Agradecemos o Dr. Kristen Verhey (Universidade de Michigan, Ann Arbor) e Dr. Gregory Pazour (Universidade de Massachusetts Medical School) para fornecer alguns plasmídeos. O projeto foi apoiado por concessões do National Institutes of Health (NIH GM097037, GM116204 e GM122552 para W.Y.).

1. preparação da pilha NIH-3T3 para microscopia de velocidade do estoque
<ol><li>1,5 semanas antes do experimento, recuperar uma cultura fresca de células NIH-3T3 de um estoque congelado descongelar a 37 ° C e transferindo as células para um balão de cultura de células de2 25 cm com 3 mL de modificado águia de Dulbecco médio (DMEM) suplementado com 110 mg/mL piruvato de sódio, glutamina 2 mM, 10% de soro fetal bovino e 1% penicilina/estreptomicina.</li>
	<li>Incube a 37 ° C numa incubadora 5% CO2 células.</li>
	<li>Dividi células na confluência de 80%, de dois em dois dias, pelo menos três vezes antes do dia experimental para garantir a homogeneidade do ciclo celular. Trypsinize células com tripsina 0,25% por 2 min a 37 ° C, Aspire tripsina e substituí-lo com 2 mL do meio. Pipeta repetidamente a médio e romper a conjuntos de células, remova o número desejado de células e trazer o volume total dos meios de comunicação de volta até 3 mL. Nota: NIH-3T3 foram anteriormente alterado geneticamente para expressar NPHP-4, uma proteína que localiza o TZ26, fundidos no terminal C para mCherry. mCherry é um fluoróforo que pode ser animado com 561 iluminação nm para localizar quantitativamente a barreira de seletividade TZ e orientar os cílios primários.</li>
	<li>Dois dias antes do experimento, placa as células em um fundo de vidro 35mm prato na confluência de 60-70% com 1,5 mL do mesmo meio de como passo 1.1 e retornam as células para a incubadora.</li>
	<li>Um dia antes do experimento, transfect quimicamente as células com o plasmídeo desejado. Misturar 500-1000 ng do plasmídeo desejado (veja a Nota abaixo) na proporção de 1: 2.5 com reagente de transfeccao em 0,25 mL de mídia reduzida soro sem antibióticos durante 30 min. aspirado de mídia de 35 milímetros de vidro prato fundo e substituí-lo com o plasmídeo de 0,25 mL / mistura de reagente de transfeccao mais um extra 1,25 mL de mídia reduzida soro sem antibióticos. Mídia reduzida soro serve ao propósito de facilitar um bem sucedida do transfection, induzindo o crescimento de cílios primário, bem como manter as células viva tempo suficiente para realizar o experimento. Retorno as células para a incubadora para o experimento no dia seguinte. Nota: Ao executar rastreamento único-molécula de IFT20, um plasmídeo que contém que um IFT20 geneticamente modificados fundidas no seu terminal C a GFP é usado25. Ao executar o único-molécula de rastreamento de SSTR3, um plasmídeo que contém um SSTR3 geneticamente modificados fundidas no seu término de N para um domínio de peptídeo (AP) aceitador e C terminal a GFP é usado22. Além de construção de SSTR3, um plasmídeo contendo o ligase biotina BirA deve ser expressa co e os meios de comunicação de transfeccao devem ser suplementados com 10 biotina µM. BirA, em seguida, anexa biotina ao domínio AP de moléculas de AP-SSTR3-GFP recém sintetizados ao nível do PS. Alexa647 conjugada com três dos quatro sites de ligação de biotina na estreptavidina, em média, então podem ser completadas para a mídia antes da imagem latente para etiqueta fluorescente as moléculas de AP-SSTR3-GFP na superfície exterior do celular22,27 . GFP e AlexaFluor647 são utilizados neste método; no entanto, outras sondas fluorescentes podem ser usadas se eles têm da mesma forma, foto-estabilidade elevada e quântica rendimento.</li>
	<li>Se usando a construção de SSTR3 marcado externamente, remover a mídia da parte inferior de vidro prato 1 h antes do experimento, lave a célula 5 vezes com 1 mL de tampão fosfato salino (PBS) e adiciona 1 mL de mídia reduzida soro suplementado com 1 µM Alexa647 conjugados streptavidin.</li>
	<li>Não mais que 15 min antes do experimento, remova a mídia do prato fundo vidro e lavar as células transfectadas e etiquetadas 5 vezes com 1 mL de PBS.</li>
	<li>Coloque 1 mL de tampão de imagem (20 mM HEPES, 110mm KOAc, 5mm NaOAc, 2mm MgOAc, 1mm EGTA, pH 7,3) no prato fundo vidro. Nota: No buffer de imagem, as células são viáveis para não mais do que 3 h. Portanto, apenas a 2 h de experimentos são executadas em cada prato.</li>
</ol>2. microscopia de velocidade
Nota: A configuração de microscopia de velocidade inclui um microscópio de fluorescência invertido equipado com um objectivo apocromático de 1,4-at 100 × óleo-imersão, 35 mW 633 nm He-Ne laser, 50 mW estado sólido 488 nm e 561-nm lasers, um ganho de multiplicação em-microplaqueta câmera acoplado-dispositivo de carga e um pacote de software do microscópio para aquisição de dados e processamento (Figura 1). Para a imagem latente de canal individual, GFP, mCherry e Alexa647 estão animado por 488 nm, 561 nm ou lasers de 633 nm, respectivamente. Para rastreamento de molécula, único ponto de iluminação é usada para controlar as moléculas individuais fluorescente-etiquetadas. Para a imagem latente de epifluorescência, uma lente côncava é colocado no caminho da iluminação de laser para expandir o feixe em um campo uniforme da iluminação. A emissão de fluorescência é coletado pelo mesmo objectivo, filtrado por um filtro dicroico (405/488/561/635) e um filtro de emissão (405/488/561/635) e fotografado com a câmera do CCD acima operando a 500 Hz para rastreamento de molécula ou 2 Hz para imagem de epifluorescência.
<ol><li>Fixe a placa de fundo de vidro para o palco do microscópio e localize uma célula que corretamente expressa as construções desejadas. Uma vez que foi encontrado um celular adequada, alinhe o ponto de NPHP4-mCherry na base dos cílios primários com a localização no plano de imagem que corresponde à iluminação de único ponto do laser.</li>
	<li>Capturar uma imagem de epifluorescência de NPHP4-mCherry e IFT20-GFP ou AP-SSTR3-GFP usando a função de "Snap" na aba "Câmera" da janela "Controles de foco", se usando o pacote de software de microscopia digital (ver Tabela de materiais). Nota: Estas imagens atuará como uma referência para os locais da molécula subsequentes.</li>
	<li>Uma vez que as imagens de referência são obtidas, localmente reduza a concentração de moléculas simples rotuladas. Foto-descora o TZ com 1 iluminação de laser mW por 20 s ou até que a intensidade da fluorescência é próximo de fluorescência de fundo. Nota: Quando a concentração exacta pode ser controlada, 0,1-1 nM rotulado moléculas simples são usados.</li>
	<li>Para preparar para rastreamento de molécula, reduza a potência de iluminação do laser de ~0.15 mW para moléculas simples rotulado com GFP ou ~0.5 mW para moléculas rotulado com Alexa647.</li>
	<li>Assim que a potência do laser e parâmetros de imagem são conjunto, ganho máximo e intensificação e taxa de quadros de 2 ms, para a imagem latente de molécula, envolver-se o laser de iluminação adequada e registrar não-foto, rotulado de moléculas simples como eles são transportados através da região de foto do TZ clicando no botão de "Stream" na aba "Câmera" da janela "Controles de foco". Nota: Não mais de 2 min de vídeo deve ser capturada para minimizar os efeitos da deriva ciliar para um nível insignificante.</li>
	<li>Depois de capturar o vídeo única molécula, processe os vídeos usando um algoritmo de ajuste Gaussian 2D, tais como vislumbre pelo laboratório Gelles, que localiza precisamente do centroide de excitação do cada molécula PSF em uma abrangente área de interesse (AOI).</li>
	<li>Selecione todos os locais da molécula com precisão < 10 nm e corrigir o centro de cílios com base na distribuição da molécula locais equipados com uma função gaussiana 2D. Nota: Usando 2D para o algoritmo de transformação 3D, as rotas de transporte 3D de rotas IFT20-GFP e AP-SSTR3 são claramente mostradas na membrana ciliar ou axonemal ciliar, respectivamente.</li>
</ol>3. 2D para 3D transformação
<ol><li>Uma vez que várias mil localizações para o trânsito de moléculas (sinal-ruído ratio > 11) no cílio são coletadas, selecione eixo longo do cílio como a X-dimensão. Faça um histograma de dimensão Y dos locais e obter as somas bin em incrementos de 10 nm. Nota: A 2D para 3D transformação pode ser avaliada pela mão ou qualquer software ou linguagem de programação. Os autores têm implementado com sucesso a transformação em Matlab e Python 2.7.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+fluorescence+microscopy.">Super-resolution fluorescence microscopy.</a> Annu Rev Biochem. 78, 993-1016 (2009).</li><li>Leung, B. O., Chou, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+super-resolution+fluorescence+microscopy+for+biology.">Review of super-resolution fluorescence microscopy for biology.</a> Appl Spectrosc. 65, 967-980 (2011).</li><li>Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intraflagellar+transport+protein+IFT20+is+associated+with+the+Golgi+complex+and+is+required+for+cilia+assembly.">The intraflagellar transport protein IFT20 is associated with the Golgi complex and is required for cilia assembly.</a> Mol Biol Cell. 17, 3781-3792 (2006).</li><li>Awata, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NPHP4+controls+ciliary+trafficking+of+membrane+proteins+and+large+soluble+proteins+at+the+transition+zone.">NPHP4 controls ciliary trafficking of membrane proteins and large soluble proteins at the transition zone.</a> J Cell Sci. 127, 4714-4727 (2014).</li><li>Howarth, M., Ting, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+proteins+in+live+mammalian+cells+with+biotin+ligase+and+monovalent+streptavidin.">Imaging proteins in live mammalian cells with biotin ligase and monovalent streptavidin.</a> Nat Protoc. 3, 534-545 (2008).</li><li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+super-resolution+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy.">Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy.</a> Science. 319, 810-813 (2008).</li></ol>

Os autores declaram não há conflitos de interesse.

Este protocolo descreve a aplicação da microscopia de velocidade para o cílio primário, uma organela celular de sinalização que é altamente dependente do transporte eficiente de proteínas. Microscopia de velocidade pode fornecer alta resolução locais (< 10 nm) para moléculas fluorescente-etiquetadas como passam através da iluminação de ponto único centralizada sobre o TZ. Anteriormente tiver sido aplicado para estudar a proteína tráfico através do NPC6,<sup class="xref...

Como afirmado por Ernst Abbe em 1873, a resolução da microscopia de luz convencional foi crida para ser limitada a aproximadamente 200 nm devido à difração de luz do objectivo1,2. Atualmente, as técnicas de microscopia de luz de super-resolução quebrar essa limitação e permitam a captura de imagens dinâmicas, com resolução de difração sub (< 200 nm). As técnicas geralmente caem em duas categorias amplas: estimulada abordagens de microscopia com base de depleção (STED) emissão, que geram o volume de iluminação sub difração devido à resposta óptica não-linear de fluorophores em amostras3; e (palma), microscopia de luz fotoativo e microscopia de reconstrução óptica estocástico (Tempestade)-com base em técnicas de super-resolução, que utilizam funções matemáticas para localizar os centroides de fluorophores e então reconstituir essas centroides para formar imagens de super-resolução4,5. Atualmente, devido a configuração óptica relativamente uncomplicated, PALM e tempestade são extensivamente empregados ativando apenas um pequeno subconjunto de fluorophores em cada quadro de um vídeo longo de uma preparação biológica. Isto permite a localização mais exata por 2D montagem Gaussian da mancha fluorescente, denominado a função de ponto de espalhar (PSF), das proteínas fluorescente-etiquetadas em cada quadro do vídeo. A localização 2D de cada molécula fluorescente-etiquetadas então pode ser sobreposta a um único avião de imagens para produzir uma imagem de super-resolução da preparação biológica1,2. Enquanto estes localização único-molécula, abordagens de super-resolução para microscopia certamente revolucionaram como imagem latente de amostras biológicas foi executada, ainda existem desafios a serem vencidos. Por exemplo, tempestade e PALM podem alcançar seus melhores resoluções espaciais após a fixação de amostras biológicas e, portanto, apresentar uma representação estática das proteínas fluorescente-etiquetadas, que é uma limitação similar de microscopia eletrônica. Além disso, para atingir a alta resolução espacial para cada proteína fluorescente-etiquetadas em células vivas, amostras devem ser fotografadas no framerates há muito tempo que são incapazes de capturar a dinâmica da proteína. Portanto, é necessário superar estes obstáculos técnicos principais.
Para obter uma alta resolução spatiotemporal que é adequada para a detecção de proteínas ou RNAs de movimento rápido em células vivas, nós desenvolvemos microscopia de super-resolução velocidade em nosso laboratório (Figura 1)6,7, 8. vários grandes avanços técnicos na microscopia de velocidade anteriormente permitiram-nos controlar com sucesso nucleocytoplasmic transporte de pequenas moléculas, proteínas, mRNA e vírus através de nativo nuclear pore complexos (NPCs)6, 7 , 8. resumidamente, os seguintes recursos da microscopia de velocidade serão usados para rastrear velozes macromoléculas através das estruturas simétrica e rotacionalmente sub-micrônicas em células vivas, tais como NPCs e cílios primários: (1) um inclinado ou uma iluminação vertical PSF permite a excitação de moléculas simples dentro de um volume pequeno de difração-limite no plano focal (Figura 1); (2), o PSF inclinado pode evitar muito fora de foco da fluorescência e, assim, melhorar a relação sinal-ruído. (3), a densidade óptica de 100-500 kW / cm2 no PSF iluminação permite que milhares de fótons para ser coletado de único fluorophores com velocidades de deteção rápida (> 500 Hz). Velocidade de deteção (4), o jejum também reduz o erro de localização espacial único-molécula (< 10 nm) ao determinar as trajetórias espaciais de mover moléculas fluorescentes em células vivas, porque a difusão molecular é um dos principais fatores fazendo com que as imperfeições da único-molécula de localização para a movimentação de moléculas. Algoritmos de transformação (5) bem estabelecidas 2D para 3D permitem-nos fornecer a densidade de probabilidade espacial 3D mapas de rotas de transporte para moléculas no NPC ou o cílio primário. Vale ressaltar que nosso processo de conversão entre o cartesiano e o sistema de coordenação cilíndrico é usado para gerar uma densidade de probabilidade espacial 3D mapa ao invés de 3D único-molécula rastreamento (Figura 2). Anteriormente, os dados de microscopia eletrônica revelaram que o NPC9,10 e o cílio primário11 ambos têm uma estrutura simétrica e rotacionalmente. Em princípio, aleatoriamente, difundir moléculas movendo-se através do NPC ou cílio primário também deve ter distribuições simétricas e rotacionalmente. Como mostrado na Figura 2, um número elevado de difusão aleatoriamente as moléculas no interior do cilindro geraria distribuições simétricas e rotacionalmente com a vista de seção transversal como que em NPC, ainda mais, resultando em um aproximadamente uniforme espacial distribuição dentro de cada sub-região muito pequena entre dois anéis vizinhos(Figura 2). Esta distribuição uniforme leva a que a distribuição espacial ao longo da dimensão θ no sistema cilíndrico é constante. Então as coordenadas 3D (X, R, θ) podem ser simplificadas para ser as coordenadas 2D (R, X, constante). Na verdade, nosso processo de conversão entre os cartesianos e os sistemas cilíndricos é de 2D (X, Y) a 2D (R, X, constante). A constante θ, refere-se a densidade espacial p na Figura 2,E, é calculada utilizando a equação A<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56475/56475eq1.jpg">.
Em última análise, rastreamento único-molécula tem ampla aplicação em pesquisa biológica, portanto, é natural que uma infinidade de técnicas será desenvolvida para preencher nichos biológicos específicos12,13,14. Tal é o caso com microscopia de velocidade. Anteriormente, quando combinada com um algoritmo de transformação 3D, esta técnica foi desenvolvida para resolver as rotas de transporte 3D de trânsito moléculas através os NPCs, uma estrutura biológica rotacionalmente simétrica e diffraction subtamanho6. Neste trabalho, cílios primários são mostrados para ser organelas excelente modelo também. Cílios primários são organelas cilíndricas, como antena (raio de ~ 125 nm) que o projeto da superfície dos mamíferos mais células15,16,17. Eles são responsáveis por receber os sinais externos e transmitir uma resposta intracelular, geralmente associada com crescimento e metabolismo de15,16. Portanto, fluxo de proteínas estruturais, reciclagem de receptores transmembranares e transmissão dos mensageiros intracelulares são responsabilidades vitais dos cílios primários. Na junção entre os cílios primários e o corpo da célula é uma barreira de seletividade crítica, chamada de zona de transição ou TZ, através do qual todo o transporte desta proteína deve ocorrer11,18,19, 20. Além da função associada do TZ, pelo menos, dois processos de transporte, do transporte e difusão passiva, são pensados para ser responsável pelo movimento da proteína através desta região16,21, 22. do ponto de vista da saúde humana, a perda de cílios primários e desregulamentação subsequente de sinalização a jusante são característica de muitos cancros. Além disso, muitas doenças genéticas, como síndrome de Bardet-Biedl e doença renal policística, estão associadas a proteína defeituosa transporte23. Tanto o tamanho do limite de difração sub e o complexo processo de transporte seletivo de proteína através do TZ fazem os cílios primários um alvo principal para esta técnica. Neste trabalho de métodos, demonstraremos o rastreamento de uma proteína transmembrana ciliar, receptor de somatostatina 3 (SSTR3)24, rotulado externamente com Alexa Fluor 647 e um componente do IFT, IFT2025, rotulado com uma molécula GFP fundida.

<table><tbody><tr><td>25 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; tissue culture dish</td><td>Corning</td><td>VV-01936-00</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/streptomycin</td><td>ThermoFisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>ThermoFisher</td><td>10438018</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>10566-016</td><td></td></tr><tr><td>OPTIMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>ThermoFisher</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3813-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>Transit LT1</td><td>Mirus</td><td>MIR 2300</td><td></td></tr><tr><td>35 mm glass bottom dish</td><td>MatTek</td><td>P35GCOL-0-14-C</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 647-conjugated streptavidin</td><td>ThermoFisher</td><td>S21374</td><td></td></tr><tr><td>Biotin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4501-100MG</td><td></td></tr><tr><td>633 nm He-Ne laser</td><td>Melles Griot</td><td>25-LHP-928-249</td><td></td></tr><tr><td>561 nm solid state laser</td><td>Coherent</td><td>OBIS 561-50 LS</td><td></td></tr><tr><td>488 nm solid state laser</td><td>Coherent</td><td>1185053</td><td></td></tr><tr><td>Inverted fluorescence microscope</td><td>Olympus</td><td>IX81</td><td></td></tr><tr><td>1.4-NA 100&amp;times; oil-immersion apochromatic objective</td><td>Olympus</td><td>UPLSAPO 100&amp;times;</td><td></td></tr><tr><td>On-chip multiplication gain charge-coupled-device camera</td><td>Roper Scientific</td><td>Cascade 128+</td><td></td></tr><tr><td>Dichroic filter</td><td>Semrock</td><td>Di01- R405/488/561/635-25x36</td><td></td></tr><tr><td>Emission filter</td><td>Semrock</td><td>NF01-405/488/561/635-25X5.0</td><td></td></tr><tr><td>Slidebook 6.0</td><td>Intelligent Imaging Innovations</td><td></td><td>digital microscopy software</td></tr></tbody></table>

application of high-speed super-resolution speed microscopy in live primary cilium

O cílio primário é uma protrusão do microtubule-baseado na superfície de muitas células eucarióticas e contém um único complemento de proteínas que funcionam criticamente em motilidade celular e sinalização. Desde que cílios são incapazes de sintetizar suas próprias proteínas, cerca de 200 proteínas ciliares originais precisam ser traficadas entre o citosol e cílios primários. No entanto, ainda é um desafio técnico para mapear tridimensional (3D) locais, das vias de transporte para estas proteínas em cílios primários ao vivo devido às limitações do atualmente existente técnicas. Para conquistar o desafio, recentemente desenvolvemos e empregou uma microscopia 3D de alta velocidade virtual Super-resolução, denominada microscopia difração sub (velocidade) de single-point da borda-excitação, para determinar a localização espacial 3D das vias de transporte para ambos citosólico e proteínas de membrana em cílios primários de células vivas. Neste artigo, vamos demonstrar a configuração detalhada da microscopia de velocidade, a preparação de celulas que expressam proteínas ciliares fluorescência-proteína-labeled, o acompanhamento em tempo real do único-molécula de proteínas individuais no cílio ao vivo e a realização de densidade de probabilidade espacial 3D mapas de rotas de transporte para proteínas ciliares.

Esta seção demonstra os dados obtidos da realização de microscopia de velocidade para o TZ de cílios primários para estudar a rota de transporte de SSTR3 ligado por um vinculador externo de nm ~ 15 de Alexa647(Figura 3). Serve o duplo objectivo de verificar o algoritmo de transformação 3D. Alexa647 deve apenas rótulo a superfície externa do cílio primário e, portanto, a rota de transporte 3D deve revelar uma rota de transporte de ...

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Application of High-speed Super-resolution SPEED Microscopy in Live Primary Cilium

Recentemente nós mapeamos locais espaciais tridimensionais (3D) de rotas de transporte para várias proteínas se dentro cílios primários em células vivas. Aqui este detalhes de papel a instalação experimental, o processo de amostras biológicas e as análises de dados para a fluorescência de super-resolução 3D imagem abordagem recém aplicadas em viver cílios primários.

Aplicação da microscopia de velocidade de alta velocidade super-resolução no cílio primário ao vivo

The primary cilium is a microtubule-based protrusion on the surface of many eukaryotic cells and contains a unique complement of proteins that function ...

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8.2K visualizações.  Temple University. Recentemente nós mapeamos locais espaciais tridimensionais (3D) de rotas de transporte para várias proteínas se dentro cílios primários em células vivas. Aqui este detalhes de papel a instalação experimental, o processo de amostras biológicas e as análises de dados para a fluorescência de super-resolução 3D imagem abordagem recém aplicadas em viver cílios primários.

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2D and 3D Human Induced Pluripotent Stem Cell-Based Models to Dissect Primary Cilium Involvement during Neocortical Development

Primary cilia (PC) are non-motile dynamic microtubule-based organelles that protrude from the surface of most mammalian cells. They emerge from the older centriole during the G1/G0 phase of the cell cycle, while they disassemble as the cells re-enter the cell cycle at the G2/M phase boundary. They function as signal hubs, by detecting and transducing extracellular signals crucial for many cell processes. Similar to most cell types, all neocortical neural stem and progenitor cells (NSPCs) have been shown harboring a PC allowing them to sense and transduce specific signals required for the normal cerebral cortical development. Here, we provide detailed protocols to generate and characterize two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) cell-based models from human induced pluripotent stem cells (hIPSCs) to further dissect the involvement of PC during neocortical development. In particular, we present protocols to study the PC biogenesis and function in 2D neural rosette-derived NSPCs including the transduction of the Sonic Hedgehog (SHH) pathway. To take advantage of the three-dimensional (3D) organization of cerebral organoids, we describe a simple method for 3D imaging of in toto immunostained cerebral organoids. After optical clearing, rapid acquisition of entire organoids allows detection of both centrosomes and PC on neocortical progenitors and neurons of the whole organoid. Finally, we detail the procedure for immunostaining and clearing of thick free-floating organoid sections preserving a significant degree of 3D spatial information and allowing for the high-resolution acquisition required for the detailed qualitative and quantitative analysis of PC biogenesis and function.

We present detailed protocols for the generation and characterization of 2D and 3D human induced pluripotent stem cell (hIPSC)-based models of neocortical development as well as complementary methodologies enabling qualitative and quantitative analysis of primary cilium (PC) biogenesis and function.

Modelos pluripotentes 2D e 3D induzidos por humanos para dissecar o envolvimento do círio primário durante o desenvolvimento neocortical

Primary cilia (PC) are non-motile dynamic microtubule-based organelles that protrude from the surface of most mammalian cells. They emerge from the older ...

Biologia do Desenvolvimento

Observation of the Ciliary Movement of Choroid Plexus Epithelial Cells Ex Vivo

The choroid plexus is located in the ventricular wall of the brain, the main function of which is believed to be production of cerebrospinal fluid. Choroid plexus epithelial cells (CPECs) covering the surface of choroid plexus tissue harbor multiple unique cilia, but most of the functions of these cilia remain to be investigated. To uncover the function of CPEC cilia with particular reference to their motility, an ex vivo observation system was developed to monitor ciliary motility during embryonic, perinatal and postnatal periods. The choroid plexus was dissected out of the brain ventricle and observed under a video-enhanced contrast microscope equipped with differential interference contrast optics. Under this condition, a simple and quantitative method was developed to analyze the motile profiles of CPEC cilia for several hours ex vivo. Next, the morphological changes of cilia during development were observed by scanning electron microscopy to elucidate the relationship between the morphological maturity of cilia and motility. Interestingly, this method could delineate changes in the number and length of cilia, which peaked at postnatal day (P) 2, while the beating frequency reached a maximum at P10, followed by abrupt cessation at P14. These techniques will enable elucidation of the functions of cilia in various tissues. While related techniques have been published in a previous report1, the current study focuses on detailed techniques to observe the motility and morphology of CPEC cilia ex vivo.

Observation of the Ciliary Movement of Choroid Plexus Epithelial Cells Ex Vivo

In this study, a detailed light microscopic technique was optimized for real-time observation and analysis of the motion of CPEC cilia ex vivo together with an electron microscopic method for ultrastructural analysis.

Observação do movimento ciliar de células epiteliais do plexo coróide<em&gt; Ex Vivo</em

The choroid plexus is located in the ventricular wall of the brain, the main function of which is believed to be production of cerebrospinal fluid. ...

Neurociência

Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis

The basement membrane (BM) - a specialized sheet of extracellular matrix present at the basal side of epithelial cells - is critical for the establishment and maintenance of epithelial tissue morphology and organ morphogenesis. Moreover, the BM is essential for tissue modeling, serving as a signaling platform, and providing external forces to shape tissues and organs. Despite the many important roles that the BM plays during normal development and pathological conditions, the biological pathways controlling the intracellular trafficking of BM-containing vesicles and how basal secretion leads to the polarized deposition of BM proteins are poorly understood. The follicular epithelium of the Drosophila ovary is an excellent model system to study the basal deposition of BM membrane proteins, as it produces and secretes all major components of the BM. Confocal and super-resolution imaging combined with image processing in fixed tissues allows for the identification and characterization of cellular factors specifically involved in the intracellular trafficking and deposition of BM proteins. This article presents a detailed protocol for staining and imaging BM-containing vesicles and deposited BM using endogenously tagged proteins in the follicular epithelium of the Drosophila ovary. This protocol can be applied to address both qualitative and quantitative questions and it was developed to accommodate high-throughput screening, allowing for the rapid and efficient identification of factors involved in the polarized intracellular trafficking and secretion of vesicles during epithelial tissue development.

Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis

The basement membrane is essential for tissue and organ morphogenesis during development. To better understand the mechanisms leading to proper placement of this structure, the protocol presented describes methods to visualize and characterize the intracellular trafficking and secretion of basement membrane proteins in epithelial cells using confocal and super-resolution microscopy.

Imagem confocal e super-resolução de tráfico intracelular polarizado e secreção de proteínas de membrana de porão durante Drosophila Oogenesis

The basement membrane (BM) - a specialized sheet of extracellular matrix present at the basal side of epithelial cells - is critical for the establishment ...

Ex vivo Method for High Resolution Imaging of Cilia Motility in Rodent Airway Epithelia

An ex vivo technique for imaging mouse airway epithelia for quantitative analysis of motile cilia function important for insight into mucociliary clearance function has been established. Freshly harvested mouse trachea is cut longitudinally through the trachealis muscle and mounted in a shallow walled chamber on a glass-bottomed dish. The trachea sample is positioned along its long axis to take advantage of the trachealis muscle to curl longitudinally. This allows imaging of ciliary motion in the profile view along the entire tracheal length. Videos at 200 frames/sec are obtained using differential interference contrast microscopy and a high speed digital camera to allow quantitative analysis of cilia beat frequency and ciliary waveform. With the addition of fluorescent beads during imaging, cilia generated fluid flow also can be determined. The protocol time spans approximately 30 min, with 5 min for chamber preparation, 5-10 min for sample mounting, and 10-15 min for videomicroscopy.

Ex vivo Method for High Resolution Imaging of Cilia Motility in Rodent Airway Epithelia

An easy and reliable technique for visualizing and quantifying airway cilia motility and cilia generated flow using mouse trachea is described. This technique can be modified to determine how a wide range of factors influence cilia motility, including pharmacological agents, genetic factors, environmental exposures, and/or mechanical factors such as mucus load.

O método ex vivo para High Resolution Imaging de Motilidade Cilia em Rodent Airway Epithelia

An ex vivo technique for imaging mouse airway epithelia for quantitative  analysis of motile cilia function important for insight into mucociliary  ...

Biologia

Super-Resolution Imaging to Study Co-Localization of Proteins and Synaptic Markers in Primary Neurons

Synapses are the functional elements of neurons and their defects or losses are at the basis of several neurodegenerative and neurological disorders. Imaging studies are widely used to investigate their function and plasticity in physiological and pathological conditions. Because of their size and structure, localization studies of proteins require high-resolution imaging techniques. In this protocol, we describe a procedure to study in primary neurons the co-localization of target proteins with synaptic markers at a super-resolution level using structured illumination microscopy (SIM). SIM is a patterned-light illumination technique that doubles the spatial resolution of wide-field microscopy, reaching a detail of around 100 nm. The protocol indicates the required controls and settings for robust co-localization studies and an overview of the statistical methods to analyze the imaging data properly.

This protocol shows how to employ super-resolution microscopy to study protein co-localization in primary neuronal cultures.

Imagem de super-resolução para estudar co-localização de proteínas e marcadores sinápticos em neurônios primários

Synapses are the functional elements of neurons and their defects or losses are at the basis of several neurodegenerative and neurological disorders. ...

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy (f3D-SIM)

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the diffraction of light allowing super-resolution of live samples. There are currently three main types of super-resolution techniques &#8211; stimulated emission depletion (STED), single-molecule localization microscopy (including techniques such as PALM, STORM, and GDSIM), and structured illumination microscopy (SIM). While STED and single-molecule localization techniques show the largest increases in resolution, they have been slower to offer increased speeds of image acquisition. Three-dimensional SIM (3D-SIM) is a wide-field fluorescence microscopy technique that offers a number of advantages over both single-molecule localization and STED. Resolution is improved, with typical lateral and axial resolutions of 110 and 280 nm, respectively and depth of sampling of up to 30 &#181;m from the coverslip, allowing for imaging of whole cells. Recent advancements (fast 3D-SIM) in the technology increasing the capture rate of raw images allows for fast capture of biological processes occurring in seconds, while significantly reducing photo-toxicity and photobleaching. Here we describe the use of one such method to image bacterial cells harboring the fluorescently-labelled cytokinetic FtsZ protein to show how cells are analyzed and the type of unique information that this technique can provide.

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy f3D-SIM

Spatiotemporal information about dynamic proteins inside live cells is crucial for understanding biology. A type of super-resolution microscopy called fast 3D-structured illumination microscopy (f3D-SIM) reveals unique information about the cytokinetic Z ring in bacteria: both its bead-like appearance and the rapid dynamics of FtsZ within the ring.

Super-resolution Imaging do Z Anel Cytokinetic em bactérias vivas Usando o Fast-estruturados 3D Iluminação Microscopy (F3D-SIM)

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the ...

Efficient and Cost Effective Electroporation Method to Study Primary Cilium-Dependent Signaling Pathways in the Granule Cell Precursor

The primary cilium is a critical signaling organelle found on nearly every cell that transduces Hedgehog (Hh) signaling stimuli from the cell surface. In the granule cell precursor (GCP), the primary cilium acts as a pivotal signaling center that orchestrates precursor cell proliferation by modulating the Hh signaling pathway. The investigation of primary cilium-dependent Hh signaling machinery is facilitated by in vitro genetic manipulation of the pathway components to visualize their dynamic localization to the primary cilium. However, transfection of transgenes in the primary cultures of GCPs using the currently known electroporation methods is generally costly and often results in low cell viability and undesirable transfection efficiency. This paper introduces an efficient, cost-effective, and simple electroporation protocol that demonstrates a high transfection efficiency of ~80-90% and optimal cell viability. This is a simple, reproducible, and efficient genetic modification method that is applicable to the study of the primary cilium-dependent Hedgehog signaling pathway in primary GCP cultures.

Here, we present a reproducible in vitro electroporation protocol for genetic manipulation of primary cerebellar granule cell precursors (GCPs) that is cost-effective, efficient, and viable. Moreover, this protocol also demonstrates a straightforward method for the molecular study of primary cilium-dependent Hedgehog signaling pathways in primary GCP cells.

Método de eletroporação eficiente e econômico para estudar vias de sinalização dependentes de cítio primário no precursor da célula de grânulo

The primary cilium is a critical signaling organelle found on nearly every cell that transduces Hedgehog (Hh) signaling stimuli from the cell surface. In ...

Simple Detection of Primary Cilia by Immunofluorescence

Primary cilia are dynamically regulated during cell cycle progression, specifically during the G0/G1 phases of the cell cycle, being resorbed prior to mitosis. Primary cilia can be visualized with highly sophisticated methods, including transmission electron microscopy, 3D imaging, or using software for the automatic detection of primary cilia. However, immunofluorescent staining of primary cilia is needed to perform these methods. This publication describes a protocol for the easy detection of primary cilia in vitro by staining acetylated alpha tubulin (axoneme) and gamma tubulin (basal body). This immunofluorescent staining protocol is relatively simple and results in high-quality images. The present protocol describes how four cell lines (C2C12, MEF, NHLF, and skin fibroblasts) expressing primary cilia were fixed, immunostained, and imaged with a fluorescent or confocal microscope.

Primary cilia are extracellular structures associated with the centriole. Primary cilia detection by immunofluorescent staining is a relatively simple procedure that results in extremely high-quality images. In this protocol, fibroblasts expressing primary cilia were fixed, immunostained, and imaged in a fluorescent or confocal microscope.

Detecção Simples de Cília Primária por Imunofluorescência

Primary cilia are dynamically regulated during cell cycle progression, specifically during the G0/G1 phases of the cell cycle, being resorbed prior to ...

Super-Resolution Live Cell Imaging of Subcellular Structures

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally been restricted to be used only on fixed samples or live cells outside of tissue labeled with strong fluorescent signal. Current super-resolution live cell imaging techniques require the use of special fluorescence probes, high illumination, multiple image acquisitions with post-acquisition processing, or often a combination of these processes. These prerequisites significantly limit the biological samples and contexts that this technique can be applied to.
Here we describe a method to perform super-resolution (~140 nm XY-resolution) time-lapse fluorescence live cell imaging in situ. This technique is also compatible with low fluorescent intensity, for example, EGFP or mCherry endogenously tagged at lowly expressed genes. As a proof-of-principle, we have used this method to visualize multiple subcellular structures in the Drosophila testis. During tissue preparation, both the cellular structure and tissue morphology are maintained within the dissected testis. Here, we use this technique to image microtubule dynamics, the interactions between microtubules and the nuclear membrane, as well as the attachment of microtubules to centromeres.
This technique requires special procedures in sample preparation, sample mounting and immobilizing of specimens. Additionally, the specimens must be maintained for several hours after dissection without compromising cellular function and activity. While we have optimized the conditions for live super-resolution imaging specifically in Drosophila male germline stem cells (GSCs) and progenitor germ cells in dissected testis tissue, this technique is broadly applicable to a variety of different cell types. The ability to observe cells under their physiological conditions without sacrificing either spatial or temporal resolution will serve as an invaluable tool to researchers seeking to address crucial questions in cell biology.

Presented here is a protocol for super-resolution live-cell imaging in intact tissue. We have standardized the conditions for imaging a highly sensitive adult stem cell population in its native tissue environment. This technique involves balancing temporal and spatial resolution to allow for the direct observation of biological phenomena in live tissue.

Imagem celular ao vivo super-resolução de estruturas subcelulares

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally ...

Super-Resolution Microscopy of the Synaptonemal Complex Within the Caenorhabditis elegans Germline

During meiosis, homologous chromosomes must recognize and adhere to one another to allow for their correct segregation. One of the key events that secures the interaction of homologous chromosomes is the assembly of the synaptonemal complex (SC) in meiotic prophase I. Even though there is little sequence homology between protein components within the SC among different species, the general structure of the SC has been highly conserved during evolution. In electron micrographs, the SC appears as a tripartite, ladder-like structure composed of lateral elements or axes, transverse filaments, and a central element. 
However, precisely identifying the localization of individual components within the complex by electron microscopy to determine the molecular structure of the SC remains challenging. By contrast, fluorescence microscopy allows for the identification of individual protein components within the complex. However, since the SC is only ~100 nm wide, its substructure cannot be resolved by diffraction-limited conventional fluorescence microscopy. Thus, determining the molecular architecture of the SC requires super-resolution light microscopy techniques such as structured illumination microscopy (SIM), stimulated-emission depletion (STED) microscopy, or single-molecule localization microscopy (SMLM). 
To maintain the structure and interactions of individual components within the SC, it is important to observe the complex in an environment that is close to its native environment in the germ cells. Therefore, we demonstrate an immunohistochemistry and imaging protocol that enables the study of the substructure of the SC in intact, extruded Caenorhabditis elegans germline tissue with SMLM and STED microscopy. Directly fixing the tissue to the coverslip reduces the movement of the samples during imaging and minimizes aberrations in the sample to achieve the high resolution necessary to visualize the substructure of the SC in its biological context.

Super-Resolution Microscopy of the Synaptonemal Complex Within the Caenorhabditis elegans Germline

Super-resolution microscopy can provide a detailed insight into the organization of components within the synaptonemal complex in meiosis. Here, we demonstrate a protocol to resolve individual proteins of the Caenorhabditis elegans synaptonemal complex.

Microscopia de super-resolução do complexo sinaptonemal dentro da linha germinal de Caenorhabditis elegans

During meiosis, homologous chromosomes must recognize and adhere to one another to allow for their correct segregation. One of the key events that secures ...