Name: electrophysiological assessment of murine atria with high-resolution optical mapping
Uploaded: 2018-02-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
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Este trabalho é apoiado pelo programa para melhoria do ambiente de pesquisa para jovens investigadores de fundos especiais de coordenação para promover a ciência e tecnologia (SCF) (para T.S.), Grants-in-Aid para investigação científica (n. º 16K 09494, T.S., n. º 26293052, a T.F.) do Ministério da educação, cultura, esportes, ciência e tecnologia (MEXT) do Japão. Agradecemos a Brainvision e Mr. Kenji Tsubokura pela assistência técnica, e também agradecemos Sr. John Martin por sua assistência linguística.

Este experimento animal foi aprovado e realizado nos termos do Regulamento do cuidado institucional do Animal e uso Comitê de Tóquio médica e Dental University.
1. preparação
<ol><li>Soluções conservadas em estoque<ol>
<li>Dissolver os corantes sensíveis à voltagem (di-4-ANEPPS e RH237) e o indicador de Ca2 + (Rhod-2 m) com 100% de Dimetilsulfóxido (DMSO) tornar as soluções com concentrações de 6 mM, 10 mM e 10 mM, respectivamente.</li>
		<li>Dissolva o desacoplador de excitação-contração (E-C), blebbistatin, com 90% DMSO tornar-se uma solução estoque de 50 mM.</li>
		<li>Alíquota as soluções estoque em um 0,2 mL do PCR do tubo em um quarto escuro, em substituir o ar no tubo de estoque usando gás nitrogênio para evitar a oxidação.</li>
		<li>Embrulhe os tubos de ações em papel alumínio individualmente para proteção contra a luz e armazená-los no-20 ˚ c.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Soluções de trabalho<ol>
<li>Preparar 1 L de solução salina tamponada fosfato (PBS) sem Ca2 + (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8,0 mM Na2HPO4e 1,5 mM KH2PO4, pH 7,40 ajustado pelo NaOH)</li>
		<li>Prepare 1 L de solução de Tyrode (135 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 1.8 mM CaCl2, 0,53 mM MgCl2, 0,33 mM NaH2PO4, 5,5 mM D-glicose e 5,0 mM HEPES, pH 7,40 ajustado pelo NaOH).</li>
		<li>Filtrar a solução de Tyrode com uma garrafa de 0,22 µm filtro superior e ventile-o bem por aeração bolha usando uma pedra de ar ligada a um cilindro de gás de2 O.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. óptico mapeamento em corações de Langendorff-perfundidos
<ol><li>Montar o sistema óptico de mapeamento usando duas câmeras de complementares de óxido metálico semicondutor (CMOS) (Figura 1ae b)<ol>
<li>Monte as câmeras CMOS, divisor de feixe, lentes objetivas, revólver de lente, fonte de luz, espelhos dicroicos, filtros e outras peças para o sistema de mapeamento óptico como mostrado na Figura 1a& b.</li>
		<li>Selecione a ampliação, alterando a lente objetiva em uma torre, equipada com diferentes ampliações (1.6 X e 5. X). Nota: O tamanho do sensor CMOS é 10 mm × 10 mm, com uma resolução de 100 × 100, o que significa que, com 5 X da lente objetiva, este sistema fornece uma resolução espacial de 20 µm.</li>
		<li>Definir a luz de excitação usando uma lâmpada do diodo emissor de luz (LED) com comprimento de onda de centro de 530 nm, passada por um filtro passa-banda (520/35 nm) e reflecte-se com um espelho dicroico (560 nm).</li>
		<li>Gravar o sinal de emissão dividido por um divisor (665 nm), no qual câmera de configuração 1 com um longo passe filtro (697/75 nm) detecta a fluorescência usando um corante de sensíveis à tensão de membrana (di 4-ANEPPS ou RH237) e câmera de 2 com um filtro passa-banda (572/28 nm) detecta a sinal do indicador de Ca2 + (Rhod2-AM).</li>
	</ol></li>
	<li>Montar o circuito de perfusão de Langendorff<ol>
<li>Anexe tubos de policloreto de vinila (PVC) para uma bomba peristáltica.</li>
		<li>Coloque o lado de entrada do tubo PVC em solução de Tyrode ventilada com 100% O2 como mencionado na etapa 1.2.3.</li>
		<li>Conecte o lado de descarga do tubo PVC para uma armadilha de ar feitos à mão, em seguida, organizar a 5 µm filtro, torneiras de três vias, transdutor de pressão, aquecimento bobina de vidro e 21 embotada agulha (o tamanho de agulha é mutável de acordo com o tamanho da aorta) sequencialmente , usando outros tubos de PVC.</li>
		<li>Encher o circuito de perfusão com solução de Tyrode, evitando quaisquer bolhas de ar no circuito e parar o fluxo até que o coração está ligado ao circuito.</li>
	</ol></li>
	<li>Heparinização e anestesia<ol>
<li>Injete heparina unfractionated (200 IU, independentemente do peso de corpo) intraperitonealmente em um mouse usando uma agulha de calibre 25 e seringa de 1 mL.</li>
		<li>Anestesia o mouse por uma injeção intraperitoneal de pentobarbital (65mg/kg) 10 min após a injeção de heparina.</li>
	</ol></li>
	<li>Canulação e perfusão<ol>
<li>Posicione o mouse na posição supina. Confirme animais é anestesiados pela falta de resposta aos pés pitada. Abra a parede abdominal abaixo do nível do processo xifoide com uma tesoura. Fazer uma incisão transversa no diafragma, corte ambos os lados das costelas na linha axilar medial, sem nenhum dano ao coração e a parede torácica anterior da aleta para cima. Avançar a pinça curva atrás do coração e mantenha a aorta descendente, esôfago e veia cava inferior. Em seguida, impostos especiais de consumo o coração com uma tesoura rapidamente, juntamente com os vasos sanguíneos e tecidos, tais como a aorta, pulmões, traqueia, esôfago, tecidos adiposo e Timo.</li>
		<li>Lave o coração com 10 mL de PBS gelado em um prato de petri e remover o tecido adjacente.</li>
		<li>Introduzir a ponta da agulha calibre 21 embotada ligada ao circuito de perfusão em aorta ascendente e corrigi-lo com segmento sob um estereomicroscópio.</li>
		<li>Começa a perfundir o coração por 10 min com solução de Tyrode ventilada com 100% O2.</li>
		<li>Monitore continuamente a pressão de perfusão com transdutor de pressão conectado ao amplificador e registrador.</li>
		<li>Manter a pressão de perfusão entre 80-100 mmHg (geralmente correspondente a 2-5 mL/min para a taxa de fluxo) durante todas as etapas a seguir.</li>
		<li>Durante a perfusão inicial (etapa 2.4.4.), insira o tubo fino de polietileno (PE) (diâmetro exterior: 0,8 mm) para o SVC e corrigi-lo com um fio. Em seguida, coloque o coração na câmara de vidro aquecido (Figura 1b& c).</li>
		<li>Perfurar com uma agulha permanência 24 (diâmetro exterior: 0,7 mm) para a cavidade ventricular esquerda de (LV) através do ápice ventricular para evitar danos à aurícula e remova a agulha interna deixando a cânula externa na LV.</li>
		<li>Introduzir um cateter de eletrodo 1-francês tamanho personalizado feito através do tubo de PE no SVC para realizar a estimulação elétrica no RA. Se necessário, avance o cateter no ventrículo direito (RV) para estimulação ventricular.</li>
		<li>Insira um eletrodo de pin no ápice ventricular para gravar continuamente as bipolares eletrocardiogramas (ECG) entre a agulha de pino eletrodo e canulação da aorta ascendente (Figura 1C).</li>
		<li>Continue a acompanhar o ECG e perfusão pressão ao longo do estudo inteiro.</li>
		<li>Apague a luz e realizar o seguinte experimento em um quarto escuro.</li>
		<li>Vá para a etapa 2.5. para uma única gravação da tensão de membrana ou 2.6. para uma gravação dual da voltagem da membrana e transientes de Ca2 + .</li>
	</ol></li>
	<li>Coloração para uma única gravação da tensão da membrana<ol>
<li>Manter a solução de perfusão aquecida a 37 ˚ c durante este protocolo de coloração para uma única gravação da tensão da membrana.</li>
		<li>Dilua a 8,3 µ l da solução-mãe di-4-ANEPPS (6 mM) com 10 mL de solução de Tyrode (a concentração final é de 5 µM).</li>
		<li>Infundi o volume total (10 mL) da solução diluída di-4-ANEPPS no coração através da rota de perfusão para 2-5 min, seguido por uma lavagem com solução de Tyrode por 5 min.</li>
		<li>Dilua 5 µ l de solução-mãe blebbistatin (50mm) com 1mL de solução de Tyrode (a concentração final é 250 µM).</li>
		<li>Administre o montante total da solução diluída de blebbistatin através da rota de perfusão.</li>
		<li>Ignore o passo 2.6 e avance para o passo 2.7 para desbotar.</li>
	</ol></li>
	<li>Coloração para uma gravação dual da voltagem da membrana e transientes de Ca2 +<ol>
<li>Manter a solução de Tyrode à temperatura ambiente. Nota: Esta definição inicial da temperatura é diferente de coloração para uma única gravação da tensão da membrana (etapa 2.5.).</li>
		<li>Administre o blebbistatin da mesma maneira como em passos 2.5.4 e 2.5.5.</li>
		<li>Mix 3 µ l de solução-mãe de Rhod2AM (10 mM) e 30 µ l de polioxietileno-polioxipropileno copolímero F-127 (20% em DMSO) em bloco e, em seguida, diluir a mistura com 10 mL de solução de Tyrode.</li>
		<li>Carregar a quantidade total de solução de Rhod2AM (3 µM) mais de 2-5 min, via a mesma rota que o blebbistatin.</li>
		<li>Dilua 7 µ l de solução-mãe de RH237 (10 mM) com 10 mL de solução de Tyrode.</li>
		<li>Administrar a quantidade total de RH237 solução diluída (7 µM) mais de 2-5 min.</li>
		<li>Após a conclusão do procedimento acima, começam a aquecer a solução de Tyrode em 37 ˚ c.</li>
	</ol></li>
	<li>Esmaecimento<ol>
<li>Mantenha a temperatura da solução de Tyrode 37 ˚ c no experimento seguinte.</li>
		<li>Perfundir o coração com solução de Tyrode pelo menos 5 min lavar as tinturas excessivas. Nota: Não há nenhuma necessidade de aumentar a taxa de fluxo durante esta lavagem passo (consulte a etapa 2.4.6.)</li>
		<li>Confirme o desaparecimento de qualquer artefato de movimento devido as contrações e a coloração homogénea no coração perfundido.</li>
	</ol></li>
	<li>Amostragem e análise de dados<ol>
<li>Coloque o tampa de vidro (25 mm × 60 mm) sobre o coração perfundido cuidadosamente, para achatar a superfície atrial sem muito estresse mecânico e evitar o artefato de movimento de vibração da solução. Confirme que o atrium anexa ao vidro tampa apropriadamente.</li>
		<li>Recorde a fluorescência pelas câmeras CMOS com uma amostragem taxa até 0,1 ms para di 4-ANEPPS e 1 ms para o RH237 e Rhod2AM de coloração.</li>
		<li>Analise as gravações obtidas usando o software de análise, de acordo com as instruções do fabricante para a operação real do software.</li>
		<li>Crie um mapa de ativação e o filme depois de extrair a região de interesse, remoção de deriva, filtragem temporal e binning53 X 3.</li>
	</ol></li>
</ol>3. eletrofisiológico estudo
<ol><li>Configuração de eletrodos de estimulação e estimulador<ol>
<li>Confirmar o contato da ponta do eletrodo estimulação sob medida na RA no tecido para estimulação (consulte a etapa 2.4.9.).</li>
		<li>Entrega tudo estimulação estímulos do cateter guia ligado ao estimulador programável.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Determinação do limiar estimulação<ol>
<li>Conjunto o ritmo intervalo entre 100 e 150 ms (largura de pulso de 0,4 ms), evitando qualquer ritmo intrínseco, ultrapassando a taxa de estimulação.</li>
		<li>Entrega a estimulação de estimulação constante pelo menos 20 batimentos obter uma estimulação atrial estável.</li>
		<li>Definir o ritmo saída em 5 mV, reduzi-la gradualmente até a falha de estimulação entregue para despolarizar o átrio.</li>
		<li>Confirme a excitação atrial pela presença de ondas P no ECG, e/ou um sinal de excitação atrial a gravação óptica.</li>
		<li>Determine o mínimo de estimulação de saída que é capaz de despolarizar o átrio como o limiar de estimulação.</li>
		<li>Defina a saída de estimulação para os estudos a seguir duas vezes no limiar de estimulação.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Constante e o ritmo de explosão<ol>
<li>Entregar a estimulação constante para 99 batidas, com um intervalo de marca-passo, começando com 150 ms, ou o intervalo mais longo que evita ultrapassando o ritmo intrínseco.</li>
		<li>Reduza o intervalo de estimulação progressivamente com passos de 5 ms, até 40 ms ou até atingir o intervalo que falha ao obter a captura de 1:1 do átrio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Único extrastimulus estimulação<ol>
<li>Defina a duração do ciclo estimulação da unidade básica (S1) para 120 ms 100 ms e ms 80 a menos que o ritmo intrínseco supera a unidade básica ou a falha de estimulação para obter excitação atrial 1:1.</li>
		<li>Defina o número de estímulos para 10 batidas para o trem de unidade básica de estimulação.</li>
		<li>Defina o primeiro extrastimulus (S2) para ms-10 para o comprimento do ciclo básico.</li>
		<li>Entrega S2 após o último estímulo estimulação da unidade básica.</li>
		<li>Encurte o intervalo de acoplamento de S2 progressivamente com passos de 5 ms, até o S2 falhar despolarizar o átrio.</li>
		<li>Determine o período refratário efetivo (ERP) como o maior intervalo de S2 falha para despolarizar o átrio.</li>
		<li>Avalie o ERP pelo menos 3 comprimentos diferentes ciclo básico para avaliar a adaptação da taxa do ERP.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Extrastimuli duplo e triplo, estimulação para induzir taquiarritmias atrial<ol>
<li>Redefina o intervalo de S2 a um ponto 20 ms fora o ERP de S2 se não arritmias são observadas.</li>
		<li>Adicione uma segunda extrastimulus (S3), começando com o mesmo intervalo como S2.</li>
		<li>Diminua o intervalo de acoplamento entre S2 e S3 progressivamente com passos de 5 ms até S3 falhar despolarizar o átrio.</li>
		<li>Redefinir o intervalo de S2 de um ponto de 10 ms fora do ERP e, em seguida, repita a etapa 3.5.3.</li>
		<li>Redefina os intervalos de S2 e S3 para pontos 20 ms fora cada ERP.</li>
		<li>Adicione um terceiro extrastimulus (S4), começando com o mesmo intervalo como S3.</li>
		<li>Diminua o intervalo de acoplamento entre S3 e S4 progressivamente com passos de 5 ms até S4 falhar despolarizar o átrio.</li>
		<li>Redefinir o intervalo S3 de um ponto de 10 ms fora do ERP e, em seguida, repita a etapa 3.5.7.</li>
		<li>Redefinir os intervalos de S2 e S3 para pontos 10 ms fora do ERP e, em seguida, repita a etapa 3.5.7.</li>
		<li>Defina o inducibility de taquiarritmias atrial por indução pode ser reproduzida usando estímulos programados da mesma forma.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Avaliação do inducibility de taquiarritmias atrial<ol>
<li>Grave continuamente o ECG durante todos os protocolos de estimulação (passo 3.3-3.5.).</li>
		<li>Realize gravações ópticas durante e após cada estímulo, para gravar a indução de taquicardia atrial (AT) ou resposta atrial repetitiva (RAR).</li>
		<li>Confirme a reprodutibilidade aplicando o mesmo protocolo de estimulação quando AF ou um RAR é induzida.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Gollob, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+mutations+in+the+Connexin+40+Gene+(GJA5)+in+atrial+fibrillation.">Somatic mutations in the Connexin 40 Gene (GJA5) in atrial fibrillation.</a> New Engl J Med. 354, 2677-2688 (2006).</li><li>Gudbjartsson, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variants+conferring+risk+of+atrial+fibrillation+on+chromosome+4q25.">Variants conferring risk of atrial fibrillation on chromosome 4q25.</a> Nature. 448, 353-357 (2007).</li><li>Ellinor, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meta-analysis+identifies+six+new+susceptibility+loci+for+atrial+fibrillation.">Meta-analysis identifies six new susceptibility loci for atrial fibrillation.</a> Nat. Genet. 44, 670-675 (2012).</li><li>Sinner, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+genetic,+transcriptional,+and+functional+analyses+to+identify+5+novel+genes+for+atrial+fibrillation.">Integrating genetic, transcriptional, and functional analyses to identify 5 novel genes for atrial fibrillation.</a> Circulation. 130, 1225-1235 (2014).</li><li>Laughner, J. I., Ng, F. S., Sulkin, M. S., Arthur, R. M., Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+and+analysis+of+cardiac+optical+mapping+data+obtained+with+potentiometric+dyes.">Processing and analysis of cardiac optical mapping data obtained with potentiometric dyes.</a> Am J Physiol-Heart C. 303, H753-H765 (2012).</li><li>Oishi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretch+of+Atrial+myocytes+stimulates+recruitment+of+macrophages+via+ATP+released+through+gap-junction+channels.">Stretch of Atrial myocytes stimulates recruitment of macrophages via ATP released through gap-junction channels.</a> J. Pharmacol. Sci. 120, 296-304 (2012).</li><li>Herron, T. J., Lee, P., Jalife, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+voltage+and+calcium+in+cardiac+cells+&amp;+tissues.">Optical imaging of voltage and calcium in cardiac cells &amp; tissues.</a> Circ. Res. 110, 609-623 (2012).</li><li>Girouard, S. D., Pastore, J. M., Laurita, K. R., Gregory, K. W., Rosenbaum, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+mapping+in+a+new+guinea+pig+model+of+ventricular+tachycardia+reveals+mechanisms+for+multiple+wavelengths+in+a+single+reentrant+circuit.">Optical mapping in a new guinea pig model of ventricular tachycardia reveals mechanisms for multiple wavelengths in a single reentrant circuit.</a> Circulation. 93, 603-613 (1996).</li><li>Koizumi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+defects+in+a+His-Purkinje+system+transcription+factor,+IRX3,+cause+lethal+cardiac+arrhythmias.">Genetic defects in a His-Purkinje system transcription factor, IRX3, cause lethal cardiac arrhythmias.</a> Eur. Heart J. 37, 1469-1475 (2016).</li><li>Glukhov, A. V., Uchida, K., Efimov, I. R., Nichols, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+roles+of+KATP+channel+subunits+in+metabolic+inhibition.">Functional roles of KATP channel subunits in metabolic inhibition.</a> J. Mol. Cell. Cardiol. 62, 90-98 (2013).</li><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-fat+diet+increases+vulnerability+to+atrial+arrhythmia+by+conduction+disturbance+via+miR-27b.">High-fat diet increases vulnerability to atrial arrhythmia by conduction disturbance via miR-27b.</a> J. Mol. Cell. Cardiol. 90, 38-46 (2016).</li><li>Choi, B. -. R., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+maps+of+optical+action+potentials+and+calcium+transients+in+guinea-pig+hearts:+mechanisms+underlying+concordant+alternans.">Simultaneous maps of optical action potentials and calcium transients in guinea-pig hearts: mechanisms underlying concordant alternans.</a> J. Physiol. 529, 171-188 (2000).</li><li>Hwang, G. -. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+calcium+and+vulnerability+to+fibrillation+and+defibrillation+in+Langendorff-perfused+rabbit+ventricles.">Intracellular calcium and vulnerability to fibrillation and defibrillation in Langendorff-perfused rabbit ventricles.</a> Circulation. 114, 2595-2603 (2006).</li><li>Kwaku, K. F., Dillon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shock-induced+depolarization+of+refractory+myocardium+prevents+wave-front+propagation+in+defibrillation.">Shock-induced depolarization of refractory myocardium prevents wave-front propagation in defibrillation.</a> Circ. Res. 79, 957-973 (1996).</li><li>Lang, D., Sulkin, M., Lou, Q., Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+mapping+of+action+potentials+and+calcium+transients+in+the+mouse+heart.">Optical mapping of action potentials and calcium transients in the mouse heart.</a> J. Vis. Exp. (55), e3275 (2011).</li><li>Eijsbouts, S. C. M., Majidi, M., Zandvoort, M. v., Allessie, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+acute+atrial+dilation+on+heterogeneity+in+conduction+in+the+isolated+rabbit+heart.">Effects of acute atrial dilation on heterogeneity in conduction in the isolated rabbit heart.</a> J. Cardiovasc. Electr. 14, 269-278 (2003).</li><li>Ravelli, F., Allessie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Atrial+dilatation+on+refractory+period+and+vulnerability+to+atrial+fibrillation+in+the+isolated+Langendorff-perfused+rabbit+heart.">Effects of Atrial dilatation on refractory period and vulnerability to atrial fibrillation in the isolated Langendorff-perfused rabbit heart.</a> Circulation. 96, 1686-1695 (1997).</li><li>Sasano, T., McDonald, A. D., Kikuchi, K., Donahue, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+ablation+of+ventricular+tachycardia+after+myocardial+infarction.">Molecular ablation of ventricular tachycardia after myocardial infarction.</a> Nat. Med. 12, 1256-1258 (2006).</li><li>Wakimoto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+atrial+tachycardia+and+fibrillation+in+the+mouse+heart.">Induction of atrial tachycardia and fibrillation in the mouse heart.</a> Cardiovasc. Res. 50, 463-473 (2001).</li><li>Haissaguerre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+Initiation+of+Atrial+Fibrillation+by+Ectopic+Beats+Originating+in+the+Pulmonary+Veins.">Spontaneous Initiation of Atrial Fibrillation by Ectopic Beats Originating in the Pulmonary Veins.</a> New Engl J Med. 339, 659-666 (1998).</li></ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Mapeamento de óptico é uma manobra bem estabelecida para estudar a eletrofisiologia cardíaca,7e é uma ferramenta bastante útil para avaliar não só arritmias ventriculares8,9, mas também atrial10,11 . Mapeamento simultâneo do potencial transmembrana e transientes de Ca2 + é útil para compreender os mecanismos subjacentes de arritmias em relação à insuficiência cardíaca e outras doenças cardíacas12,13. Ao comparar os outros métodos de avaliação eletrofisiológica, como aqueles que usam uma única célula ou camada de células, dentre as superioridades absolutas de mapeamento óptico no coração perfundido é a avaliação do padrão de condução no átrio intacto e ventrículo, não só durante o ritmo sinusal, mas também durante as arritmias induzidas14. Uma tentativa de utilizar corações murino, especialmente o átrio, como um substituto dos seres humanos tem encontrado dificuldade principalmente devido ao seu pequeno tamanho, porém, o mouse é um modelo experimental atraente em termos de avaliação em um animal geneticamente modificado modelo e este problema devem ser superado. Nossa abordagem fornece uma direção para resolvê-lo.
Embora nosso aparelho óptico mapeamento foi basicamente semelhante do sistema convencional para corações toda murino15, nosso método tem a vantagem de avaliar o átrio murino fazendo algumas modificações para ele. Primeiro, seguimos para obter uma alta resolução espacial e temporal de até 0.1 ms/frame e 20 µm/pixel e esse mapeamento de alta resolução, contribuído para uma medição mais precisa, o padrão de velocidade e propagação de condução no átrio murino. Em segundo lugar, para evitar danos mecânicos desnecessários ou estiramento do átrio, que poderia alterar as propriedades eletrofisiológicas 16,17, uma permanência agulha é inserida diretamente a LV para reduzir a pressão intracâmara, em vez de inseri-la através do LA como realizado em anterior estudo15. Além disso, o estímulo de estimulação é entregue através de um cateter de tamanho 1-francês feito eletrodo colocado na RA, mas não por um eletrodo de agulha, que pode ferir o átrio. Os pinos são evitados na fixação do apêndice atrial, que foram utilizados no estudo passado15. Em terceiro lugar, em termos de avaliação do mecanismo subjacente das arritmias, um protocolo de estimulação programada para induzir taquiarritmias atrial é crucial18,19. Realizamos estimulação programada idêntico em Estudos eletrofisiológicos clínicos, incluindo a explosão de estimulação e até triplo extrastimuli ritmo, com uma modificação do intervalo de estimulação para o coração de rato. Assim, além dos parâmetros de medição da linha de base, o protocolo poderia avaliar o inducibility de AT. Quando necessário, o inducibility do AT é avaliada com a administração de isoproterenol ou outras drogas. Em nossa experiência, os ratos do selvagem-tipo quase não mostram qualquer ATs mesmo após um protocolo de estimulação completa. Assim, o inducibility de AT deve ser uma informação importante para avaliar a contribuição de diversas condições patológicas, tais como mutações genéticas, procedimentos cirúrgicos e a administração de drogas11. Essas modificações podem otimizar a avaliação eletrofisiológica precisa na aurícula murino intacta.
Esse método também tem algumas limitações. Primeiro, usando uma resolução espacial máxima com um 5 X da lente objetiva, o campo de visão (FOV) é limitado a uma parte do átrio (i. e. apenas o apêndice atrial esquerdo como mostrado na Figura 2a). Para obter o FOV maior do átrio, um 1.6 X da lente objetiva é às vezes preferível (Figura 2b). Em segundo lugar, sem fixação do átrio com pinos, às vezes é difícil medir as propriedades de condução atrial corretamente, porque a superfície atrial é curvo. Então, colocamos o tampa de vidro em sua superfície para achatá-lo em vez de corrigi-lo por pinos. Esse método também é benéfico para a prevenção de artefato de movimento de vibrações da solução. Em terceiro lugar, com o nosso método, é muito difícil obter o FOV inteira, então, usar a exibição anterior e posterior corretamente é mais importante em nossa abordagem do que a outra abordagem, como mostrado na Figura 2. A vantagem do modo de exibição anterior seria a observação clara de reentrada no caso de condições patológicas, especialmente no apêndice (Figura 4). Por outro lado, a vista posterior tem uma vantagem de se obter uma boa visão da parede posterior atrial e pode haver uma gravação detalhada de desencadear a atividade da manga do miocárdio. Quando é difícil obter uma visualização apropriada e achatar sua superfície curvada com nosso método, o átrio pode ser corrigido com tensão mínima por pinos.
Com nosso método, existem 3 possíveis problemas, falha de coloração, estimulação e indução de arritmia. Por falta de coloração, se não ou ligeira fluorescência é observada, você deve verificar se o aparelho óptico mapeamento esteja montado corretamente, e se o reagente é adequadamente armazenado e usado. A condição da solução de perfusão também é crucial, que também pode afetar as propriedades eletrofisiológicas do coração em si, então, as condições da solução, incluindo o pH, temperatura, e se houve suficiente arejamento deve ser rigorosamente monitorados. Também é importante evitar qualquer embolia no coração. Para estimulação falha, se a estimulação estímulos não podem excitar o átrio, pesquisadores devem verificar se a fiação está correta usando um testador de circuitos. Quando os estimulação estímulos serão emitidos corretamente, o problema é o contato do eletrodo com o tecido. Reposicionamento dos eléctrodos pode resolver o problema, e nossa abordagem usando o cateter guia torna mais fácil. Para a dificuldade na indução de arritmia, RV estimulação pode ser usado para a indução de um AT em alguns casos limitados. Usando um cateter de eletrodos transvenosos do que a distais dois eletrodos e eletrodos proximais podem ser localizados no RV e RA, respectivamente, é fácil alterar o site estimulação da RA para a caravana. Este cateter também é útil para deslocamento a excitação ventricular quando um sinal de ativação ventricular simultânea mascara o sinal de excitação atrial.
Este método irá contribuir para avaliar o genótipo-fenótipo interações no AF relacionados genes encontrados recentemente por estudos de romance como GWAS, especialmente para os genes com que a investigação não conseguiu mostrá-los por outras abordagens. Com o progresso das técnicas e dispositivos, as propriedades eletrofisiológicas da manga veia pulmonar, que é a fonte importante de AF20, podem ser avaliadas no coração intacto, com esta abordagem.

O coração é composto por 4 câmaras em mamíferos. As duas câmaras superiores são átrios e as inferiores são ventrículos. Ventrículos funcionam como uma bomba para ejetar o sangue para a circulação sistêmica ou pulmonar. Átrios recebem sangue retornando das veias pulmonares ou sistêmicas e auxiliar no transporte de sangue para os ventrículos para obter uma função de bomba cardíaca eficiente. De um aspecto eletrofisiológico, a importante função dos átrios é para regular o ritmo cardíaco. Os sinais elétricos se originam a partir do nó sinusal localizado na junção entre a veia cava superior (SVC) e o átrio direito (RA), então se propague para o RA e o átrio esquerdo (LA) e conduzir para o ventrículo através do nó atrioventricular e His-Purkinje sistema de condução.
Arritmias, que são perturbações do ritmo cardíaco, são classificadas em atrial e ventricular de acordo com sua origem. Fibrilação atrial (FA) é a forma mais comum de sustentada de uma arritmia, caracterizada por uma excitação rápida e aleatória dos átrios. Análises genéticas recentes e estudos de associação de genoma-larga (GWAS) demonstraram a associação entre AF e mutações genéticas ou monopolymorphisms1,2,3,4. Estes resultados indicam que o AF é pelo menos parcialmente associado com uma causa genética. Portanto, é fundamental para avaliar as interações genótipo-fenótipo nas aurículas usando um modelo animal geneticamente modificadas. É amplamente aceito que o mouse é o mamífero mais estabelecido por modificação genética.
A técnica de mapeamento óptico foi desenvolvida para avaliar a excitação do tecido cardíaco. No entanto, a observação do átrio murino pelo mapeamento óptico é dificultada pelo seu tamanho relativamente pequeno. Tentamos alcançar uma avaliação detalhada do átrio murino com alta resolução temporal e espacial.

<table><tbody><tr><td>(-)-Blebbistatin</td><td>SIGMA</td><td>B0560-1MG</td><td>E-C decoupler to eliminate motion artifact during optical mapping</td></tr><tr><td>RH237</td><td>Biotium</td><td>61018</td><td>Voltage-sensitive dye</td></tr><tr><td>Rhod2AM</td><td>Biotium</td><td>50024</td><td>Ca indicator</td></tr><tr><td>Pluronic F-127 20% solution in DMSO</td><td>Biotium</td><td>#59000</td><td>To enhance the staining with Rhod2AM</td></tr><tr><td>Di-4-ANEPPS</td><td>Wako</td><td>041-29111</td><td>Voltage-sensitive dye</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Wako</td><td>046-21981</td><td>Solvent for reagents</td></tr><tr><td>Bottle top filter</td><td>Corning</td><td>430513</td><td>For filtering Tyrode&#039;s solution</td></tr><tr><td>Haparin Sodium</td><td>Mochida Pharmaceutical Co., Ltd</td><td>N/A</td><td>To avoid blood clots in the coronary artery</td></tr><tr><td>Air stone (&amp;phi;8 mm x 10 mm)</td><td>Tokyo Koshin Rikagaku Seisakusho</td><td>N/A</td><td>for aeration</td></tr><tr><td>Pentobarbital</td><td>Kyoritsu Seiyaku Corporation</td><td>N/A</td><td>For an anesthesia</td></tr><tr><td>Programmable stimulator</td><td>Fukuda Denshi</td><td>BC-05</td><td>Fukuda Denshi kindly rented us.</td></tr><tr><td>Power Lab</td><td>AD Instruments</td><td>Powerlab 26/8SP</td><td>To record blood pressure and electrocardiogram</td></tr><tr><td>Bio Amp</td><td>AD Instruments</td><td>ML132</td><td>Amprifier for electrocardiogram</td></tr><tr><td>BP Amp</td><td>AD Instruments</td><td>FE117</td><td>Amprifier for blood pressure</td></tr><tr><td>LabChart</td><td>AD Instruments</td><td>Version 7</td><td>Software to record and analyze blood pressure and electrocardiogram</td></tr><tr><td>Disposable BP transducer</td><td>AD Instruments</td><td>MLT0670</td><td>pressure transducer</td></tr><tr><td>1-Fr custom made electrode catheter</td><td>Unique Medical</td><td>N/A</td><td>To pace right atrium</td></tr><tr><td>Polyethylene tube (OD: 0.8 mm, ID: 0.5 mm)</td><td>Natume Seisakujo</td><td>SP31</td><td>Put into superior vena cava to introduce electrode catheter</td></tr><tr><td>Millex-SV 5.00 &amp;mu;m</td><td>Merk Millipore</td><td>SLSV025LS</td><td>To filter the circulating Tyrode</td></tr><tr><td>24-gauge indwelling needle</td><td>TERUMO</td><td>SR-FS2419</td><td>Introduced into left ventricle to reduce the pressure in chamber</td></tr><tr><td>21-gauge needle</td><td>TERUMO</td><td>SN-2170</td><td>We cut the tip of needle and blunted it by filing</td></tr><tr><td>25-guage needle</td><td>TERUMO</td><td>NN-2525R</td><td></td></tr><tr><td>1-ml syringe</td><td>TERUMO</td><td>SS-01T</td><td></td></tr><tr><td>PVC tube</td><td>TERUMO</td><td>SF-ET0525</td><td>for Langendorff&#039;s perfusion circuit</td></tr><tr><td>Three-way stopcock</td><td>TERUMO</td><td>TS-TL2K</td><td>for Langendorff&#039;s perfusion circuit</td></tr><tr><td>Petri dish</td><td>As one</td><td>3-1491-01</td><td></td></tr><tr><td>Custum made heating glass coil</td><td>Motohashi Rika</td><td>N/A</td><td>to keep temperature of perfusion solution</td></tr><tr><td>Custum made warming glass chamber</td><td>Motohashi Rika</td><td>N/A</td><td>to keep temperature of perfusion solution</td></tr><tr><td>Constant temperature circulating device</td><td>Lauda</td><td>E100</td><td>connected to heating coil and warming chamber</td></tr><tr><td>Cover glass (25 mm &amp;times; 60 mm)</td><td>Matsunami</td><td>C025601</td><td>Put on the atria to flatten the recording area</td></tr><tr><td>Perista pump</td><td>ATTO</td><td>SJ-1211</td><td>peristaltic pump</td></tr><tr><td>Stemi DV4</td><td>Carl Zeiss</td><td>N/A</td><td>Stereomicroscope</td></tr><tr><td>MiCAM ULTIMA-L2</td><td>Brainvision Inc.</td><td>UL-L2</td><td>Optical mapping System</td></tr><tr><td>BV_Ana Software</td><td>Brainvision Inc.</td><td>BV_Ana</td><td>Data Analysis Software</td></tr><tr><td>THT Macroscope</td><td>Brainvision Inc.</td><td>THT-ZS</td><td>Epi-Illumination Unit</td></tr><tr><td>LED Light Source</td><td>Brainvision Inc.</td><td>LEX2-G</td><td></td></tr><tr><td>Dichroic Mirror 560nm</td><td>Brainvision Inc.</td><td>DM560</td><td>Epi-Illuminatinon</td></tr><tr><td>Excitation Filter 520/35nm</td><td>Semrock, Inc.</td><td>FF01-520/35-25</td><td></td></tr><tr><td>Projection lens Plan S 1.0X</td><td>Carl Zeiss</td><td>435200-0000-000</td><td></td></tr><tr><td>Focus Drive</td><td>Carl Zeiss</td><td>435400-0000-000</td><td></td></tr><tr><td>Objective lens Revolver</td><td>Carl Zeiss</td><td>435302-0000-000</td><td></td></tr><tr><td>Manual Focus Column</td><td>Carl Zeiss</td><td>435400-0000-000</td><td></td></tr><tr><td>Macroscope Base</td><td>Carl Zeiss</td><td>435430-9901-000</td><td></td></tr><tr><td>Straight Light Guide</td><td>MORITEX Corporation</td><td>MSG10-2200S</td><td>Epi-Illuminatinon</td></tr><tr><td>Condenser Lens</td><td>MORITEX Corporation</td><td>ML-50</td><td></td></tr><tr><td>PLANAPO 5.0X</td><td>Leica Microsystems</td><td>10447243</td><td>Objective Lens</td></tr><tr><td>PLANAPO 1.0X</td><td>Leica Microsystems</td><td>10447157</td><td>Objective Lens</td></tr><tr><td>PLANAPO 1.6X</td><td>Leica Microsystems</td><td>10447050</td><td>Objective Lens</td></tr><tr><td>Beam-Splitter</td><td>Brainvision Inc.</td><td>FLSP-2</td><td></td></tr><tr><td>Dichroic Mirror 665nm</td><td>Brainvision Inc.</td><td>DM665</td><td>Beam-Splitter</td></tr><tr><td>Emission Filter 572/28nm</td><td>Edmund Optics</td><td>#84-100</td><td>Rhod2-AM</td></tr><tr><td>Emission Filter 697/75nm</td><td>Semrock, Inc.</td><td>FF01-697/75-25</td><td>RH237 and Di-4-ANEPPS</td></tr><tr><td>0.2 mL PCR tube</td><td>Greiner Bio-One</td><td>671201</td><td></td></tr><tr><td>aluminum foil</td><td>Toyo alumi</td><td>0020</td><td></td></tr></tbody></table>

electrophysiological assessment of murine atria with high-resolution optical mapping

Recentes estudos de associação de genoma-largo visando a fibrilação atrial (FA) têm indicado uma forte associação entre o genótipo e fenótipo eletrofisiológico nas aurículas. Que nos encoraja a utilizar um modelo de rato geneticamente modificado para elucidar o mecanismo de AF. No entanto, é difícil avaliar as propriedades eletrofisiológicas em átrios murino devido ao seu pequeno tamanho. Este protocolo descreve a avaliação eletrofisiológica dos átrios usando um sistema de mapeamento óptico com uma alta resolução temporal e espacial em corações murino Langendorff perfundido. O sistema óptico de mapeamento é montado com dupla de alta velocidade complementares de óxido metálico semicondutor câmeras e lentes objetivas de alta magnificação, para detectar a fluorescência de uma tensão sensível corante e indicador de Ca2 + . Para focalizar a avaliação dos átrios murino, mapeamento óptico é realizado com uma área de 2 mm × 2 mm ou 10 mm x 10 mm, com 100 × 100 resolução (20 µm/pixel ou 100 µm/pixel) e taxa de amostragem de até 10 kHz (0,1 ms) no máximo. Um eletrodo de tamanho 1-francês transvenosos estimulação cateter é colocado no átrio direito através da veia cava superior, evitando qualquer dano mecânico para o átrio, e estimulação de estimulação é entregue através do cateter. Um estudo eletrofisiológico é realizado com estimulação programada, incluindo a estimulação constante, estourou o marca-passo e até extrastimuli triplo de estimulação. Com uma espontânea ou ritmo de estimulação, o mapeamento óptico gravou a duração do potencial de ação, mapa de ativação, velocidade de condução e Ca2 + transitória individualmente nas aurículas direita e esquerdas. Além disso, a estimulação programada também determina o inducibility de taquiarritmias atrial. Mapeamento de ativação precisa é realizado para identificar a propagação de excitação no átrio durante uma taquiarritmia atrial induzida. Mapeamento de óptico com uma configuração especializada permite uma avaliação eletrofisiológica minuciosa do átrio em modelos patológicos murino.

Os experimentos de óptica de mapeamento são executados usando os dispositivos, conforme mostrado na Figura 1a. O esquema do sistema óptico é ilustrado na Figura 1b. O sistema fornece uma análise de alta resolução do potencial de membrana e Ca2 + transitória no átrio.
Conforme representado na Figura 1 c e d, o coração isolado é posicionado em uma câmara de temperatura controlada. Um cateter de eletrodo de tamanho 1-francês é colocado na RA através de um tubo de PE inserido o SVC, e outro tubo de PE de permanência é inserido na cavidade do LV a partir do ápice de LV para evitar pressão excessiva sobre a câmara do coração. Para uma gravação simultânea de ECG, o cátodo (chumbo ECG [-]) é conectado à agulha de punção, e o ânodo (ponta de ECG [+]) é ligado ao eléctrodo de pinos inserido no ápice ventricular. A característica desta assembleia é evitar danos mecânicos dos átrios.
Para a avaliação da tensão da membrana, fluorescência usando di-4-ANEPPS é gravada com até uma taxa de 10.000 quadros/s de amostragem (Figura 2). O mapa de ativação é obtido durante a estimulação constante libertou o RA. O mapeamento fino permite a análise do padrão de condução detalhadas em pequenos átrios murino.
A Figura 3 ilustra traços representativos das tensões de membrana e Ca2 + transitória no LA usando RH237 e Rhod2AM durante a estimulação constante do Ra. Podemos reduzir a taxa de amostragem do mapeamento de 1000 quadros/s para obter uma relação sinal/ruído suficiente do sinal Rhod2AM com a configuração actual. No entanto, o sistema fornece uma qualidade suficiente para analisar a relação entre o potencial de ação e Ca2 + transitória.
Em seguida, executamos uma indução de uma taquiarritmia atrial com estimulação programada usando ratos sob uma condição patológica. A Figura 4 apresenta uma gravação óptica de um induzido AT em um átrio de murino manchado com di-4-ANEPPS. O mouse passa por um procedimento de constrição da aorta transversa para aplicar uma sobrecarga de pressão para o átrio, 10 dias antes do experimento6. Podemos induzir AT pelo triplo extrastimuli estimulação (120/100/100/80) e observar a propagação do circuito reentrante.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56478/56478fig1.jpg"> Figura 1. Sistema óptico mapeamento. r. Assembleia Geral do sistema de mapeamento de eletrofisiologia/óptico. b. esquema da composição do sistema de mapeamento de óptica: A seta azul indica a excitação luz gerada pela fonte de luz. A lente objetiva pode ser trocada com a torre. A luz emitida do coração manchado é dividida entre a câmera 1 e câmera 2. Câmera 1 detecta os sinais de longo comprimento de onda para a tensão de membrana, e câmera 2 registra os comprimentos de onda com um filtro passa-banda de 580 ± 20 nm para o transiente de Ca2 + . Durante o procedimento, a pressão de ECG e perfusão registam-se continuamente, e o sinal de ECG também é simultaneamente importado para o mapa de óptico software de gravação. c. preparação dos corações isolados: os corações são canulados com uma agulha cega através da aorta ascendente para perfusão. Para gravações simultâneas de ECG, o cátodo é ligado para a agulha de punção, e o ânodo com o eletrodo de pino é inserido no ápice ventricular. d. tubo de canulação e os eletrodos: O coração é canulado com uma agulha de calibre 21 cega para perfusão (agulha de punção). Um tamanho de 1-francês estimulando eletrodo (eletrodo) é colocado no átrio direito através de um tubo de polietileno inserido na veia cava superior. A câmara de vidro é aquecida a 37 ˚ c por água aquecida circula na cavidade da câmara. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56478/56478fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56478/56478fig2.jpg"> Figura 2. Mapa de ativação na aurícula. r. mapas de ativação representativa na vista anterior com uma objectiva de 5 X e b. na vista posterior com um 1.6 X da lente objetiva. (Painel da esquerda) Diagrama esquemático do coração isolada e átrio. (Painel direito) Mapa de ativação do átrio esquerdo obtidos com di-4-ANEPPS, manchando a 10.000 quadros/s. A gravação é executada sob um ritmo constante com o estimulante eletrodo colocado no átrio direito. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56478/56478fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56478/56478fig3.jpg"> Figura 3. Gravação dual do potencial de ação e Ca2 + transitório na aurícula esquerda. r. esquemático do coração isolado. b. imagem representativa da intensidade da fluorescência na aurícula esquerda, usando o RH237 para a tensão de membrana (Vm) e Rhod2AM para o transiente de Ca2 + . A gravação é realizada com uma lente de objetiva X 5 em 1.000 frames/s. c. Gravação simultânea do ECG (topo), sinal de RH237 (médio) e sinal de Rhod2AM (baixo), durante a estimulação constante com o eletrodo de estimulação na aurícula direita. As setas pretas indicam a estimulação de pontos e setas amarelas a excitação ventricular. Um efeito de espalhamento de luz do ventrículo também pode ser observado (setas amarelas) tanto no sinal de RH237 e Rhod2AM. m. mesclado RH237 e Rhod2AM traço. O potencial de ação e transientes de Ca2 + mudanças são registradas simultaneamente. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56478/56478fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56478/56478fig4.jpg"> Figura 4. Mapeamento de ativação durante taquicardia atrial. (Painel da esquerda) Diagrama esquemático do coração isolado. (Painel do meio) Mapa de ativação durante uma taquicardia atrial (AT). AT foi induzido pelo ritmo triplo extrastimuli entregues a partir do átrio direito. (Painel direito) Mapa de ativação durante o ritmo sinusal no mesmo coração de rato. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56478/56478fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Filme complementar 1. Filme representativo da membrana potencial no átrio usando coloração com di-4-ANEPPS. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56478/Supplementary_movie_1.zip">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Filme complementar 2. Filmes representativos do mapeamento de ativação durante o ritmo sinusal e taquicardia atrial. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56478/Supplementary_movie_2.zip">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

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Electrophysiological Assessment of Murine Atria with High-Resolution Optical Mapping

Avaliação eletrofisiológica de murino átrios com mapeamento óptico de alta resolução

Este protocolo descreve a avaliação eletrofisiológica dos átrios murino utilizando um sistema óptico de mapeamento com alta resolução temporal e espacial, incluindo gravações duas da tensão da membrana e Ca2 + transitória sob programado estimulação através de um cateter eletrodo especializados.

Recent genome-wide association studies targeting atrial fibrillation (AF) have indicated a strong association between the genotype and ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

9.7K visualizações.  Tokyo Medical and Dental University. Este protocolo descreve a avaliação eletrofisiológica dos átrios murino utilizando um sistema óptico de mapeamento com alta resolução temporal e espacial, incluindo gravações duas da tensão da membrana e Ca2 + transitória sob programado estimulação através de um cateter eletrodo especializados.

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Multiparametric Optical Mapping of the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Optical imaging and fluorescent probes have significantly advanced research methodology in the field of cardiac electrophysiology in ways that could not have been accomplished by other approaches1. With the use of the calcium- and voltage-sensitive dyes, optical mapping allows measurement of transmembrane action potentials and calcium transients with high spatial resolution without the physical contact with the tissue. This makes measurements of the cardiac electrical activity possible under many conditions where the use of electrodes is inconvenient or impossible1. For example, optical recordings provide accurate morphological changes of membrane potential during and immediately after stimulation and defibrillation, while conventional electrode techniques suffer from stimulus-induced artifacts during and after stimuli due to electrode polarization1. 
The Langendorff-perfused rabbit heart is one of the most studied models of human heart physiology and pathophysiology. Many types of arrhythmias observed clinically could be recapitulated in the rabbit heart model. It was shown that wave patterns in the rabbit heart during ventricular arrhythmias, determined by effective size of the heart and the wavelength of reentry, are very similar to that in the human heart2. It was also shown that critical aspects of excitation-contraction (EC) coupling in rabbit myocardium, such as the relative contribution of sarcoplasmic reticulum (SR), is very similar to human EC coupling3. Here we present the basic procedures of optical mapping experiments in Langendorff-perfused rabbit hearts, including the Langendorff perfusion system setup, the optical mapping systems setup, the isolation and cannulation of the heart, perfusion and dye-staining of the heart, excitation-contraction uncoupling, and collection of optical signals. These methods could be also applied to the heart from species other than rabbit with adjustments to flow rates, optics, solutions, etc.
Two optical mapping systems are described. The panoramic mapping system is used to map the entire epicardium of the rabbit heart4-7. This system provides a global view of the evolution of reentrant circuits during arrhythmogenesis and defibrillation, and has been used to study the mechanisms of arrhythmias and antiarrhythmia therapy8,9. The dual mapping system is used to map the action potential (AP) and calcium transient (CaT) simultaneously from the same field of view10-13. This approach has enhanced our understanding of the important role of calcium in the electrical alternans and the induction of arrhythmia14-16.

This article describes the basic procedures for conducting optical mapping experiments in the Langendorff-perfused rabbit heart using the panoramic imaging system, and the dual (voltage and calcium) imaging modality.

Multiparamétrico Mapping Optical do Coração Coelho Langendorff-perfundidos

Optical imaging and fluorescent probes have significantly advanced research methodology in the field of cardiac electrophysiology in ways that could not ...

Bioengenharia

Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. Cardiovascular physiological phenotyping of the mouse heart can be easily done using fluorescence imaging employing various probes for transmembrane potential (Vm), calcium transients (CaT), and other parameters. Excitation-contraction coupling is characterized by action potential and intracellular calcium dynamics; therefore, it is critically important to map both Vm and CaT simultaneously from the same location on the heart1-4. Simultaneous optical mapping from Langendorff perfused mouse hearts has the potential to elucidate mechanisms underlying heart failure, arrhythmias, metabolic disease, and other heart diseases. Visualization of activation, conduction velocity, action potential duration, and other parameters at a myriad of sites cannot be achieved from cellular level investigation but is well solved by optical mapping1,5,6. In this paper we present the instrumentation setup and experimental conditions for simultaneous optical mapping of Vm and CaT in mouse hearts with high spatio-temporal resolution using state-of-the-art CMOS imaging technology. Consistent optical recordings obtained with this method illustrate that simultaneous optical mapping of Langendorff perfused mouse hearts is both feasible and reliable.

This paper details the dissection procedure, instrumental setup, and experimental conditions during optical mapping of transmembrane potential (Vm) and intracellular calcium transient (CaT) in intact isolated Langendorff perfused mouse hearts.

Mapeamento de potenciais de ação óptica e transientes de cálcio no coração de rato

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

High-Resolution Endocardial and Epicardial Optical Mapping in a Sheep Model of Stretch-Induced Atrial Fibrillation

Atrial fibrillation (AF) is a complex cardiac arrhythmia with high morbidity and mortality.1,2 It is the most common sustained cardiac rhythm disturbance seen in clinical practice and its prevalence is expected to increase in the coming years.3 Increased intra-atrial pressure and dilatation have been long recognized to lead to AF,1,4 which highlights the relevance of using animal models and stretch to study AF dynamics. Understanding the mechanisms underlying AF requires visualization of the cardiac electrical waves with high spatial and temporal resolution. While high-temporal resolution can be achieved by conventional electrical mapping traditionally used in human electrophysiological studies, the small number of intra-atrial electrodes that can be used simultaneously limits the spatial resolution and precludes any detailed tracking of the electrical waves during the arrhythmia. The introduction of optical mapping in the early 90's enabled wide-field characterization of fibrillatory activity together with sub-millimeter spatial resolution in animal models5,6 and led to the identification of rapidly spinning electrical wave patterns (rotors) as the sources of the fibrillatory activity that may occur in the ventricles or the atria.7-9 Using combined time- and frequency-domain analyses of optical mapping it is possible to demonstrate discrete sites of high frequency periodic activity during AF, along with frequency gradients between left and right atrium. The region with fastest rotors activates at the highest frequency and drives the overall arrhythmia.10,11 The waves emanating from such rotor interact with either functional or anatomic obstacles in their path, resulting in the phenomenon of fibrillatory conduction.12 Mapping the endocardial surface of the posterior left atrium (PLA) allows the tracking of AF wave dynamics in the region with the highest rotor frequency. Importantly, the PLA is the region where intracavitary catheter-based ablative procedures are most successful terminating AF in patients,13 which underscores the relevance of studying AF dynamics from the interior of the left atrium. Here we describe a sheep model of acute stretch-induced AF, which resembles some of the characteristics of human paroxysmal AF. Epicardial mapping on the left atrium is complemented with endocardial mapping of the PLA using a dual-channel rigid borescope c-mounted to a CCD camera, which represents the most direct approach to visualize the patterns of activation in the most relevant region for AF maintenance.

This report provides a detailed description of the methodology and results of simultaneous endocardial and epicardial optical mapping of electrical excitation in the intact left atrium of a Langendorff-perfused sheep heart during stretch-induced atrial fibrillation.

Alta Resolução Mapeamento endocárdico e epicárdico óptico em um modelo de Ovinos de Stretch Induzida por Fibrilação Atrial

 Atrial fibrillation (AF) is a complex cardiac arrhythmia with high morbidity and mortality.1,2 It is the most common sustained cardiac rhythm disturbance ...

Medicina

Optical Mapping of Langendorff-perfused Rat Hearts

Optical mapping of the cardiac surface with voltage-sensitive fluorescent dyes has become an important tool to investigate electrical excitation in experimental models that range in scale from cell cultures to whole-organs[1, 2]. Using state-of-the-art optical imaging systems, generation and propagation of action potentials during normal cardiac rhythm or throughout initiation and maintenance of arrhythmias can be visualized almost instantly[1]. The latest commercially-available systems can provide information at exceedingly high spatiotemporal resolutions and were based on custom-built equipment initially developed to overcome the obstacles imposed by more conventional electrophysiological methods[1]. Advancements in high-resolution and high-speed complementary metal-oxide-semiconductor (CMOS) cameras and intensely-bright, light-emitting diodes (LEDs) as well as voltage-sensitive dyes, optics, and filters have begun to make electrical signal acquisition practical for cardiovascular cell biologists who are more accustomed to working with microscopes. Although the newest generation of CMOS cameras can acquire 10,000 frames per second on a 16,384 pixel array, depending on the type of sample preparation, long-established fluorescence acquisition technologies such as photodiode arrays, laser scanning systems, and cooled charged-coupled device (CCD) cameras still have some distinct advantages with respect to dynamic range, signal-to-noise ratio, and quantum efficiency[1, 3]. In the present study, Lewis rat hearts were perfused ex vivo with a crystalloid perfusate (Krebs-Henseleit solution) at 37&deg;C on a modified Langendorff apparatus. After a 20 minute stabilization period, the hearts were intermittently perfused with 11 mMol/L 2,3-butanedione monoxime to eliminate contraction-associated motion during image acquisition. For optical mapping, we loaded hearts with the fast-response potentiometric probe di-8-ANEPPS[4] (5 &mu;Mol/L) and briefly illuminated the preparation with 475&plusmn;15 nm excitation light. During a typical 2 second period of illumination, &gt;605 nm light emitted from the cardiac preparation was imaged with a high-speed CMOS camera connected to a horizontal macroscope. For this demonstration, hearts were paced at 300 beats per minute with a coaxial electrode connected to an isolated electrical stimulation unit. Simultaneous bipolar electrographic recordings were acquired and analyzed along with the voltage signals using readily-available software. In this manner, action potentials on the surface of Langendorff-perfused rat hearts can be visualized and registered with electrographic signals.

This article describes a high temporal and spatial resolution technique to optically image action potential movement on the surface of Langendorff-perfused rat hearts using a potentiometric dye (di-8-ANEPPS).

Mapeamento óptica de corações perfundidos Langendorff-Rat

Optical mapping of the cardiac surface with voltage-sensitive fluorescent dyes has become an important tool to investigate electrical excitation in ...

Biologia

Optical Imaging of Isolated Murine Ventricular Myocytes

The ability to isolate adult cardiac myocytes has permitted researchers to study a variety of cardiac pathologies at the single cell level. While advances in calcium sensitive dyes have permitted the robust optical recording of single cell calcium dynamics, recording of robust transmembrane optical voltage signals has remained difficult. Arguably, this is because of the low single to noise ratio, phototoxicity, and photobleaching of traditional potentiometric dyes. Therefore, single cell voltage measurements have long been confined to the patch clamp technique which while the gold standard, is technically demanding and low throughput. However, with the development of novel potentiometric dyes, large, fast optical responses to changes in voltage can be obtained with little to no phototoxicity and photobleaching. This protocol describes in detail how to isolate adult murine myocytes which can be used for cellular shortening, calcium, and optical voltage measurements. Specifically, the protocol describes how to use a ratiometric calcium dye, a single-excitation calcium dye, and a single excitation voltage dye. This approach can be used to assess the cardiotoxicity and arrhythmogenicity of various chemical agents. While phototoxicity is still an issue at the single cell level, methodology is discussed on how to reduce it.

We present the methodology for the isolation of murine myocytes and how to obtain voltage or calcium traces simultaneously with sarcomere shortening traces using fluorescence photometry with simultaneous digital cell geometry measurements.

Imagem óptica de miócitos ventriculares isolados de urina

The ability to isolate adult cardiac myocytes has permitted researchers to study a variety of cardiac pathologies at the single cell level. While advances ...

High-Throughput Analysis of Optical Mapping Data Using ElectroMap

Optical mapping is an established technique for high spatio-temporal resolution study of cardiac electrophysiology in multi-cellular preparations. Here we present, in a step-by-step guide, the use of ElectroMap for analysis, quantification, and mapping of high-resolution voltage and calcium datasets acquired by optical mapping. ElectroMap analysis options cover a wide variety of key electrophysiological parameters, and the graphical user interface allows straightforward modification of pre-processing and parameter definitions, making ElectroMap applicable to a wide range of experimental models. We show how built-in pacing frequency detection and signal segmentation allows high-throughput analysis of entire experimental recordings, acute responses, and single beat-to-beat variability. Additionally, ElectroMap incorporates automated multi-beat averaging to improve signal quality of noisy datasets, and here we demonstrate how this feature can help elucidate electrophysiological changes that might otherwise go undetected when using single beat analysis. Custom modules are included within the software for detailed investigation of conduction, single file analysis, and alternans, as demonstrated here. This software platform can be used to enable and accelerate the processing, analysis, and mapping of complex cardiac electrophysiology.

This protocol describes the setup and use of ElectroMap, a MATLAB-based open-source software platform for analysis of cardiac optical mapping data. ElectroMap provides a versatile high-throughput tool for analysis of optical mapping voltage and calcium datasets across a wide range of cardiac experimental models.

Análise de alto throughput de dados de mapeamento óptico usando o ElectroMap

Optical mapping is an established technique for high spatio-temporal resolution study of cardiac electrophysiology in multi-cellular preparations. Here we ...

Optocardiography and Electrophysiology Studies of Ex Vivo Langendorff-perfused Hearts

Small animal models are most commonly used in cardiovascular research due to the availability of genetically modified species and lower cost compared to larger animals. Yet, larger mammals are better suited for translational research questions related to normal cardiac physiology, pathophysiology, and preclinical testing of therapeutic agents. To overcome the technical barriers associated with employing a larger animal model in cardiac research, we describe an approach to measure physiological parameters in an isolated, Langendorff-perfused piglet heart. This approach combines two powerful experimental tools to evaluate the state of the heart: electrophysiology (EP) study and simultaneous optical mapping of transmembrane voltage and intracellular calcium using parameter sensitive dyes (RH237, Rhod2-AM). The described methodologies are well suited for translational studies investigating the cardiac conduction system, alterations in action potential morphology, calcium handling, excitation-contraction coupling and the incidence of cardiac alternans or arrhythmias.

The objective of this study was to establish a method for investigating cardiac dynamics using a translational animal model. The described experimental approach incorporates dual-emission optocardiography in conjunction with an electrophysiological study to assess electrical activity in an isolated, intact porcine heart model.

Estudos de Optocardiografia e Eletrofisiologia de Ex Vivo Langendorff-perfundido Corações

Small animal models are most commonly used in cardiovascular research due to the availability of genetically modified species and lower cost compared to ...

Voltage and Calcium Dual Channel Optical Mapping of Cultured HL-1 Atrial Myocyte Monolayer

Optical mapping has proven to be a valuable technique to detect cardiac electrical activity on both intact ex vivo hearts and in cultured myocyte monolayers. HL-1 cells have been widely used as a 2-Dimensional cellular model for studying diverse aspects of cardiac physiology. However, it has been a great challenge to optically map calcium (Ca) transients and action potentials simultaneously from the same field of view in a cultured HL-1 atrial cell monolayer. This is because special handling and care is required to prepare healthy cells that can be electrically captured and optically mapped. Therefore, we have developed an optimal working protocol for dual channel optical mapping. In this manuscript, we have described in detail how to perform the dual channel optical mapping experiment. This protocol is a useful tool to enhance the understanding of action potential propagation and Ca kinetics in arrhythmia development.

This article describes the technique used to perform dual channel optical mapping in cultured HL-1 atrial cell monolayers. This unique protocol allows the simultaneous visualization of both calcium (Ca) and voltage (Vm) activity in the same area for the detailed detection and analysis of electrophysiological properties of culture monolayers.

Tensão e cálcio Dual Channel Mapping Optical do Cultivadas HL-1 Atrial miócitos Monolayer

Optical mapping has proven to be a valuable technique to detect cardiac electrical activity on both intact ex vivo hearts and in cultured myocyte ...

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a significant role in certain types of arrhythmia. Because arrhythmias are spatially distinct, emergent phenomena, they must be investigated at the tissue level. However, methods for directly probing SR Ca2+ in the intact heart remain limited. This article describes the protocol for dual optical mapping of transmembrane potential (Vm) and free intra-SR [Ca2+] ([Ca2+]SR) in the Langendorff-perfused rabbit heart. This approach takes advantage of the low-affinity Ca2+ indicator Fluo-5N, which has minimal fluorescence in the cytosol where intracellular [Ca2+] ([Ca2+]i) is relatively low but exhibits significant fluorescence in the SR lumen where [Ca2+]SR is in the millimolar range. In addition to revealing SR Ca2+ characteristics spatially across the epicardial surface of the heart, this approach has the distinct advantage of simultaneous monitoring of Vm, allowing for investigations into the bidirectional relationship between Vm and SR Ca2+ and the role of SR Ca2+ in arrhythmogenic phenomena.

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

This article describes the detailed protocol and equipment necessary for dual optical mapping of transmembrane potential (Vm) and free intra-sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ in the Langendorff-perfused rabbit heart. This method allows for direct observation and quantification of Vm and SR Ca2+ dynamics in the intact heart.

Mapeamento óptica de Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; E Potencial Transmembrane no Coração Langendorff-perfundidos

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a ...

High-resolution Optical Mapping of the Mouse Sino-atrial Node

Sino-atrial node (SAN) dysfunctions and associated complications constitute important causes of morbidity in patients with cardiac diseases. The development of novel pharmacological therapies to cure these patients relies on the thorough understanding of both normal physiology and pathophysiology of the SAN. Among the studies of cardiac pacemaking, the mouse SAN is widely used due to its feasibility for modifications in the expression of different genes that encode SAN ion channels or calcium handling proteins. Emerging evidence from electrophysiological and histological studies has also proved the representativeness and similarity of the mouse SAN structure and functions to larger mammals, including the presence of specialized conduction pathways from the SAN to the atrium and a complex pacemakers' hierarchy within the SAN. Recently, the technique of optical mapping has greatly facilitated the exploration and investigation of the origin of excitation and conduction within and from the mouse SAN, which in turn has extended the understanding of the SAN and benefited clinical treatments of SAN dysfunction associated diseases. In this manuscript, we have described in detail how to perform the optical mapping of the mouse SAN from the intact, Langendorff-perfused heart and from the isolated atrial preparation. This protocol is a useful tool to enhance the understanding of mouse SAN physiology and pathophysiology.

Here, we present a protocol for optical mapping of electrical activity from the mouse right atrium and especially the sino-atrial node, at a high spatial and temporal resolution.

Avaliação eletrofisiológica de murino átrios com mapeamento óptico de alta resolução

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