügen. 30 min bei RT inkubieren</li>
		<li>Waschen Sie Platte 2 Mal mit sterilen PBS.</li>
		<li>Jedes gut 400 µL Hoechst 33258 Lösung hinzufügen. Inkubieren Sie für 5 min bei RT vor Licht geschützt werden.</li>
		<li>Waschen Sie Platten 2 Mal mit sterilen PBS.</li>
		<li>Fügen Sie 200 µL Fluoro-Gel mit Tris-Puffer in jede Vertiefung, Immunofluoreszenz zu reduzieren.</li>
		<li>Zellen mit einem inversen Epi-Leuchtstofflampen in der Lage, Mikroskop. 
		Hinweis: Die Anregung und Emission Wellenlängen des CFSE-sind 494 nm und 521 nm, beziehungsweise.</li>
		<li>Teilen Sie die Anzahl der CFSE-positive Zellen durch die Anzahl der Nukleonen relative Myelin Schutt Aufnahme zu bestimmen.</li>
		<li>Pflegen Sie vor der Bildgebung Platten für bis zu 7 Tage bei 4 ° C, vor Licht geschützt.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
(4) Quantifizierung der intrazellulären Lipide über Öl Färbung rot-O
Hinweis: Im folgenden ist die grundlegende Methode zur Beobachtung von intrazellulären Myelin-Schutt-derived Lipide.Die Verwendung von CFSE beschriftet Myelin Schutt empfiehlt sich nicht für fluoreszierende Quantifizierung von ORO Färbung durch spektrale Überlappung. Zusatz von anderen Behandlungen und experimentellen Bedingungen wird durch den Prüfarzt optimiert werden müssen.
<ol>
	<li>Vorbereitung der Färbung Lösungen
	<ol>
		<li>0,5 % Öl rot-O (ORO) Färbelösung vorzubereiten.<ol>
			<li>Fügen Sie langsam 100 mL 100 % Propylenglykol (1,2-Propandiol) bis 0,5 g Oro (1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol) unter Rühren.</li>
			<li>Erhitzen Sie die Lösung bei 95 ° C für 15 Minuten oder bis alle große Partikel aufgelöst haben. 
			Hinweis: nicht erhitzen über 100 ° C.</li>
			<li>Lösung durch ein Stück Filterpapier während noch warm in einen neuen Container zu filtern.</li>
			<li>Lassen Sie zu, dass Lösung kühlen über Nacht bei RT-Lösung für bis zu 1 Jahr bei RT aufbewahrt werden können</li>
		</ol>
		</li>
		<li>85 % Propylenglykol Lösung ansetzen.<ol>
			<li>15 mL DdiH2O. rühren, bis gemischt fügen Sie 85 mL 100 % Propylenglykol hinzu. Lösung kann bis zu 1 Jahr bei RT gelagert werden</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Vorbereitung der Behandlung Platten
	<ol>
		<li>Bereiten Sie eine 24-Well-Platte nach der in Abschnitt 3 beschriebenen Methode.</li>
		<li>Inkubation bei 37 ° C, 5 % CO2 für 24 h.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Myelin Schutt Behandlung
	<ol>
		<li>Fügen Sie 10 µL von 100 mg/mL Myelin Schutt in jede Vertiefung (1 mg/mL Endkonzentration).</li>
		<li>1-3 h bei 37 ° C, 5 % CO2inkubieren.</li>
		<li>Waschen Sie die Platte 3 Mal mit sterilen PBS, nicht verdaut Myelin Ablagerungen zu entfernen. Hinweis: An dieser Stelle Platten können entweder sofortige Fixierung unterziehen oder frische CMCM kann hinzugefügt werden, und Zellen nach Inkubation für zusätzliche Zeitpunkte zurück.</li>
		<li>400 µL 4 % Paraformaldehyd in jede Vertiefung hinzufügen. 30 min bei RT inkubieren</li>
		<li>Waschen Sie die Platte 2 Mal mit sterilen PBS dann Handlungsschritte zu beflecken.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>ORO Färbung und Analyse
	<ol>
		<li>Waschen Sie feste Platte mit DdiH2O. 3 Mal</li>
		<li>400 µL 100 % Propylenglykol in jede Vertiefung hinzufügen und 5 min bei RT inkubieren 
		Hinweis: Dies reduziert die Übertragung von DdiH2O.</li>
		<li>Aspirieren Sie das Propylenglykol und jedes gut fügen Sie 400 µL ORO-Lösung hinzu.</li>
		<li>8 min bei 60 ° c inkubieren</li>
		<li>Aspirieren Sie die ORO-Lösung. Dann fügen Sie 400 µL von 85 % Propylenglykol in jede Vertiefung und 5 Minumintes bei RT inkubieren</li>
		<li>Waschen der Platte 3 Mal mit DdiH2O.</li>
		<li>Jedes gut 400 µL Hoechst 33258 Lösung hinzufügen. Inkubieren Sie für 5 min bei RT, vor Licht geschützt werden.</li>
		<li>Waschen Sie Platten 2 Mal mit sterilen PBS.</li>
		<li>Fügen Sie 200 µL Fluoro-Gel mit Tris-Puffer in jede Vertiefung.</li>
		<li>Zellen mit einem inversen Epi-Leuchtstofflampen in der Lage, Mikroskop. ORO kann mit einem standard Texas Red oder DsRed Filtersatz abgebildet werden.</li>
		<li>Quantifizieren Sie relative Lipid Aufbewahrung durch Bestimmung der ORO positiven Bereichs in jedem Bildfeld und dividiert sie durch die Anzahl der Nukleonen.</li>
		<li>Pflegen Sie Platten für 7 Tage bei 4 ° C vor Licht geschützt.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+biology+in+development,+homeostasis+and+disease.">Macrophage biology in development, homeostasis and disease.</a> Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).</li><li>Unanue, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen-presenting+function+of+the+macrophage.">Antigen-presenting function of the macrophage.</a> Annu Rev Immunol. 2, 395-428 (1984).</li><li>Cavaillon, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokines+and+macrophages.">Cytokines and macrophages.</a> Biomed Pharmacother. 48 (10), 445-453 (1994).</li><li>Ren, Y., Savill, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis:+the+importance+of+being+eaten.">Apoptosis: the importance of being eaten.</a> Cell Death Differ. 5 (7), 563-568 (1998).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+in+spinal+cord+injury:+phenotypic+and+functional+change+from+exposure+to+myelin+debris.">Macrophages in spinal cord injury: phenotypic and functional change from exposure to myelin debris.</a> Glia. 63 (4), 635-651 (2015).</li><li>Goodrum, J. F., Earnhardt, T., Goines, N., Bouldin, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+of+myelin+lipids+during+degeneration+and+regeneration+of+peripheral+nerve:+an+autoradiographic+study.">Fate of myelin lipids during degeneration and regeneration of peripheral nerve: an autoradiographic study.</a> J Neurosci. 14 (1), 357-367 (1994).</li><li>Greenhalgh, A. D., David, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+the+Phagocytic+Response+of+Microglia+and+Peripheral+Macrophages+after+Spinal+Cord+Injury+and+Its+Effects+on+Cell+Death.">Differences in the Phagocytic Response of Microglia and Peripheral Macrophages after Spinal Cord Injury and Its Effects on Cell Death.</a> J Neurosci. 34 (18), 6316 (2014).</li><li>Sun, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+activates+FAK/Akt/NF-kappaB+pathways+and+provokes+CR3-dependent+inflammatory+response+in+murine+system.">Myelin activates FAK/Akt/NF-kappaB pathways and provokes CR3-dependent inflammatory response in murine system.</a> PLoS One. 5 (2), e9380 (2010).</li><li>Gensel, J. C., Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+activation+and+its+role+in+repair+and+pathology+after+spinal+cord+injury.">Macrophage activation and its role in repair and pathology after spinal cord injury.</a> Brain Res. , 1-11 (2015).</li><li>Bourre, J. M., Pollet, S., Daudu, O., Le Saux, F., Baumann, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+consists+of+a+continuum+of+particles+of+different+density+with+varying+lipid+composition:+major+differences+are+found+between+normal+mice+and+quaking+mutants.">Myelin consists of a continuum of particles of different density with varying lipid composition: major differences are found between normal mice and quaking mutants.</a> Biochimie. 59 (10), 819-824 (1977).</li><li>Larocca, J. N., Norton, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Current Protocols in Cell Biology. , (2001).</li><li>Norton, W. T., Poduslo, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelination+in+rat+brain:+method+of+myelin+isolation.">Myelination in rat brain: method of myelin isolation.</a> J Neurochem. 21 (4), 749-757 (1973).</li><li>Wang, X. Q., Duan, X. M., Liu, L. H., Fang, Y. Q., Tan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carboxyfluorescein+diacetate+succinimidyl+ester+fluorescent+dye+for+cell+labeling.">Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester fluorescent dye for cell labeling.</a> Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 37 (6), 379-385 (2005).</li><li>Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+dyes+for+lymphocyte+migration+and+proliferation+studies.">Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies.</a> Immunol Cell Biol. 77 (6), 499-508 (1999).</li><li>Deutsch, M. J., Schriever, S. C., Roscher, A. A., Ensenauer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+image+analysis+approach+for+lipid+droplet+size+quantitation+of+Oil+Red+O-stained+cultured+cells.">Digital image analysis approach for lipid droplet size quantitation of Oil Red O-stained cultured cells.</a> Anal Biochem. 445, 87-89 (2014).</li><li>Kroner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNF+and+increased+intracellular+iron+alter+macrophage+polarization+to+a+detrimental+M1+phenotype+in+the+injured+spinal+cord.">TNF and increased intracellular iron alter macrophage polarization to a detrimental M1 phenotype in the injured spinal cord.</a> Neuron. 83 (5), 1098-1116 (2014).</li><li>Trouplin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marrow-derived+Macrophage+Production.">Marrow-derived Macrophage Production.</a> J Vis Exp. (81), e50966 (2013).</li><li>Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Detachment+Methods+on+M2+Macrophage+Phenotype+and+Function.">Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function.</a> J Immunol Methods. 426, 56-61 (2015).</li><li>Guo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescuing+macrophage+normal+function+in+spinal+cord+injury+with+embryonic+stem+cell+conditioned+media.">Rescuing macrophage normal function in spinal cord injury with embryonic stem cell conditioned media.</a> Mol Brain. 9 (1), 48 (2016).</li><li>Bosco, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+synthetic+matrix+metalloproteinase+inhibitor+reduces+human+mesenchymal+stem+cell+adipogenesis.">A new synthetic matrix metalloproteinase inhibitor reduces human mesenchymal stem cell adipogenesis.</a> PLOS ONE. 12 (2), e0172925 (2017).</li><li>Ram&#237;rez-Zacar&#237;as, J. L., Castro-Mu&#241;ozledo, F., Kuri-Harcuch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+adipose+conversion+and+triglycerides+by+staining+intracytoplasmic+lipids+with+oil+red+O.">Quantitation of adipose conversion and triglycerides by staining intracytoplasmic lipids with oil red O.</a> Histochem. 97 (6), 493-497 (1992).</li><li>Koopman, R., Schaart, G., Hesselink, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimisation+of+oil+red+staining+permits+combination+with+immunofluorescence+and+automated+quantification+of+lipids.">Optimisation of oil red staining permits combination with immunofluorescence and automated quantification of lipids.</a> Histochem Cell Biol. 116 (1), 63-68 (2001).</li><li>Fang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide-Induced+Macrophage+Inflammatory+Response+Is+Regulated+by+SHIP.">Lipopolysaccharide-Induced Macrophage Inflammatory Response Is Regulated by SHIP.</a> J Immunol. 173 (1), (2004).</li><li>Martinez, F. O., Sica, A., Mantovani, A., Locati, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+activation+and+polarization.">Macrophage activation and polarization.</a> Front Biosci. 13, (2008).</li><li>Mosser, D. M., Edwards, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+full+spectrum+of+macrophage+activation.">Exploring the full spectrum of macrophage activation.</a> Nat Rev Immunol. 8 (12), 958-969 (2008).</li></ol>

Die Autoren haben keine Angaben.

Die hier beschriebenen Verfahren nutzen frisch isolierte Rohöl CNS Myelin Schutt und primäre Knochenmark stammenden Makrophagen. Um tierische Ausgaben zu reduzieren, empfehlen wir, die beiden Gehirne und Knochenmarkzellen von jeder Maus zum Zeitpunkt des Opfers geerntet werden. Zwei Forscher gemeinsam können beide Materialien gleichzeitig zubereiten. Alternativ können Gehirne bei-80 ° C in PBS mit Antibiotika vor dem Myelin Schutt Isolierung ergänzt gespeichert werden. Es ist gewesen, dass unsere Erfahrung, die Geh...

Knochenmark stammenden Makrophagen (BMDMs) sind ein wichtiges Bindeglied zwischen der angeborenen und der adaptiven Immunsystem. Als antigenpräsentierende Zellen (APCs) sie können mit Lymphozyten über beide Antigenpräsentation kommunizieren und Cytokine release1,2,3. Ihre primäre Funktion ist jedoch als professionelle Phagozyten, Krankheitserreger, gealterten Zellen und Zelltrümmer1,4löschen. Nach einer Rückenmarksverletzung ("SCI") ist verantwortlich für CNS Axon Myelinisierung5Zelltyp erhebliche Mengen von Myelin Schutt von sterbenden Oligodendrozyten generiert. Wir und andere haben gezeigt, dass Clearance von Myelin Schutt in erster Linie die Verantwortung der Infiltration BMDMs5,6,7. Allerdings wurde in Verletzung des Rückenmarks Websites Engulfment von Myelin Schutt vorgeschlagen, diese normalerweise entzündungshemmenden Zellen auf einer Pro-entzündliche Zustand5,8,9verschoben. Als wichtige Vermittler von Neuroinflammation im verletzten Rückenmark sind BMDMs wichtige klinische Ziele.
Um den Einfluss der BMDMs im verletzten Rückenmark untersuchen zu helfen, haben wir eine in-Vitro -Modell, um direkt zu studieren, wie BMDMs auf Myelin Schmutz reagieren entwickelt. Zur Verbesserung der biologischen Relevanz sind primären murinen BMDMs und frisch isolierte Myelin Ablagerungen in diesen Untersuchungen verwendet. Als solche, die hier vorgestellten Methoden auch detailliert die Isolation und die Kultur der primären murinen BMDMs und eine modifizierte Saccharose gradient Technik, murine CNS isolieren abgeleitet Myelin Schutt10,11,12. Myelin Schmutz kann leicht beschriftet werden, mit einem Fluoreszenzfarbstoff Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester (CFSE-), zu verfolgen, die die Internalisierung von BMDMs. CFSE-für diese Anwendung geeignet ist, denn es ist nicht zytotoxisch und seine schmalen Fluoreszenzspektrum Genehmigungen Multiplexen mit anderen fluoreszierende Sonden13,14. Nach Phagozytose Myelin Schutt Lipide sind durch den Lysosomen transportiert und als neutralen Lipiden in intrazellulären Lipid Tröpfchen5verpackt. Um diese intrazellulären Lipid-Ansammlung zu quantifizieren, präsentieren wir ein Öl rot O (ORO) Färbung Methode optimiert für quantitative Bildanalyse. Diese einfache Färbung Methode produziert robuste reproduzierbare Ergebnisse und Quantifizierung15. Diese Methoden ermöglichen die Untersuchung von Myelin Schutt Phagozytose und Lipid-Aufbewahrung mit begrenzten Spezialausrüstung.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="669">
	<tbody>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:42px;width:180px;">DMEM</td>
			<td style="width:149px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:115px;">SH30243.01</td>
			<td style="width:225px;">High glucose with L-glutamine, sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:63px;width:180px;">Penicillin-Streptomycin Solution</td>
			<td style="width:149px;">Corning</td>
			<td style="width:115px;">30-002-CI</td>
			<td style="width:225px;">100X Solution</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:42px;width:180px;">New Born Calf Serum (NCS)</td>
			<td style="width:149px;">Rocky Mountain Biologics</td>
			<td style="width:115px;">NBS-BBT-5XM</td>
			<td style="width:225px;">United States Origin</td>
		</tr>
		<tr height="83">
			<td height="83" style="height:83px;width:180px;">NCTC clone 929 [L cell, L-929, derivative of Strain L]&#160;</td>
			<td style="width:149px;">ATCC</td>
			<td style="width:115px;">CCL-1</td>
			<td style="width:225px;">L929 Cell Line of Conditioned Media Preparation</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:42px;width:180px;">24-well Cell Culture Plates</td>
			<td style="width:149px;">VWR</td>
			<td style="width:115px;">10062-896&#160;</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:180px;">Cell Culture Dish</td>
			<td style="width:149px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:115px;">639960</td>
			<td style="width:225px;">Polystyrine, 145/20mm</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:42px;width:180px;">CFSE Cell Proliferation Kit</td>
			<td style="width:149px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:115px;">C34570</td>
			<td style="width:225px;">DMSO for Reconsitution Provided</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:42px;width:180px;">Fluoro-gel with Tris Buffer&#160;</td>
			<td style="width:149px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:115px;">17985-11</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:180px;">Oil Red O</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:115px;">O0625</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:180px;">Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Materials</td>
			<td style="width:149px;">Company</td>
			<td style="width:115px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:225px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:42px;width:180px;">Ultracentrifuge Tubes</td>
			<td style="width:149px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:115px;">326823</td>
			<td style="width:225px;">Thinwall, Polypropylene, 38.5 mL, 25 x 89 mm</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:63px;width:180px;">SW 32 Ti Ultracentrifuge Rotor</td>
			<td style="width:149px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:115px;">369650</td>
			<td style="width:225px;">SW 32 Ti Rotor, Swinging Bucket, Titanium</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:42px;width:180px;">Hand Held Rotary Homogenizer</td>
			<td style="width:149px;">Fisher Science</td>
			<td style="width:115px;">08-451-71</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro phagocytosis of myelin debris by bone marrow-derived macrophages

Knochenmark stammenden Makrophagen (BMDMs) sind reife Leukozyten, die eine wichtige physiologische Rolle als professionelle Phagozyten in der Lage, der clearing-einer Vielzahl von Teilchen dienen. Normalerweise BMDMs werden daran gehindert, das zentrale Nervensystem (ZNS), aber nach einer Verletzung können sie ohne weiteres zu infiltrieren. Einmal eignen sich in das verletzte Gewebe CNS, BMDMs Primärzelle verantwortlich für die Abfertigung von Verletzungen abgeleitet Zelltrümmer, einschließlich große Mengen an Lipid reichen Myelin Schutt. Die neuropathologische Auswirkungen BMDM Infiltration und Myelin Schutt Phagozytose innerhalb des ZNS sind komplex und nicht gut verstanden. Die hier beschriebenen Protokolle ermöglichen die direkten in-vitro- Untersuchung der BMDMs im Rahmen der CNS Verletzung. Wir decken murinen BMDM Isolierung und Kultur, Myelin Schutt Vorbereitung und Tests um BMDM Myelin Schutt Phagozytose zu beurteilen. Diese Techniken robuste quantifizierbare Ergebnisse ohne signifikante spezialisierte Geräte oder Materialien zu produzieren, aber können leicht angepasst werden, um die Bedürfnisse der Forscher.

Behandlung von BMDMs mit CFSE beschriftet Myelin Ablagerungen sollten klare Internalisierung (Abbildung 2) ergeben. Während eine 3-stündigen Interaktionszeit für BMDMs, genügend zusätzlichen Myelin Schutt für robuste nachgelagerten Erkennung phagozytieren ausreicht, kann mit weniger als 1 Stunde von Interaktion intrazelluläre Akkumulation beobachtet werden. Jedoch kann einige Myelin Trümmer nach dem Waschen immer noch auf der Zelloberfläche vorhanden sein. Dies ist möglicherweise a...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Phagocytosis of Myelin Debris by Bone Marrow-Derived Macrophages at JoVE.com

In Vitro Phagocytosis of Myelin Debris by Bone Marrow-Derived Macrophages

Wir präsentieren Ihnen Methoden, um die phagocytic Fähigkeit der primären murinen Knochenmark stammenden Makrophagen mit Gewebekulturen beschrifteten Myelin Schutt und intrazellulären Lipid Droplet Färbung bewerten.

In-vitro- Phagozytose von Myelin Schutt durch Knochenmark stammenden Makrophagen

Bone marrow-derived macrophages (BMDMs) are mature leukocytes that serve a critical physiological role as professional phagocytes capable of clearing a ...

in-vitro-phagocytosis-myelin-debris-bone-marrow-derived

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Vitro Phagocytosis of Myelin Debris by Bone Marrow-Derived Macrophages

12.5K Aufrufe.  Florida State University. Wir präsentieren Ihnen Methoden, um die phagocytic Fähigkeit der primären murinen Knochenmark stammenden Makrophagen mit Gewebekulturen beschrifteten Myelin Schutt und intrazellulären Lipid Droplet Färbung bewerten.

Serie: In Vitro Phagocytosis of Myelin Debris by Bone Marrow-Derived Macrophages

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

Die Transfektion von Maus retinalen Ganglienzellen durch In vivo Elektroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Forschung

Neurowissenschaften

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be stimulated by neuronally-released transmitter. However, the ability of astrocytic receptors to exhibit plasticity in response to changes in neuronal activity has received little attention. Here we describe a model system that can be used to globally scale up or down astrocytic group I metabotropic glutamate receptors (mGluRs) in acute brain slices. Included are methods on how to prepare parasagittal hippocampal slices, construct chambers suitable for long-term slice incubation, bidirectionally manipulate neuronal action potential frequency, load astrocytes and astrocyte processes with fluorescent Ca2+ indicator, and measure changes in astrocytic Gq GPCR activity by recording spontaneous and evoked astrocyte Ca2+ events using confocal microscopy. In essence, a &#8220;calcium roadmap&#8221; is provided for how to measure plasticity of astrocytic Gq GPCRs. Applications of the technique for study of astrocytes are discussed. Having an understanding of how astrocytic receptor signaling is affected by changes in neuronal activity has important implications for both normal synaptic function as well as processes underlying neurological disorders and neurodegenerative disease.

Here we describe an adaptation of protocols used to induce homeostatic plasticity in neurons for the study of plasticity of astrocytic G protein-coupled receptors. Recently used to examine changes in astrocytic group I mGluRs in juvenile mice, the method can be applied to measure scaling of various astrocytic GPCRs, in tissue from adult mice in situ and in vivo, and to gain a better appreciation of the sensitivity of astrocytic receptors to changes in neuronal activity.

Induktion von Plastizität Astrozytäre Rezeptoren durch Manipulation der neuronalen Feuerraten

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise from extra-retinal sources. Ex vivo ERG provides an efficient method to dissect the function of retinal cells directly from an intact isolated retina of animals or donor eyes. In addition, ex vivo ERG can be used to test the efficacy and safety of potential therapeutic agents on retina tissue from animals or humans. We show here how commercially available in vivo ERG systems can be used to conduct ex vivo ERG recordings from isolated mouse retinas. We combine the light stimulation, electronic and heating units of a standard in vivo system with custom-designed specimen holder, gravity-controlled perfusion system and electromagnetic noise shielding to record low-noise ex vivo ERG signals simultaneously from two retinas with the acquisition software included in commercial in vivo systems. Further, we demonstrate how to use this method in combination with pharmacological treatments that remove specific ERG components in order to dissect the function of certain retinal cell types.

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Ex vivo ERG can be used to record electrical activity of retinal cells directly from isolated intact retinas of animals or humans. We demonstrate here how common in vivo ERG systems can be adapted for ex vivo ERG recordings in order to dissect the electrical activity of retinal cells.

Gleichzeitig<em&gt; Ex vivo</em&gt; Funktionsprüfung von zwei Netzhäute von<em&gt; In vivo</em&gt; Elektroretinogramm-System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes

Astrocytes are the major cell type in the brain and directly contact synapses and blood vessels. Although microglial cells have been considered the major immune cells and only phagocytes in the brain, recent studies have shown that astrocytes also participate in various phagocytic processes, such as developmental synapse elimination and clearance of amyloid beta plaques in Alzheimer&#39;s disease (AD). Despite these findings, the efficiency of astrocyte engulfment and degradation of their targets is unclear compared with that of microglia. This lack of information is mostly due to the lack of an assay system in which the kinetics of astrocyte- and microglia-mediated phagocytosis are easily comparable. To achieve this goal, we have developed a long-term live-imaging in vitro phagocytosis assay to evaluate the phagocytic capacity of purified astrocytes and microglia. In this assay, real-time detection of engulfment and degradation is possible using pH indicator-conjugated synaptosomes, which emit bright red fluorescence in acidic organelles, such as lysosomes. Our novel assay provides simple and effective detection of phagocytosis through live-imaging. In addition, this in vitro phagocytosis assay can be used as a screening platform to identify chemicals and compounds that can enhance or inhibit the phagocytic capacity of astrocytes. As synaptic pruning malfunction and pathogenic protein accumulation have been shown to cause mental disorders or neurodegenerative diseases, chemicals and compounds that modulate the phagocytic capacity of glial cells should be helpful in treating various neurological disorders.

A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes

This protocol presents an in vitro live-imaging phagocytosis assay to measure the phagocytic capacity of astrocytes. Purified rat astrocytes and microglia are used along with pH indicator-conjugated synaptosomes. This method can detect real-time engulfment and degradation kinetics and provides a suitable screening platform to identify factors modulating astrocyte phagocytosis.

Ein neuartiges In vitro- Live-Imaging Assay Astrozyten vermittelt Phagozytose mittels pH Indikator konjugiert Synaptosomes

Astrocytes are the major cell type in the brain and directly contact synapses and blood vessels. Although microglial cells have been considered the major ...

Ocular Kinematics Measured by In Vitro Stimulation of the Cranial Nerves in the Turtle

After animals are euthanized, their tissues begin to die. Turtles offer an advantage because of a longer survival time of their tissues, especially when compared to warm-blooded vertebrates. Because of this, in vitro experiments in turtles can be performed for extended periods of time to investigate the neural signals and control of their target actions. Using an isolated head preparation, we measured the kinematics of eye movements in turtles, and their modulation by electrical signals carried by cranial nerves. After the brain was removed from the skull, leaving the cranial nerves intact, the dissected head was placed in a gimbal to calibrate eye movements. Glass electrodes were attached to cranial nerves (oculomotor, trochlear, and abducens) and stimulated with currents to evoke eye movements. We monitored eye movements with an infrared video tracking system and quantified rotations of the eyes. Current pulses with a range of amplitudes, frequencies, and train durations were used to observe effects on responses. Because the preparation is separated from the brain, the efferent pathway going to muscle targets can be examined in isolation to investigate neural signaling in the absence of centrally processed sensory information.

Ocular Kinematics Measured by In Vitro Stimulation of the Cranial Nerves in the Turtle

This protocol describes how to use an in vitro isolated turtle head preparation to measure the kinematics of their eye movements. After removal of the brain from the cranium, cranial nerves can be stimulated with currents to quantify rotations of the eye and changes in pupil sizes.

Okuläre Kinematik gemessen durch In-vitro- Stimulation der Hirnnerven in die Schildkröte

After animals are euthanized, their tissues begin to die. Turtles offer an advantage because of a longer survival time of their tissues, especially when ...

Identification of Dopamine D1-Alpha Receptor Within Rodent Nucleus Accumbens by an Innovative RNA In Situ Detection Technology

In the central nervous system, the D1-alpha subtype receptor (Drd1&#945;) is the most abundant dopamine (DA) receptor, which plays a vital role in regulating neuronal growth and development. However, the mechanisms underlying Drd1&#945; receptor abnormalities mediating behavioral responses and modulating working memory function are still unclear. Using a novel RNA in situ hybridization assay, the current study identified dopamine Drd1&#945; receptor and tyrosine hydroxylase (TH) RNA expression from DA-related circuitry in the nucleus accumbens (NAc) area and substantia nigra region (SNR), respectively. Drd1&#945; expression in the NAc shows a &#34;discrete dot&#34; staining pattern. Clear sex differences in Drd1&#945; expression were observed. In contrast, TH shows a &#34;clustered&#34; staining pattern. Regarding TH expression, female rats displayed a higher signal expression per cell relative to male animals. The methods presented here provide a novel in situ hybridization technique for investigating changes in dopamine system dysfunction during the progression of central nervous system diseases.

Identification of Dopamine D1-Alpha Receptor Within Rodent Nucleus Accumbens by an Innovative RNA In Situ Detection Technology

Identification of dopamine D1-alpha receptor in the nucleus accumbens is critical for clarifying D1 receptor dysfunction during a central nervous system disease. We performed a novel RNA in situ hybridization assay to visualize single RNA molecules in a specific brain area.

Identifizierung von Dopamin-D1-Alpha-Rezeptor im Nagetier Nucleus Accumbens durch eine Innovative RNA- In Situ -Detection-Technologie

In the central nervous system, the D1-alpha subtype receptor (Drd1&#945;) is the most abundant dopamine (DA) receptor, which plays a vital role in ...

Modeling Charcot-Marie-Tooth Disease In Vitro by Transfecting Mouse Primary Motoneurons

Neurodegeneration of spinal motoneurons (MNs) is implicated in a large spectrum of neurological disorders including amyotrophic lateral sclerosis, Charcot-Marie-Tooth disease, and spinal muscular atrophy, which are all associated with muscular atrophy. Primary cultures of spinal MNs have been used widely to demonstrate the involvement of specific genes in such diseases and characterize the cellular consequences of their mutations. This protocol models a primary MN culture derived from the seminal work of Henderson and colleagues more than twenty years ago. First, we detail a method of dissecting the anterior horns of the spinal cord from a mouse embryo and isolating the MNs from neighboring cells using a density gradient. Then, we present a new way of efficiently transfecting MNs with expression plasmids using magnetofection. Finally, we illustrate how to fix and immunostain primary MNs. Using neurofilament mutations that cause Charcot-Marie-Tooth disease type 2, this protocol demonstrates a qualitative approach to expressing proteins of interest and studying their involvement in MN growth, maintenance, and survival.

Modeling Charcot-Marie-Tooth Disease In Vitro by Transfecting Mouse Primary Motoneurons

The goal of this technique is to prepare a highly enriched culture of primary motoneurons (MNs) from murine spinal cord. To evaluate the consequences of mutations causing MN diseases, we describe here the isolation of these isolated MNs and their transfection by magnetofection.

Charcot-Marie-Zahn Krankheit In Vitro Modellierung durch Transfecting Maus primären Motoneurone

Neurodegeneration of spinal motoneurons (MNs) is implicated in a large spectrum of neurological disorders including amyotrophic lateral sclerosis, ...

Real-time In Vitro Monitoring of Odorant Receptor Activation by an Odorant in the Vapor Phase

Olfactory perception begins with the interaction of odorants with odorant receptors (OR) expressed by olfactory sensory neurons (OSN). Odor recognition follows a combinatorial coding scheme, where one OR can be activated by a set of odorants and one odorant can activate a combination of ORs. Through such combinatorial coding, organisms can detect and discriminate between a myriad of volatile odor molecules. Thus, an odor at a given concentration can be described by an activation pattern of ORs, which is specific to each odor. In that sense, cracking the mechanisms that the brain uses to perceive odor requires the understanding odorant-OR interactions. This is why the olfaction community is committed to &#34;de-orphanize&#34;&#160;these receptors. Conventional in vitro systems used to identify odorant-OR interactions have utilized incubating cell media with odorant, which is distinct from the natural detection of odors via vapor odorants dissolution into nasal mucosa before interacting with ORs. Here, we describe a new method that allows for real-time monitoring of OR activation via vapor-phase odorants. Our method relies on measuring cAMP release by luminescence using the Glosensor assay. It bridges current gaps between in vivo and in vitro approaches and provides a basis for a biomimetic volatile chemical sensor.

Physiologically, odorant receptors are activated by odorant molecules inhaled in the vapor phase. However, most in vitro systems utilize liquid phase odorant stimulation. Here, we present a method that allows real-time in vitro monitoring of odorant receptor activation upon odorant stimulation in vapor phase.

In-vitro-Überwachung der Duftstoff-Rezeptor-Aktivierung durch einen Geruchsstoff in der Dampfphase in Echtzeit

Olfactory perception begins with the interaction of odorants with odorant receptors (OR) expressed by olfactory sensory neurons (OSN). Odor recognition ...

Rapid Isolation of Dorsal Root Ganglion Macrophages

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after peripheral nerve injury. Peripheral monocytic cells, including macrophages, are known to respond to a tissue injury through phagocytosis, antigen presentation, and cytokine release. Emerging evidence has implicated the contribution of dorsal root ganglia macrophages to neuropathic pain development and axonal repair in the context of nerve injury. Rapidly phenotyping (or &#8220;rapid isolation of&#8221;) the response of dorsal root ganglia macrophages in the context of nerve injury is desired to identify the unknown neuroimmune factors. Here we demonstrate how our lab rapidly and effectively isolates macrophages from the dorsal root ganglia using an enzyme-free mechanical dissociation protocol. The samples are kept on ice throughout to limit cellular stress. This protocol is far less time consuming compared to the standard enzymatic protocol and has been routinely used for our Fluorescence-activated Cell Sorting analysis.

Here we present a mechanical dissociation protocol to rapidly isolate macrophages from the dorsal root ganglion for phenotyping and functional analysis.

Schnelle Isolierung von Dorsalwurzel Ganglion Makrophagen

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after ...

Positron Emission Tomography Imaging for In Vivo Measuring of Myelin Content in the Lysolecithin Rat Model of Multiple Sclerosis

Multiple sclerosis (MS) is a neuroinflammatory disease with expanding axonal and neuronal degeneration and demyelination in the central nervous system, leading to motor dysfunctions, psychical disability, and cognitive impairment during MS progression. Positron emission tomography (PET) is an imaging technique able to quantify in vivo cellular and molecular alterations.
Radiotracers with affinity to intact myelin can be used for in vivo imaging of myelin content changes over time. It is possible to detect either an increase or decrease in myelin content, what means this imaging technique can detect demyelination and remyelination processes of the central nervous system. In this protocol we demonstrate how to use PET imaging to detect myelin changes in the lysolecithin rat model, which is a model of focal demyelination lesion (induced by stereotactic injection) (i.e., a model of multiple sclerosis disease). 11C-PIB PET imaging was performed at baseline, and 1 week and 4 weeks after stereotaxic injection of lysolecithin 1% in the right striatum (4 &#181;L) and corpus callosum (3 &#181;L) of the rat brain, allowing quantification of focal demyelination (injection site after 1 week) and the remyelination process (injection site at 4 weeks).
Myelin PET imaging is an interesting tool for monitoring in vivo changes in myelin content which could be useful for monitoring demyelinating disease progression and therapeutic response.

Positron Emission Tomography Imaging for In Vivo Measuring of Myelin Content in the Lysolecithin Rat Model of Multiple Sclerosis

This protocol has the aim of monitoring in vivo myelin changes (demyelination and remyelination) by positron emission tomography (PET) imaging in an animal model of multiple sclerosis.

Positronen-Emissionstomographie-Bildgebung zur In-Vivo-Messung des Myelingehalts im Lysolecithin-Rattenmodell der Multiplen Sklerose

Multiple sclerosis (MS) is a neuroinflammatory disease with expanding axonal and neuronal degeneration and demyelination in the central nervous system, ...