Karen M. Qiang foi o destinatário de 2016 do George J. Schroepfer Research Award na Rice University. Fanli Zhou é o destinatário de uma bolsa de ensino da Universidade Rice. Os serviços do centro de estoque Drosophila Bloomington, instalação de viagem de Harvard, o centro de recursos de Drosophila Viena com gratidão são reconhecidos.

1. preparação de larvas
<ol><li>Dois ou mais dias antes do início do ensaio, configurar cruzes do desejado experimental e controlar as combinações (mínimas 20 fêmeas e 10 machos cada) em pratos do ovo a postura como descrito por Wieschaus e Nusslein-Volhard 13 mas usando polipropileno 50ml copos e pratos de Petri descartáveis 6,0 cm contendo ágar uva e manchado com fermento Cole imediatamente antes da utilização. Espantar moscas em pratos do ovo a postura na escuridão, à temperatura ambiente até que seja necessário.</li>
	<li>Receita de agar uva – combinar 100ml congelado 100% uva suco concentrado, 350 mL de água de deioinized, 5ml glacial acético e 13 g d. melanogaster ágar num copo de vidro de 1 L. Microondas em rajadas de 1-2 min, mexendo entre rajadas, até agar tudo é dissolvido. Esfriar a solução por alguns minutos, em seguida, adicionar 10 mL de 10% (p/v) de Nipagen (metil-p-hidroxibenzoato) em etanol a 95%. Mistura e, em seguida, pipeta 7 mL por placa em placas de Petri descartáveis 6,0 cm, permite ao gel e secar em temperatura ambiente por 3-4 h. loja a 4 0C em sacos plásticos.</li>
	<li>Colar de fermento receita – 7 g secas fermento, 10 mL de água desionizada, misture com uma espátula até consistência uniforme.</li>
	<li>Coleções de ovo cronometrado para gerar experimental e controlar as larvas. Usando novas, placas fermento-manchada, uvas, recolha os ovos à temperatura ambiente durante 4 h na escuridão durante horas da manhã. Remover estas placas de coleção de 4h e substituir com pratos frescos. Incubar as placas de coleção de 4h a noite no 25 0C, até a tarde do dia seguinte, quando a maioria das larvas será eclodiram. Coletar essas larvas de primeiro ínstar e usá-los para configurar o experimento.</li>
</ol>2. criação de placas de ensaio
<ol><li>Preparação de placas de ensaio. Para uma única execução do ensaio, prepare cinco placas ensaio cada de 10 larvas experimentais e cinco placas de 10 larvas de controle. Use uma broca de cortiça de 1,5 cm para remover um núcleo central de ágar de cada placa, criando um buraco para a comida. Coloque a pasta de fermento (0,8 - 0,9 g) no buraco e pat delicadamente com uma espátula para fazer um monte de encher o buraco.</li>
	<li>Preparação de placa de ágar – combinar 700 mL de água desionizada com ágar de d. melanogaster 16G num copo de vidro de 2 L e microondas por 5 min. Retire do microondas e agitar com uma vareta de vidro para trazer o ágar não dissolvido na solução. Adicione 17,5 mL de 10% (p/v) Nipagen em etanol a 95%, mistura, em seguida, continuar o aquecimento de microondas em 30 s rajadas seguido de agitação, até que todos os ágar é completamente dissolvido. Legal por um minuto ou dois, depois Pipete alíquotas de 15 mL para pratos de Petri plástico 10 cm. Permitir que agar para gel, cobrir as placas com as tampas e deixe-os secar à temperatura ambiente por algumas horas ou durante a noite. Placas de loja em sacos plásticos fechados a 18 ° C. Nota 1: Para evitar a formação de cristais de Nipagen na superfície das placas devido a dessiccation em excesso, use placas dentro de alguns dias de preparação. Se necessário, cristais podem ser re-dissolvidos pela queda de alguns microlitros de 95% de álcool para eles. Nota 2: lotes de ágar-ágar podem ter diferentes propriedades de coagulação. As placas de gel seco devem ser suficientemente resistente que um círculo limpo e intacto de ágar-ágar pode ser removido quando a broca de cortiça para criar o buraco de comida (veja acima) e firme ao toque.</li>
	<li>Criação de larvas em placas de ensaio. Use pressão mecânica para curvar a ponta de um microspatula de plástico e mergulhe a ponta no colar de levedura para fornecer "adesivo" para pegar as larvas. Pegar o primeiro ínstar larvas individualmente e colocá-los na placa de ágar-ágar, perto do monte de comida. Prepare pelo menos cinco placas replicar de 10 larvas para ambos experimental e genótipos de controle. Depois de concluído, cap e rotular cada placa e definir as placas (tampa para cima) em um espaço escuro e à temperatura ambiente (em nosso laboratório é de 22 ° C).</li>
</ol>3. monitoramento de placas de ensaio
<ol><li>Examinar placas diariamente sob um microscópio de dissecação e registrar o número de larvas sobre o alimento ou na superfície do agar. Observe qualquer visíveis larvas mortas ou moribundos. Observação quando e se, de encapsulamento para o substrato de ágar-ágar é visto como larvas mover em terceiro instar. Datas de observação no qual pupas começam a se formar e observe qualquer anormalidade pupal. Continue as observações diárias até que todas as larvas morreram ou puparam.</li>
	<li>Remova pupas cuidadosamente a placa com um dobrados provocando a agulha e transferir para um prato de uvas. Se desejar, continue a acompanhar pupas para determinar quantos eclose como adultos.</li>
</ol>4. preparação do ensaio as placas para a imagem latente
<ol><li>Retire cuidadosamente e descartar todos os alimentos de levedura no poço central de cada placa.</li>
	<li>Delicadamente, inundar cada placa com água da torneira e usar escova de pintura do artista macio cuidadosamente pulverize os restos que seguiu para a superfície do ágar. Substitua a água várias vezes e continuar uma escovadela suave, até que cada placa é completamente limpeza. Dar as placas um enxágue final com água desionizada, cap-los e deixar à temperatura ambiente durante a noite para secar. Nota: Encapsulamento sobre o agar é mais intenso em torno do monte de alimentos (ver Figura 2). Como resultado, a borda do furo comida geralmente é expandida para além da inicial 1,5 cm de diâmetro. Além disso, a fragilidade do ágar trabalhou nesta região pode causar pequenos pedaços de agar em túnel para ser perdidos desde a circunferência do buraco durante a limpeza. Aumentando a concentração de ágar gel poderia ajudar com esses problemas, mas as correções são possíveis durante as etapas de quantificação de imagem J (veja abaixo).</li>
</ol>5. quantificação de tunelamento
<ol><li>As placas da imagem. Prepare uma imagem de cada placa tomada contra um fundo preto, a fim de mostrar os túneis em agar como linhas brancas brilhantes. Nota: Nós usamos um sistema comumente usado para géis de DNA para esta etapa de imagem (consulte a tabela de materiais e reagentes). Alternativa sistemas capazes de gerar arquivos tiff, como câmeras digitais ou câmeras de telefone celular de imagens poderia ser ajustada para produzir imagens adequadas.</li>
	<li>Use o programa de domínio público NIH Image J para dosar larval de encapsulamento. Baixe o programa do http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html. Para obter mais informações sobre o programa acesse http://imagej.nih.gov/ij/docs/intro.html. Nota: Outros sistemas de imagem poderiam ser usados para dosar o encapsulamento. As seguintes instruções se aplicam a NIH Image J.</li>
	<li>Depois de abrir um arquivo de imagem tiff de uma placa de encapsulamento, use a ferramenta Oval para definir uma área para quantificação que representa a superfície do agar inteira mas culturas fora a borda plástica da placa.</li>
	<li>Aplica o limiar automático para produzir uma imagem reversa da placa, com os túneis mostrando como linhas pretas. Use o seletor de cores e ferramentas de pincel para branco qualquer áreas pretas que representam danos para o ágar-ágar, ao invés de túneis.</li>
	<li>Sob o menu pull-down Analyze , selecione escala de conjunto | Clique para remover o tártaro e em seguida na janela definir medidas (também em Analyze), verifique a área e limite ao limiar.</li>
	<li>Pressione a tecla CTRL + tecla M para mostrar a área preta (túneis) em pixels.</li>
	<li>Copie e cole o valor de pixel para cada placa é em um programa de planilha (como o Excel) que permitirá a análise quantitativa.</li>
	<li>O furo central geralmente é ampliado devido ao tunelamento intensa nesta região. Para dosar o tunelamento faltando, desmarque a opção "Limitar ao limiar" e usar a ferramenta varinha para definir o furo central. Pressione a tecla CTRL + tecla M para obter o valor de pixel desta área. Subtrair esse valor, o valor de pixel de um buraco de 1,5 cm e adicione a diferença para o encapsulamento valor obtido na etapa 5.6.</li>
	<li>Para algumas placas, o furo central pode estar faltando um pedaço de ágar encapsulado que inclui uma região de ágar untunneled adjacente para o buraco. Quando dosar o furo central para o uso dessas placas o seletor de cores e pintura escovam ferramentas para adicionar uma barra preta em toda a região falta definir região encapsulada e excluir a área de não-tunelizado de quantificação. Nota 1: Se as larvas experimentais realizar qualquer encapsulamento, esta quantificação permite o cálculo da média de valores para conjuntos de placas e comparação estatística de controle e experimental de encapsulamento.</li>
</ol>

<ol>
	<li>O'Farrell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+responses+to+oxygen+deprivation.">Conserved responses to oxygen deprivation.</a> J. Clin. Invest. 107 (6), 671-673 (2001).</li><li>Lavista-Llanos, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+the+hypoxic+response+in+D.+melanogaster+by+the+basic+helix-loop-helix+pas+protein+Similar.">Control of the hypoxic response in D. melanogaster by the basic helix-loop-helix pas protein Similar.</a> Mol. Cell. Biol. 22 (19), 6842-6853 (2002).</li><li>Reiling, J. H., Hafen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hypoxia-induced+paralogs+Scylla+and+Charybdis+inhibit+growth+by+down-regulating+S6K+activity+upstream+of+Tsc+in+D.+melanogaster.">The hypoxia-induced paralogs Scylla and Charybdis inhibit growth by down-regulating S6K activity upstream of Tsc in D. melanogaster.</a> Genes Dev. 18 (23), 2879-2892 (2004).</li><li>Gorr, T. A., Gassmann, M., Wappner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensing+and+responding+to+hypoxia+via+Hif+in+model+invertebrates.">Sensing and responding to hypoxia via Hif in model invertebrates.</a> J. Insect Physiol. 52 (4), 349-364 (2006).</li><li>Romero, N. M., Dekanty, A., Wappner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+developmental+adaptations+to+hypoxia:+A+D.+melanogaster+perspective.">Cellular and developmental adaptations to hypoxia: A D. melanogaster perspective.</a> Meth. Enzymol. 435, 123-144 (2007).</li><li>Dijkers, P. F., O'Farrell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+a+hypoxia-induced,+nitric+oxide-mediated+signaling+cascade.">Dissection of a hypoxia-induced, nitric oxide-mediated signaling cascade.</a> Mol. Biol.Cell. 20 (18), 4083-4090 (2009).</li><li>Zhou, F., Qiang, K. M., Beckingham, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Failure+to+burrow+and+tunnel+reveals+roles+for+jim+lovell+in+the+growth+and+endoreplication+of+the+D.+melanogaster+larval+tracheae.">Failure to burrow and tunnel reveals roles for jim lovell in the growth and endoreplication of the D. melanogaster larval tracheae.</a> PLOS ONE. 11, e0160233 (2016).</li><li>Wingrove, J. A., O'Farrell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+contributes+to+behavioral,+cellular,+and+developmental+responses+to+low+oxygen+in+D.+melanogaster.">Nitric oxide contributes to behavioral, cellular, and developmental responses to low oxygen in D. melanogaster.</a> Cell. 98 (1), 105-114 (1999).</li><li>Zhang, L., Ward, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uninflatable+encodes+a+novel+ectodermal+apical+surface+protein+required+for+tracheal+inflation+in+D.+melanogaster.">Uninflatable encodes a novel ectodermal apical surface protein required for tracheal inflation in D. melanogaster.</a> Dev. Biol. 336 (2), 201-212 (2009).</li><li>Langlais, K. K., Stewart, J. A., Morton, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preliminary+characterization+of+two+atypical+soluble+guanylyl+cyclases+in+the+central+and+peripheral+nervous+system+of+D.+melanogaster+melanogaster.">Preliminary characterization of two atypical soluble guanylyl cyclases in the central and peripheral nervous system of D. melanogaster melanogaster.</a> J. Expt. Biol. 207 (13), 2323-2338 (2004).</li><li>Morton, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+responses+to+hypoxia+and+hyperoxia+in+D.+melanogaster+larvae.">Behavioral responses to hypoxia and hyperoxia in D. melanogaster larvae.</a> Fly. 5 (2), 119-125 (2011).</li><li>Brand, A., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li><li>Wieschaus, E., Nusslein-Volhard, C., Roberts, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Looking+at+embryos.">Looking at embryos.</a> Drosophila: a practical approach. , 199-227 (1986).</li><li>Callier, V., Shingleton, A. W., Brent, C. S., Ghosh, S. M., Kim, J., Harrison, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+reduced+oxygen+in+the+developmental+physiology+of+growth+and+metamorphosis+initiation+in+D.+melanogaster.">The role of reduced oxygen in the developmental physiology of growth and metamorphosis initiation in D. melanogaster.</a> J. Expt. Biol. 216 (23), 4334-4340 (2013).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hif-+and+non-Hif-regulated+hypoxic+responses+require+the+estrogen-related+receptor+in+D.+melanogaster.">Hif- and non-Hif-regulated hypoxic responses require the estrogen-related receptor in D. melanogaster.</a> PLoS genetics. 9 (1), e1003230 (2013).</li><li>Grifoni, D., Sallazzo, M., Fontana, E., Froldi, F., Pession, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+strategies+of+oxygen+supply+in+Drosophila+malignancies+identify+tracheogenesis+as+a+novel+cancer+hallmark.">Multiple strategies of oxygen supply in Drosophila malignancies identify tracheogenesis as a novel cancer hallmark.</a> Scient. Rep. 5 (9061), (2015).</li></ol>

Os autores declaram que têm sem interesses financeiros concorrentes.

Apresentamos aqui um ensaio simples, desenvolvido para detectar hipoxia do tecido em larvas de d. melanogaster . Diagnóstico baseia-se na diminuição da burrowing montes de comida no início da vida larval e a ausência de substratos de encapsulamento mais tarde na vida larval. Apinhamento larval pode causar migração prematura longe de uma fonte de alimento e, portanto, um aspecto crítico do ensaio é que um pequeno número de larvas é doseado na presença de um grande excesso de comida. Inclusão de benzoato de hidroxila de metil-p o fungicida (Nipagen) para as placas de ágar também é essencial para evitar o crescimento de fungos durante o ensaio.
Achamos que as placas de ágar-ágar podem ser uma fonte de variabilidade no ensaio. Normalmente, as larvas do mesmo genótipo, de lotes diferentes dos pais, ou de diferentes coleções de larvas, mostram variação relativamente limitada em seu comportamento no ensaio. Em contraste, placas de ágar feitas em dias diferentes ou com diferentes lotes de ágar-ágar podem produzir diferenças no encapsulamento. Uma condição é, portanto, que o controle e larvas experimentais devem todos ser testadas usando placas de ágar da mesma preparação de lote. Agar de fabricantes diferentes ou mesmo transferências da mesma fabricação podem variar em sua força de gelificação, e então pode ser necessário o ajuste da concentração de ágar para cima dos 2.2% usada aqui para alcançar um gel ideal. Nós achamos que as larvas do tipo selvagem podem prontamente esburacam géis de ágar de 3%.
Para demonstrar o valor deste teste, nós usamos isso para investigar potenciais hipóxia do tecido em larvas com função suprimida de uninflatable nos tracheae. Nossas descobertas fornecem forte apoio para a hipótese de que a perda de expressão traqueal deste gene pode produzir hipóxia: btl-Gal4 > UAS -uif RNAi larvas mostraram falta de burrow na comida e ausência completa de substratos de encapsulamento durante o terceiro ínstar. Em nossos estudos anteriores de outros genótipos, observamos que perda induzida por hipóxia de escoar-se comida não é tão completa quanto a perda de substrato de encapsulamento e a btl-Gal4 > UAS -uif RNAi larvas estudaram aqui se comportou da mesma forma. O componente de encapsulamento falhado deste teste, portanto, fornece a mais forte indicação de hipóxia.
Embora o btl-Gal4 > uif RNAi larvas mostraram características comportamentais diagnóstico de hipóxia, a corte(ue)-Gal4 > UAS -uif RNAi não apresentam essas anormalidades. A btl e cortar(ue), Gal4 motoristas são expressos em diferentes fases e em padrões diferentes, dentro os tracheae larval. A btl-Gal4 motorista é expressa por todo o sistema traqueal, a partir de seu desenvolvimento na embriogênese e continuar com vida larval. Em contraste, Gal4 expressão das cortar(ue)-Gal4 driver só começa no final da vida embrionária, depois da morfogênese dos tracheae e limita-se às seções de extrema posteriores dos troncos dorsais, os principais vasos longitudinais de o sistema traqueal. UIF nocaute com esta linha de Gal4 não pode, portanto, reduzir a expressão uif suficientemente cedo ou amplamente suficiente para produzir algum nível de limiar de hipoxemia necessária para acionar os comportamentos medidos neste ensaio.
Um estudo prévio encontrado que terceiro ínstar larvas expostas a baixos níveis de oxigênio (10%) mostram diminuição do crescimento e atrasou o início da pupariation 14. A btl-Gal4 > UAS -uif RNAi larvas estudadas aqui apuraram-se para o terceiro instar, mas os efeitos sobre suas taxas de crescimento e pupa foram mais pronunciados: eram consideravelmente menores do que controles com muito pouco tecido adiposo, sob a a tentativa de epiderme (Figura 3) e apenas uma pequena fração (~ 10%) pupariation. Estas diferenças sugerem a btl-Gal4 > UAS -uif RNAi larvas experimentaram um maior grau de hipóxia, uif nocaute nos tracheae esteve presente ao longo de toda a sua vida larval, ou porque produzia mais grave falta de oxigenação no terceiro ínstar. Como perda da função uif nos tracheae pode impedir o transporte de oxigênio é clara neste ponto. Os tracheae da btl-Gal4 > UAS -uif RNAi larvas foram prontamente visíveis através da cutícula (Figura 3), uma indicação de que eles continham ar e não foram danificados ao ponto de que a entrada de fluido comprometido função. É formalmente possível, portanto, que o dano traqueal criado por perda da função uif não provocar hipóxia mas prefiro algum outro defeito que inibe o encapsulamento. Para os genótipos estudados anteriormente, determinamos que falha ao túnel está associada a níveis elevados de LDH mRNA7, o indicador canônico da glicólise e hipoxia em tarde terceiro ínstar larvas 15. Assim, a confirmação final de hipóxia para o btl-Gal4 > UAS -uif RNAi larvas (e em larvas examinadas no futuro usar deste teste) envolveria a RT-PCR para avaliar os níveis do mRNA LDH ou a utilização de um indicador disponível comercialmente para medir níveis de oxigênio intracelular (por exemplo ver 16).

A sofisticada matriz de ferramentas de genéticas moleculares disponíveis no d. melanogaster torná-lo um organismo valioso para o estudo de processos biológicos evolutivamente conservados. Chaves moleculares respostas a disponibilidade de oxigênio provaram ser conservadas através de evolução e estudos prévios no d. melanogaster geraram insights sobre os componentes universais destas vias 1,2, a sinalização 3,4,5,6.
Como parte de um estudo visto dissecando a função do neurônio sensorial em larvas de d. melanogaster , identificamos duas respostas comportamentais que provou ser ativado por hipóxia do tecido em níveis de oxigênio normal 7. Uma destas, incapacidade de burrow na comida, é altamente relacionada com a resposta a baixos níveis de oxigênio relatado por Wingrove e O'Farrell 8. O segundo comportamento, falha para cavar um túnel em um substrato macio durante a tarde ínstar terceiro vagando fase, tinha não foi anteriormente identificado como hipóxia-relacionados. Determinamos que expondo tipo selvagem errante larvas para baixos níveis de oxigênio também inibe a substratos de encapsulamento 7, estabelecendo assim que ambos esses comportamentos se originam de hipóxia - ou induzida por dano tecidual ou níveis de consumo de oxigênio baixa. Aqui descrevemos um ensaio que desenvolvemos para dosar estes dois comportamentos induzida por hipóxia, que se inicia com observações imediatamente após a eclosão de larvas.
Hipóxicos respostas nos estágios larvais iniciais não foram examinadas anteriormente e, portanto, realizar uma análise ao longo da vida larval é um componente valioso de nosso ensaio. A maioria das manifestações óbvias da hipóxia – desenvolvimento lento crescimento pobre e lentidão do aparelho locomotor – se sobrepõem com fenótipos larvas produzidos por muitas mutações. Mas achamos que só terceiro ínstar larvas com hipoxia mostram um completo fracasso para cavar um túnel 7. Assim, determinamos que larvas ainda mais comprometida em termos de crescimento e de locomoção do que nossas larvas hipóxicos, ainda realizado um encapsulamento, Considerando que larvas hipóxicos nunca fez um túnel 7. Outro elemento valioso neste ensaio é, assim, que fornece uma maneira de estabelecer quando hipóxia é a fonte de um determinado conjunto de fenótipos pleiotrópicos, ao contrário de alguns outros stress ou mau funcionamento metabólico. Como uma demonstração do ensaio, aqui descrevemos seu uso em caracterizar as respostas de larvas com reduzida expressão traqueal de uninflatable, um gene que funciona na vias aéreas larval 9.
Prevemos que este ensaio será de valor para os pesquisadores envolvidos em caracterizando larvas fenótipos que incluem comportamento lento e crescimento pobre. Como resultado, novos genes que influenciam a distribuição, uso ou respostas, oxigênio por todo o corpo pode ser identificado. Além disso, incorporando este ensaio em um protocolo de triagem de mutante forneceria uma rota direta para identificar as mutações que produzem hipóxia. Este ensaio também será valioso na análise dos circuitos que provoca os comportamentos inatos induzida por hipóxia, descritos aqui. Análise de rede neural deste tipo é um foco de muita pesquisa atual e o sistema nervoso simples da larva d. melanogaster é um sistema valioso para comportamentos automatizados de dissecação. Neurônios sensoriais envolvidos na percepção de oxigênio larval já foram identificados, proporcionando um primeiro passo para definir o circuito completo para respostas induzida por hipóxia 10,11. Usando nosso ensaio em combinação com nocaute neural seletiva através do sistema de GAL4-UAS12 é uma rota clara para delinear ainda mais componentes da rede neural.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="890">
	
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">REAGENTS</td>
			<td style="width:223px;"></td>
			<td style="width:117px;"></td>
			<td style="width:295px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dehydrated yeast&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Frozen grape juice concentrate</td>
			<td>Welch&#39;s</td>
			<td></td>
			<td>&#160;Available at most large supermarkets</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glacial acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>320099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Drosophila agar</td>
			<td>Apex Bioresearch Products</td>
			<td>66-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methyl-para-hydroxybenzoate</td>
			<td>Apex Bioresearch Products</td>
			<td>20-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EQUIPMENT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50 ml polypropylene beakers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6.0 cm disposable Petri dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>08757100B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10 cm disposable plastic Petri dishes</td>
			<td>E+K Scientific</td>
			<td>EK-24104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plastic microspatulas</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bent teasing needle</td>
			<td>Nasco</td>
			<td>S08848MH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissecting microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any microscope with 10-30X magnification</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a burrowing/tunneling assay for detection of hypoxia in drosophila melanogaster larvae

Privação de oxigênio em animais pode resultar da exposição a níveis baixos de oxigênio atmosférico ou de danos nos tecidos internos que interfere com a distribuição de oxigénio. Também é possível que comportamento aberrante de neurônios de sensor de oxigênio poderia induzir o comportamento de hipoxia na presença de níveis de oxigênio normal. No d. melanogaster, desenvolvimento em baixos níveis de oxigênio resulta em inibição de crescimento e comportamento lento durante as fases larvais. No entanto, essas manifestações estabelecidas de déficit de oxigênio se sobrepõem consideravelmente com os fenótipos de muitas mutações que regulam o crescimento, respostas de stress ou de locomoção. Como resultado, não há atualmente nenhum ensaio disponível para identificar hipóxia i) celular induzida por uma mutação ou ii) hipóxia comportamento quando induzida pelo comportamento neuronal anormal.
Recentemente, nós identificamos dois comportamentos distintos em larvas de d. melanogaster que ocorrem em níveis normais de oxigênio em resposta à detecção interna de hipóxia. Em primeiro lugar, em todas as fases, tais larvas evitar burrowing comida, muitas vezes se afastar muito longe de uma fonte de alimento. Em segundo lugar, encapsulamento em um substrato macio, que normalmente ocorre durante a terceira fase de ínstar errante é completamente abolido se as larvas são hipóxicos. O ensaio descrito aqui é projetado para detectar e quantificar esses comportamentos e, portanto, fornecer uma maneira para detectar hipoxia induzida por danos internos ao invés de baixo oxigênio externo. Placas de ensaio com um substrato de ágar e um plug central de massa de levedura são utilizadas para apoiar os animais através de vida larval. As posições e estado das larvas são controlados diariamente como proceder do primeiro ao terceiro ínstar. A extensão do túnel para o substrato de ágar durante fase errante é quantificada após a pupação usando NIH ImageJ. O ensaio será de valor na determinação de quando a hipóxia é um componente de um fenótipo mutante e, portanto, fornecer informações sobre possíveis locais de ação do gene em questão.

Como uma demonstração do valor deste teste que utilizámos para investigar potencial hipóxia em larvas com compromisso da função do gene uninflatable (uif) nos tracheae. UIF codifica uma proteína transmembrana grande que fortemente se expressa na superfície apical das células traqueais larvas. Mutantes de uif anteriormente foram anotados para expor o comportamento aberrante que possa indicar hipóxia do tecido devido a mau funcionamento traqueal 9. Nós especificamente suprimida expressão uif na traqueia larval usando o sistema de Gal4-UAS. Gal4 duas linhas foram utilizadas: i) sem fôlego (btl)-Gal4, que se expressa fortemente nos tracheae desde o início do seu desenvolvimento embrionário e ii) corte(ue)-Gal4, que começa a expressão em uma pequena região posterior de os tracheae tronco dorsal principal no final da embriogênese e continua forte expressão nesta região ao longo da vida larval 7. Um UAS -uif RNAi linha foi obtido a partir do centro de pesquisas de drosófila de Viena (VDRC ID #1050).
Conforme descrito no protocolo acima, cinco replicar placas de recém-eclodidos primeiro ínstar larvas foram criadas para cada um dos quatro cruzes como segue.
Experimento 1 1) controle 1 - corte(ue)-Gal4 x Cantão-S (+) 2) Experimental 1 - corte(ue)-Gal4 x UAS-uif RNAi
Experimento 2 3) controle 2 - btl-Gal4 x Cantão-S (+) 4) Experimental 2 - btl-x UAS-Gal4uif RNAi
O comportamento de corte(ue)-Gal4 > UAS -uif RNAi larvas do experimento 1 foi comparável de controle corte(ue)-Gal4 > + animais em termos de burrowing, encapsulamento e sobrevivência de pupa, (Figura 1 e Figura 2). Em contraste, para baixo-regulação uif expressão em todo o sistema traqueal no início do desenvolvimento (experimento 2) produziu respostas marcadamente diferentes. A btl-Gal4 > UAS -uif RNAi larvas exibidos ambas as manifestações comportamentais de hipóxia do tecido – reduzida comida burrowing e uma total ausência de substratos de encapsulamento mais tarde na vida larval (Figura 1 e Figura 2 de ). As larvas experimentais foram também visivelmente menor, mais fino e mais lento do que controles (Figura 3) e mostraram uma alta taxa de mortalidade no decorrer do ensaio. Como discutido acima, redução do crescimento, a lentidão e a morte são conhecidos sintomas de hipóxia larval. Além disso, a maioria das larvas experimentais falhou a tentativa de pupa e permaneceu como terceiro estádio larvas longas depois de larvas controle tinham puparam. Algumas larvas sobreviveram mais de 15 dias antes de eventualmente morrer sem pupating (figura 1A). Algumas das larvas experimentais tentaram empupar, mas em todos os casos anormais pupas foram formadas que não gerou adultos viáveis.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57131/57131fig1.jpg"> Figura 1. Quantificação de desenvolvimento larval e burrowing de comida. (A) percentagem de larva viva fora dos montes de comida para os quatro genótipos estudados aqui. As médias para as placas de cinco ensaio utilizadas para cada genótipo são mostradas. De dia 3, após a eclosão, ~ 70% do btl-Gal4 > larvas de RNAi UAS uif estavam fora a comida, Considerando que não há larvas foram detectadas fora a comida ou à superfície do agar para os outros três genótipos. A btl-Gal4 > larvas de RNAi UAS uif morrem lentamente entre os dias 4-20, com ~ 15% deles ainda vivos 15 dias após a eclosão. A seta preta ao longo do eixo x aqui e em (B) indica o dia pelo qual todas as larvas de outros três genótipos tinham puparam. (B) porcentagem de larvas mortas visíveis fora o alimento para os quatro genótipos. As médias para as placas de ensaio de cinco para cada genótipo são mostradas. Morto btl-Gal4 > larvas de RNAi UAS uif acumulam com o tempo, com a maioria morrendo lá fora a comida. Os outros genótipos que todos sobreviver a pupa (C) porcentagem de sobrevivência de pupa para os quatro genótipos estudados. As médias para as placas de ensaio de cinco para cada genótipo são mostradas. Não normais pupas da btl-Gal4 > genótipo de RNAi UAS uif foram produzidos. Barras de erro em toda a figura representam SEMs. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57131/57131fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57131/57131fig2.jpg"> Figura 2. Quantificação de tunelamento larval. (A) exemplos das placas de ensaio para todos os quatro genótipos estudaram após preparação para quantificação de encapsulamento. Observe a ausência completa de tunelamento para a btl-Gal4 > larvas de RNAi UAS uif . Placas de ensaio são as placas de Petri de 10 cm. (B) a quantificação de encapsulamento derivado Image J para os quatro genótipos. Pixel valores médios para as placas de ensaio de cinco para cada genótipo. Sem encapsulamento foi observado para o btl-Gal4 > larvas de RNAi UAS uif . Barras de erro = SEMs. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57131/57131fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57131/57131fig3.jpg"> Figura 3. Comparação de btl-Gal4 > UAS uif RNAi e btl-Gal4 > + larvas Larvas de idade semelhante (6º dia após a eclosão) para o btl-Gal4 > UAS uif RNAi (A) e btl-Gal4 > + b genótipos. Setas vermelhas apontam para os tracheae dorsal do tronco. Ambas as larvas fotografadas na mesma ampliação. Barra de escala = 0,5 mm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57131/57131fig3large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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A Burrowing/Tunneling Assay for Detection of Hypoxia in Drosophila melanogaster Larvae

O protocolo descreve um ensaio simples para identificar larvas de Drosophila melanogaster que estão enfrentando a hipóxia sob os níveis de oxigénio atmosférico normal. Este protocolo permite hipóxicos larvas ser distinguido de outros mutantes que mostram fenótipos sobrepostos como lentidão ou crescimento lento.

Um ensaio de buraqueira/Tunneling para deteção de hipóxia em larvas de Drosophila melanogaster

Oxygen deprivation in animals can result from exposure to low atmospheric oxygen levels or from internal tissue damage that interferes with oxygen ...

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Research

JoVE Journal

Behavior

A Burrowing/Tunneling Assay for Detection of Hypoxia in Drosophila melanogaster Larvae

7.7K visualizações.  Rice University. O protocolo descreve um ensaio simples para identificar larvas de Drosophila melanogaster que estão enfrentando a hipóxia sob os níveis de oxigénio atmosférico normal. Este protocolo permite hipóxicos larvas ser distinguido de outros mutantes que mostram fenótipos sobrepostos como lentidão ou crescimento lento.

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A Procedure to Study the Effect of Prolonged Food Restriction on Heroin Seeking in Abstinent Rats

In human drug addicts, exposure to drug-associated cues or environments that were previously associated with drug taking can trigger relapse during abstinence. Moreover, various environmental challenges can exacerbate this effect, as well as increase ongoing drug intake.
The procedure we describe here highlights the impact of a common environmental challenge, food restriction, on drug craving that is expressed as an augmentation of drug seeking in abstinent rats.
Rats are implanted with chronic intravenous i.v. catheters, and then trained to press a lever for i.v. heroin over a period of 10-12 days. Following the heroin self-administration phase the rats are removed from the operant conditioning chambers and housed in the animal care facility for a period of at least 14 days. While one group is maintained under unrestricted access to food (sated group), a second group (FDR group) is exposed to a mild food restriction regimen that results in their body weights maintained at 90% of their nonrestricted body weight. On day 14 of food restriction the rats are transferred back to the drug-training environment, and a drug-seeking test is run under extinction conditions (i.e.&#160;lever presses do not result in heroin delivery).
The procedure presented here results in a highly robust augmentation of heroin seeking on test day in the food restricted rats. In addition, compared to the acute food deprivation manipulations we have used before, the current procedure is a more clinically relevant model for the impact of caloric restriction on drug seeking. Moreover, it might be closer to the human condition as the rats are not required to go through an extinction-training phase before the drug-seeking test, which is an integral component of the popular reinstatement procedure.

A procedure that allows a demonstration of robust augmentation of drug seeking in food-restricted rats is described. Following heroin self-administration training, rats go through an abstinence period, in a drug-free environment, during which they are mildly food restricted. Drug seeking is then tested in the drug-associated environment.

Um procedimento para estudar o efeito da restrição alimentar prolongada em heroína Buscando em ratos abstinentes

In human drug addicts, exposure to drug-associated cues or environments that were previously associated with drug taking can trigger relapse during ...

Comportamento

A Procedure to Observe Context-induced Renewal of Pavlovian-conditioned Alcohol-seeking Behavior in Rats

Environmental contexts in which drugs of abuse are consumed can trigger craving, a subjective Pavlovian-conditioned response that can facilitate drug-seeking behavior and prompt relapse in abstinent drug users. We have developed a procedure to study the behavioral and neural processes that mediate the impact of context on alcohol-seeking behavior in rats. Following acclimation to the taste and pharmacological effects of 15% ethanol in the home cage, male Long-Evans rats receive Pavlovian discrimination training (PDT) in conditioning chambers. In each daily (Mon-Fri) PDT session, 16 trials each of two different 10 sec auditory conditioned stimuli occur. During one stimulus, the CS+, 0.2 ml of 15% ethanol is delivered into a fluid port for oral consumption. The second stimulus, the CS-, is not paired with ethanol. Across sessions, entries into the fluid port during the CS+ increase, whereas entries during the CS- stabilize at a lower level, indicating that a predictive association between the CS+ and ethanol is acquired. During PDT each chamber is equipped with a specific configuration of visual, olfactory and tactile contextual stimuli. Following PDT, extinction training is conducted in the same chamber that is now equipped with a different configuration of contextual stimuli. The CS+ and CS- are presented as before, but ethanol is withheld, which causes a gradual decline in port entries during the CS+. At test, rats are placed back into the PDT context and presented with the CS+ and CS- as before, but without ethanol. This manipulation triggers a robust and selective increase in the number of port entries made during the alcohol predictive CS+, with no change in responding during the CS-. This effect, referred to as context-induced renewal, illustrates the powerful capacity of contexts associated with alcohol consumption to stimulate alcohol-seeking behavior in response to Pavlovian alcohol cues.

A procedure to study the capacity of an alcohol associated environmental context to trigger the renewal of alcohol-seeking behavior in rats is described.

Um procedimento para Observar Renovação induzida por Contexto de pavloviano condicionado Comportamento Álcool-seeking em Ratos

Environmental contexts in which drugs of abuse are consumed can trigger craving, a subjective Pavlovian-conditioned response that can facilitate ...

The Social Dimension of Stress: Experimental Manipulations of Social Support and Social Identity in the Trier Social Stress Test

In many situations humans are influenced by the behavior of other people and their relationships with them. For example, in stressful situations supportive behavior of other people as well as positive social relationships can act as powerful resources to cope with stress. In order to study the interplay between these variables, this protocol describes two effective experimental manipulations of social relationships and supportive behavior in the laboratory. In the present article, these two manipulations are implemented in the Trier Social Stress Test (TSST)&#8212;a standard stress induction paradigm in which participants are subjected to a simulated job interview. More precisely, we propose (a) a manipulation of the relationship between different protagonists in the TSST by making a shared social identity salient and (b) a manipulation of the behavior of the TSST-selection committee, which acts either supportively or unsupportively. These two experimental manipulations are designed in a modular fashion and can be applied independently of each other but can also be combined. Moreover, these two manipulations can also be integrated into other stress protocols and into other standardized social interactions such as trust games, negotiation tasks, or other group tasks.

Previous research on the social dimension of stress has focused on two important variables: social identity and social support. This protocol introduces an effective experimental manipulation of these two social variables and describes their implementation in a standard stress induction paradigm (Trier Social Stress Test).

A Dimensão Social do Stress: Manipulações experimentais de apoio social e de identidade social no Trier Social Stress Teste

In many situations humans are influenced by the behavior of other people and their relationships with them. For example, in stressful situations ...

Automatic Detection of Highly Organized Theta Oscillations in the Murine EEG

Theta activity is generated in the septohippocampal system and can be recorded using deep intrahippocampal electrodes and implantable electroencephalography (EEG) radiotelemetry or tether system approaches. Pharmacologically, hippocampal theta is heterogeneous (see dualistic theory) and can be differentiated into type I and type II theta. These individual EEG subtypes are related to specific cognitive and behavioral states, such as arousal, exploration, learning and memory, higher integrative functions, etc. In neurodegenerative diseases such as Alzheimer&#39;s, structural and functional alterations of the septohippocampal system can result in impaired theta activity/oscillations. A standard quantitative analysis of the hippocampal EEG includes a Fast-Fourier-Transformation (FFT)-based frequency analysis. However, this procedure does not provide details about theta activity in general and highly-organized theta oscillations in particular. In order to obtain detailed information on highly-organized theta oscillations in the hippocampus, we have developed a new analytical approach. This approach allows for time- and cost-effective quantification of the duration of highly-organized theta oscillations and their frequency characteristics.

Theta activity in the hippocampus is related to specific cognitive and behavioral stages. Here, we describe an analytical method to detect highly-organized theta oscillations within the hippocampus using a time-frequency (i.e., wavelet analysis)-based approach.

Detecção automática de altamente organizada Oscilações Theta no Murino EEG

Theta activity is generated in the septohippocampal system and can be recorded using deep intrahippocampal electrodes and implantable ...

A Method to Test the Effect of Environmental Cues on Mating Behavior in Drosophila melanogaster

An individual's sexual drive is influenced by genotype, experience and environmental conditions. How these factors interact to modulate sexual behaviors remains poorly understood. In Drosophila melanogaster, environmental cues, such as food availability, affect mating activity offering a tractable system to investigate the mechanisms modulating sexual behavior. In D. melanogaster, environmental cues are often sensed via the chemosensory gustatory and olfactory systems. Here, we present a method to test the effect of environmental chemical cues on mating behavior. The assay consists of a small mating arena containing food medium and a mating couple. The mating frequency for each couple is continuously monitored for 24 h. Here we present the applicability of this assay to test environmental compounds from an external source through a pressurized air system as well as manipulation of the environmental components directly in the mating arena. The use of a pressurized air system is especially useful to test the effect of very volatile compounds, while manipulating components directly in the mating arena can be of value to ascertain a compound's presence. This assay can be adapted to answer questions about the influence of genetic and environmental cues on mating behavior and fecundity as well as other male and female reproductive behaviors.

A Method to Test the Effect of Environmental Cues on Mating Behavior in Drosophila melanogaster

We demonstrate an assay to analyze the environmental and genetic cues that influence mating behavior in the fruit fly Drosophila melanogaster.

Um método para testar o efeito de sugestões ambientais no comportamento de acoplamento em<em&gt; Drosophila melanogaster</em

An individual's sexual drive is influenced by genotype, experience and environmental conditions. How these factors interact to modulate sexual behaviors ...

An Automated Rapid Iterative Negative Geotaxis Assay for Analyzing Adult Climbing Behavior in a Drosophila Model of Neurodegeneration

Neurodegenerative diseases are frequently associated with a progressive loss of movement ability, reduced life span, and age-dependent neurodegeneration. To understand the mechanism of these cellular events, and their causal relationships with each other, Drosophila melanogaster, with its sophisticated genetic tools and diverse behavioral features, are used as disease models for assessing neurodegenerative phenotypes. Here we describe a high-throughput method to analyze Drosophila adult negative geotaxis behavior, as an indication for possible motor defects associated with neurodegeneration. An automated machine is designed and developed to drive fly synchronization using an initial electric impulse, later allowing the recording of negative geotaxis behavior over a course of secs to mins. Images from the digitally recorded video are then processed with the self-designed RflyDetection software for statistical data manipulation. Different from the manually controlled negative geotaxis assay based on single fly, this precise, fast, and high-throughput protocol allows data acquisition from more than hundreds of flies simultaneously, providing an efficient approach to advance our understanding in the underlying mechanism of locomotor deficits associated with neurodegeneration.

An Automated Rapid Iterative Negative Geotaxis Assay for Analyzing Adult Climbing Behavior in a Drosophila Model of Neurodegeneration

This step-by-step protocol analyzes Drosophila negative geotaxis behavior using an automated multi-cylinder system that hosts hundreds of flies and synchronizes their action by an electric motor. Upon synchronization, fly negative geotaxis behavior is assayed, digitally recorded, and analyzed using the self-designed RflyDetection software.

Um ensaio automatizado rápida iterativo Geotaxis negativo para analisar o comportamento de adultos de escalada em um modelo de drosófila de neurodegeneração

Neurodegenerative diseases are frequently associated with a progressive loss of movement ability, reduced life span, and age-dependent neurodegeneration. ...

High-Throughput Method for Measuring Alcohol Sedation Time of Individual Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster provides an excellent model to study the genetic underpinnings of alcohol sensitivity. In contrast to studies in human populations, the Drosophila model allows strict control over genetic background, and virtually unlimited numbers of individuals of the same genotype can be reared rapidly under well-controlled environmental conditions without regulatory restrictions and at relatively low cost. Flies exposed to ethanol undergo physiological and behavioral changes that resemble human alcohol intoxication, including loss of postural control, sedation, and development of tolerance. Here, we describe a simple, low-cost, high-throughput assay for assessing alcohol sedation sensitivity in large numbers of single flies. The assay is based on video recording of single flies introduced without anesthesia in 24-well cell culture plates in a set-up that enables synchronous initiation of alcohol exposure. The system enables a single person to collect individual ethanol sedation data on as many as 2,000 flies within an 8 h work period. The assay can, in principle, be extended to assess the effects of exposure to any volatile substance and applied to measure effects of acute toxicity of volatiles on other insects, including other fly species.

High-Throughput Method for Measuring Alcohol Sedation Time of Individual Drosophila melanogaster

Current methods to measure alcohol sensitivity in Drosophila are designed to test groups of flies. We present a simple, low-cost, high-throughput assay for assessing alcohol sedation sensitivity in large numbers of single flies. The method does not require specialized tools and can be performed in any laboratory using common materials.

Método de alta duração para medir o tempo de sedação de álcool de melanogaster individual drosophila

Drosophila melanogaster provides an excellent model to study the genetic underpinnings of alcohol sensitivity. In contrast to studies in human ...

An Improved Assay and Tools for Measuring Mechanical Nociception in Drosophila Larvae

Published assays for mechanical nociception in Drosophila have led to variable assessments of behavior. Here, we fabricated, for use with Drosophila larvae, customized metal nickel-titanium alloy (nitinol) filaments. These mechanical probes are similar to the von Frey filaments used in vertebrates to measure mechanical nociception. Here, we demonstrate how to make and calibrate these mechanical probes and how to generate a full behavioral dose-response from subthreshold (innocuous or non-noxious range) to suprathreshold (low to high noxious range) stimuli. To demonstrate the utility of the probes, we investigated tissue damage-induced hypersensitivity in Drosophila larvae. Mechanical allodynia (hypersensitivity to a normally innocuous mechanical stimulus) and hyperalgesia (exaggerated responsiveness to a noxious mechanical stimulus) have not yet been established in Drosophila larvae. Using mechanical probes that are normally innocuous or probes that typically elicit an aversive behavior, we found that Drosophila larvae develop mechanical hypersensitization (both allodynia and hyperalgesia) after tissue damage. Thus, the mechanical probes and assay that we illustrate here will likely be important tools to dissect the fundamental molecular/genetic mechanisms of mechanical hypersensitivity.

An Improved Assay and Tools for Measuring Mechanical Nociception in Drosophila Larvae

The goal of this protocol is to show how to perform an improved assay for mechanical nociception in Drosophila larvae. We use the assay here to demonstrate that mechanical hypersensitivity (allodynia and hyperalgesia) exists in Drosophila larvae.

Um ensaio e ferramentas aprimoradas para medir o nocicepção mecânico em larvas de Drosophila

Published assays for mechanical nociception in Drosophila have led to variable assessments of behavior. Here, we fabricated, for use with Drosophila ...

A High Throughput Microplate Feeder Assay for Quantification of Consumption in Drosophila

Quantifying food intake in Drosophila is used to study the genetic and physiological underpinnings of consumption-associated traits, their environmental factors, and the toxicological and pharmacological effects of numerous substances. Few methods currently implemented are amenable to high throughput measurement. The Microplate Feeder Assay (MFA) was developed for quantifying the consumption of liquid food for individual flies using absorbance. In this assay, flies consume liquid food medium from select wells of a 1536-well microplate. By incorporating a dilute tracer dye into the liquid food medium and loading a known volume into each well, absorbance measurements of the well acquired before and after consumption reflect the resulting change in volume (i.e., volume consumed). To enable high throughput analysis with this method, a 3D-printed coupler was designed that allows flies to be sorted individually into 96-well microplates. This device precisely orients 96- and 1536-well microplates to give each fly access to up to 4 wells for consumption, thus enabling food preference quantification in addition to regular consumption. Furthermore, the device has barrier strips that toggle between open and closed positions to allow for controlled containment and release of a column of samples at a time. This method enables high throughput measurements of consumption of aqueous solutions by many flies simultaneously. It also has the potential to be adapted to other insects and to screen consumption of nutrients, toxins, or pharmaceuticals.

A High Throughput Microplate Feeder Assay for Quantification of Consumption in Drosophila

The microplate feeder assay offers an economical, high throughput method for quantifying liquid food consumption in Drosophila. A 3D-printed device connects a 96-well microplate in which flies are housed to a 1536-well microplate from which flies consume a feeding solution with a tracer dye. The solution volume decline is measured spectrophotometrically.

Um ensaio alimentador de microplaco de alta produtividade para quantificação do consumo em Drosophila

Quantifying food intake in Drosophila is used to study the genetic and physiological underpinnings of consumption-associated traits, their environmental ...

A Procedure to Study Stress-Induced Relapse of Heroin Seeking after Punishment-Imposed Abstinence

The punishment-imposed abstinence procedure models the self-imposed abstinence that humans initiate due to the adverse consequences associated with drug-taking. This model has been implemented in experiments using different types of substances of abuse such as methamphetamine, cocaine, and alcohol. However, punishment-induced abstinence in heroin-trained animals has not been demonstrated. Furthermore, acute stress is a key trigger for relapse in humans and animal models. It was previously demonstrated that acute food deprivation robustly induced reinstatement of extinguished cocaine and heroin seeking. The procedure described here can be used to assess the effects of acute stress exposure on heroin seeking after punishment-imposed abstinence. A total of 8 rats were implanted with chronic intravenous (i.v.) catheters and trained to self-administer heroin (0.1 mg/kg/infusion) for 18 days under a seek-take chained schedule. Completing the seek link gave access to the take lever, which was paired with a heroin infusion. The seek lever was programmed with a variable interval 60 schedule of reinforcement (VI60), and the take lever was programmed with a fixed-ratio 1 reinforcement schedule (FR1). Following self-administration training, a mild foot shock was delivered on 30% of the completed seek links instead of the extension of the take lever. Footshock intensity was increased by 0.1 mA per daily session from 0.2 mA to 1.0 mA. Heroin-seeking tests were performed after 24 h of food deprivation (FD) or sated conditions. Rats under acute food deprivation condition robustly increased heroin seeking after punishment-imposed abstinence.

A procedure that demonstrates a robust acute food deprivation-induced relapse to heroin seeking after punishment-imposed abstinence is described. A punishment-imposed abstinence model was successfully implemented using the seek and take chain schedule for heroin self-administration. Heroin-seeking tests are then performed following 24 h of food-deprivation stress.

Um procedimento para estudar a recaída induzida pelo estresse da busca de heroína após a abstinência imposta pela punição

The punishment-imposed abstinence procedure models the self-imposed abstinence that humans initiate due to the adverse consequences associated with ...