Este protocolo visa obter grandes quantidades de macrófagos não estimulados que foram derivados da medula óssea e nunca foram expostos a fatores teciduais ou citocinas. A principal vantagem dessa técnica é o número de células adquiridas de um único animal. Com o procedimento correto, aproximadamente 2 vezes 10 elevado a 7 macrófagos podem ser obtidos.
Este método pode ajudar pesquisadores de diferentes áreas que estudam macrófagos, como biologia celular, patologia, imunologia e parasitologia, Como as células são sempre suscetíveis à contaminação, ter cuidado com todas as etapas estéreis e usar um gabinete de biossegurança de fluxo laminar são necessários para manter a viabilidade celular. Demonstrando o procedimento estará Izabela Aparecida de Souza. Um estudante de mestrado do nosso laboratório.
Para iniciar o procedimento no camundongo macho C57BL / 6 tipo selvagem de oito semanas de idade, mergulhe o camundongo com solução de etanol a 70%. Usando uma tesoura estéril, faça uma incisão de um centímetro ao longo do abdômen e remova a pele até que o músculo das patas traseiras esteja totalmente exposto. Em seguida, remova cuidadosamente as patas traseiras na altura do quadril sem quebrar o fêmur e a tíbia.
Coloque as patas traseiras intactas em um tubo de centrífuga cônico contendo solução de etanol a 70%. Dentro de um gabinete de biossegurança de fluxo laminar, transfira as pernas isoladas de etanol 70% para PBS estéril. Usando fórceps e lenços desinfetantes, limpe os ossos removendo todos os músculos e fáscias anexados.
Em seguida, use uma lâmina de bisturi cirúrgico estéril para cortar a epífise óssea em ambas as extremidades, expondo a medula óssea. Encha uma seringa de 20 mililitros com 10 mililitros de PBS estéril suplementado com solução de estreptomicina de penicilina a 2% e conecte uma agulha de calibre 26 a ela. Segure o osso usando uma pinça de dissecção anatômica com uma mão.
Use a outra mão para inserir a agulha na cavidade óssea com cuidado, sem esmagar o osso. Em seguida, lave o interior do osso com PBS e colete a medula óssea em um tubo de centrífuga cônico estéril. Depois de lavada, a cavidade óssea deve parecer branca.
Centrifugue as células coletadas a 300G e quatro graus Celsius por 10 minutos. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em um mililitro de meio DMEM/F1210. Homogeneizar a suspensão e adicionar mais nove mililitros do meio para elevar o volume total para 10 mililitros.
Adicione um mililitro da suspensão de células progenitoras em cada uma das 10 placas de Petri de plástico redondas, medindo 100 mililitros por 20 milímetros. Espalhe as células pelas placas com uma pipeta para obter uma distribuição uniforme. Em seguida, adicione nove mililitros de DMEM/F1210 suplementado com 20% de sobrenadante de células L929 a cada placa.
Incube os pratos a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. No terceiro dia, adicione 10 mililitros de meio DMEM/F1210 suplementado com 20% de sobrenadante de células L929 a cada placa. Os 20 mililitros de meio de cultura resultantes em cada placa são suficientes para o crescimento celular até a maturação.
Descarte os sobrenadantes de todos os pratos de cultura. Lave cada placa de cultura com 10 mililitros de PBS estéril sem magnésio e cálcio, pré-aquecido a 37 graus Celsius, e descarte a solução após a lavagem. Adicione três mililitros de solução de dissociação celular não enzimática, pré-aquecida a 37 graus Celsius a cada prato.
Incube por 10 minutos a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Em seguida, use um microscópio invertido para visualizar se os macrófagos se dissociam das placas de cultura de células. Com uma pipeta serológica, lavar a loiça com a solução de dissociação celular não enzimática, realizando repetidamente movimentos circulares para assegurar a dissociação completa dos macrófagos.
Recolher e combinar a solução de todas as placas de cultura num tubo de centrifugação cónico de 50 mililitros. Mais uma vez, adicione 10 mililitros de PBS estéril e pré-aquecido aos pratos de cultura vazios. Centrifugue o tubo cônico contendo a solução coletada combinada a 300G e quatro graus Celsius por 10 minutos.
Rejeitar o sobrenadante e ressuspender o sedimento com um mililitro de DMEM/F1210. Homogeneizar a suspensão lenta e cuidadosamente, pipetando-a para cima e para baixo sem danificar as células. Diluir uma alíquota de 10 microlitros da solução de macrófagos adicionando 10 microlitros de azul de tripano para contar as células usando um hemocitômetro.
No sétimo dia, cada prato produziria aproximadamente 2 milhões de macrófagos. A exposição ao fator estimulador de colônias de macrófagos do sobrenadante L929 transformou gradualmente os progenitores da medula óssea em macrófagos maduros, exibindo morfologia típica espalhada devido às extensões citoplasmáticas. No terceiro dia, alguns macrófagos imaturos apareceram, com uma morfologia típica de forma redonda com poucas projeções de membrana.
Embora tenham se transformado ao longo de todo o processo, foram necessários sete dias para atingir um número e maturidade adequados. Os macrófagos obtidos apresentaram uma população homogênea em termos de tamanho e granularidade na análise por citometria de fluxo. Além disso, 100% da população expressou as moléculas de superfície características F480 e CD11B, formando uma única população bem definida de células.
A capacidade de fagocitose dos macrófagos maduros e bem diferenciados foi confirmada por imagens de microscopia de fluorescência mostrando fagocitos parasitas Leishmania major dentro dos macrófagos. As pernas devem ser retiradas do animal com cuidado, pois é realizado em ambiente não estéril e é a fonte mais importante de contaminação. As pernas não devem ser quebradas fora do gabinete de biossegurança de fluxo laminar.
Os macrófagos derivados da medula óssea obtidos a partir deste protocolo podem ser usados para realizar posteriormente a polarização in vitro de macrófagos para entender a fisiologia dos macrófagos.
