Agradecemos a Laura Denti, Valentina Senatore e o pessoal da unidade de recursos biológicos no Instituto de Oftalmologia da UCL para ajuda com a criação de rato e Camille Charoy para suporte técnico. Este trabalho foi apoiado por uma concessão do Medical Research Council (Sr/N011511/1) C. Ruhrberg e uma bolsa de estudo britânico PhD de fundação do coração de gelo J.T. (FS/13/59/30649).

Todo o trabalho animal foi realizado seguindo UK Home Office e as orientações institucionais de bem-estar Animal e o corpo de revisão ética (AWERB).
1. preparação Mouse
Nota: Realizar experimentos em ratos adultos pelo menos 8 semanas de idade, até 6 meses de idade. Para demonstrar a reprodutibilidade técnica e sincronismo consistente para cada etapa deste procedimento entre animais diferentes, use um mínimo de 2 e máximo de 6 ratos para cada sessão experimental. Para avaliar o efeito de uma mutação em uma substância indutora de permeabilidade em camundongos geneticamente modificados, idealmente, use 2 ratos mutantes e 2 controles littermate por experimentos.
<ol><li>24 h antes da estimulante vascular hyperpermeability, anestesiamos ratos usando uma inalação adequada anestésica como isoflurano. Use 3% de isoflurano para indução de anestesia, o braço endireitante reflexo é perdido e o mouse não está respondendo a estímulos externos. Use o isoflurano 1,5% para a manutenção da anestesia (certifique-se de que o mouse tem taxas respiratórias constantes). Sob anestesia, raspe cuidadosamente ambos os flancos de cada rato com um barbeador elétrico, evitando danos à pele. Nota: A anestesia é utilizada para evitar causando estresse ao animal e para minimizar o movimento durante o barbear, o que pode resultar em danos à pele.</li>
	<li>Retorne o mouse raspado para sua gaiola em casa. Para camundongos machos, coloque cada macho em uma gaiola individual após a recuperação da anestesia para evitar a luta e, portanto, danificar a pele. Para ratos fêmeas, devolvê-los em um grupo de sua gaiola em casa. Nota: Se um comportamento de lutando é observado entre ratos masculinos na gaiola, antes do procedimento, separá-los em gaiolas individuais para 3 dias antes do experimento para permitir que o dano potencial da pele curar.</li>
	<li>Monitore os ratos até recuperar a consciência (geralmente dentro de alguns segundos) e movimentar a gaiola (geralmente dentro de 1 min).</li>
</ol>2. endovenosa injeção de Evans Blue Dye
<ol><li>Em um fluxo laminar, prepare soluções estéreis separadas do maleato de pirilamina de inibidor da histamina (4 µ g / µ l de soro fisiológico a 0,9%) e do corante azul de Evans (1% p/v em soro fisiológico a 0,9%). Esterilize, passando as soluções através de um filtro de 22 µm.</li>
	<li>Utilize uma seringa de 1ml estéril com uma agulha 30G intraperitonealmente injetar cada rato com 10 µ l pirilamina maleato solução/grama de peso corporal (figura 1A). Para realizar a nuca de injeção, primeira, o mouse e em seguida incline-a para que a cabeça é direcionada para o chão e o abdômen é dirigido para cima. Injete nos quadrantes inferiores do abdómen longe da linha média para evitar bater a bexiga. Nota: O peso dos ratos entre 8 semanas e 6 meses de idade geralmente varia entre 15 e 30 g. maleato de pirilamina inibem a liberação de histamina endógena, que caso contrário seria promover vazamento vascular, independentemente do agente a ser testado.</li>
	<li>Coloque o mouse em uma câmara de calor de 37 ° C por 10 min promover a vasodilatação. Como alternativa, use uma lâmpada de calor apropriado, focada na cauda para promover a vasodilatação se é permitida a utilização de uma lâmpada de calor pelas diretrizes éticas do locais.</li>
	<li>Mova o um mouse de cada vez para uma retenção de rato e esfregar o rabo com etanol a 70% para limpar a área de injeção e promover vasodilatação.</li>
	<li>Usar uma seringa estéril 1 mL com agulha 30G para administrar 100 µ l corante azul de Evans por via intravenosa na veia cauda (figura 1B). Imediatamente, aplica pressão para o local da injeção, segurando a cauda entre um dedo e o polegar para prevenir hemorragias. Nota: A visualização da veia da cauda pode ser melhorada direcionando o lamplight para a área de injeção. Mais detalhes sobre a realização de injeções intravenosas na veia de cauda de rato podem ser encontrado em um protocolo publicado18.</li>
	<li>Permitir que o corante circular por 30 min.</li>
</ol>3. estimular Hyperpermeability Vascular
<ol><li>Usando soluções estéreis em um fluxo laminar, dilua o agente indutor de permeabilidade de interesse a uma concentração que permite que a dose final a ser entregue em um volume de 20 µ l. Nota: No experimento de exemplo mostrado na Figura 1-Figura 2, que VEGFA é utilizado para estimular hyperpermeability vascular em uma concentração de 2,5 ng / µ l de PBS, render uma dose total de 50 ng e PBS é usado como um controle de veículo.</li>
	<li>Carrega o agente indutor de permeabilidade dos juros e o controle do veículo em 2 separado 300 µ l seringas esterilizadas com uma agulha de 31 mil. Carregar a solução suficiente para injetar cada rato com 20 µ l da solução em triplicado (ou seja, preparar 60 µ l de agente e veículo por rato, mais volume adicional para contabilizar o volume morto da agulha).</li>
	<li>Anestesia o primeiro rato a ser testado com isoflurano (3% para a indução de anestesia, reflexo de endireitamento é perdida e o mouse não está respondendo a estímulos externos e 1,5% para a manutenção da anestesia, certificando-se de que o mouse tem taxas respiratórias constantes).</li>
	<li>Por via intradérmica, injete 20 µ l do agente promover a permeabilidade do flanco do mouse (Figura 1). Verifique se a agulha está em um ângulo de 15° para a pele. Seleção para a formação de uma bolha levantada dentro da pele que indica uma injeção bem sucedida. Repeti a injecção intradérmica em 2 locais adicionais, um distante menos de 1 cm.</li>
	<li>Vire o mouse para expor o flanco 2 e repita injeções triplicadas com a solução de controle de veículo. Grave no papel a posição de cada injecção para facilitar a sua identificação para posterior coleta de amostras de pele. Nota: Lidar com a pele de rato com cuidado nesta fase; por exemplo, evite beliscar a pele quando efectuar injecções intradérmicas.</li>
	<li>Retorne o mouse injetado para sua gaiola em casa e monitorar o mouse até que ele recupera a consciência (geralmente dentro de alguns segundos) e se move em torno da gaiola.</li>
	<li>Enquanto o primeiro rato recupera, imediatamente repita os passos 3.3 e 3.5 com o segundo botão do mouse e assim por diante (até 6 ratos màxima por sessão). Manter um registo do tempo que cada rato foi injetado para ajustar o tempo em que se proceda à etapa subsequente.</li>
</ol>4. quantificação de azul de Evans acumulada dentro da derme
<ol><li>Abate cada rato por deslocamento cervical 20 min depois de ter recebido as injeções intradérmicas, observando a mesma ordem em que os ratos foram injetados. Nota: A duração do escapamento vascular pode variar de acordo com o agente indutor de permeabilidade usado, e, portanto, o tempo entre a injeção intradérmica e abate pode precisar otimizar.</li>
	<li>Lugar cada abatidos mouse sobre suas costas e pino seus pés em uma placa de cortiça enroladas com um tecido limpo (Figura 1).</li>
	<li>Usando a tesoura sem corte, faça uma incisão vertical de aproximadamente 3-4 cm da parte inferior do abdome até o peito do rato morto. Com fórceps e um bisturi, embora provoque a pele de ambos os flancos para revelar o lado interno da derme e sites de acumulação de azul de Evans (Figura 1E). Segure a pele frouxa e remover a gordura das regiões em torno do local da fuga com um bisturi. Se necessário, tire uma foto representativa para demonstrar a magnitude do vazamento de azul de Evans na pele.</li>
	<li>Impostos especiais de consumo pele regiões compreendendo o corante azul de Evans vazado para cada site usando fórceps e um bisturi, injetaram com o agente indutor de permeabilidade ou veículo. Nota: tenha cuidado para limitar o tamanho da mesma forma as regiões da pele para certificar-se que, nos 4,7 etapa subsequente, uma parte semelhante do formamide volume vai ser adsorvida por cada amostra de pele, permitindo que o corante extraído ser diluído em um volume semelhante de formamida restante . O mapa de injeção registrado na etapa 3.5 ajudará a definir a área a ser excisada.</li>
	<li>Colocar cada amostra em um tubo de 1,5 mL e o rótulo em conformidade, certificando-se de cada amostra baseia-se na parte inferior do tubo. Armazene as amostras em - 20 ° C até utilização posterior. Se o processamento imediatamente, siga as etapas abaixo.</li>
	<li>Secar as amostras de pele durante a noite, colocando os tubos abertos em um forno ou dentro do poço de um bloco de aquecimento a 55 ° C.</li>
	<li>Para extrair o corante azul de Evans, adicionar 250 µ l de formamida deionizada para as amostras em uma coifa, feche os tubos. Certifique-se de amostras de pele são todos cobertas pelo formamide e incubam durante uma noite em um forno ou um bloco de aquecimento a 55 ° C.</li>
	<li>Centrifugar as amostras em uma centrífuga de bancada na velocidade máxima (> 10.000 x g) por 40 min.</li>
	<li>Em uma coifa, transferi 100 µ l do sobrenadante contendo corante de cada amostra em um poço separado de uma placa de 96 poços de fundo transparente, plana (Figura 2A).</li>
	<li>Pico de medida absorvância de azul de Evans a 620 nm, com uma leitura de referência de 740 nm em um espectrofotômetro. Nota: 620 nm é a absorvância de pico de Evans azul, enquanto 740 nm não é absorvida pelo azul de Evans e atua como um comprimento de onda de referência.</li>
	<li>Média as leituras de absorbância de injeções três vias do mesmo agente ou veículo para cada mouse para contabilizar a variabilidade técnica (Figura 2B).</li>
	<li>Calcule a diferença de dobra das leituras do agente indutor de permeabilidade contra o controle do veículo (Figura 2).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Nagy, J. A., Benjamin, L., Zeng, H. Y., Dvorak, A. M., Dvorak, H. 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Os autores têm sem interesses conflitantes para declarar.

Desde sua primeira descrição em 195217, o ensaio de Miles forneceu pesquisadores com um método relativamente rápido, simples e confiável para estudar os mecanismos moleculares de hyperpermeability vascular. Por exemplo, o ensaio de Miles tem sido usado para testar a capacidade e/ou potência dos diferentes agentes para induzir hyperpermeability19,20,21 ou para testar a eficácia do bloqueio hyperpermeability agentes8 ,22,23. Como outro exemplo, agentes que induzem a permeabilidade vascular foram testados em ratos geneticamente modificados e seus controles littermate para determinar os requisitos de receptores específicos e sinal transducing proteínas para hyperpermeability induzida pelo ligante respostas10,11,12,13,14,15,20,23. Várias versões modificadas do ensaio Miles desde tem sido usadas, por exemplo no que diz respeito o palpador usado. Assim, azul de Evans tem sido substituída em alguns estudos com fluorescência-etiquetada dextranos de tamanhos diferentes ou microesferas11,13.
A principal vantagem do ensaio Miles sobre outros ensaios para investigar mecanismos hyperpermeability vascular é que é relativamente fácil de executar e não requer equipamento caro. Além disso, como uma em vivo técnica, este vazamento vascular modelos de ensaio no contexto de vasos intactos, ao contrário de vazamento através de medição em vitro ensaios tais como trans bem ensaios de fluxo ou trans-resistência elétrica endotelial ( Ensaios TEER), que incidem, unicamente, sobre a monocamada endotelial. Os ensaios alternativos na vivo de hyperpermeability vascular podem diferir o Miles ensaio descrito aqui, utilizando uma rota de entrega diferente para o agente indutor de hyperpermeability ou analisando o escapamento vascular em locais diferentes, para exemplo pela entrega sistémica de um agente através da veia da cauda seguido de exame de escapamento vascular nos pulmões ou a traqueia11,13,15. Uma limitação do ensaio Miles é que a injeção intradérmica de certos agentes pode, em princípio, também influenciam a pressão arterial e fluxo além do rompimento da barreira endotelial e, portanto, influenciar a permeabilidade vascular também indiretamente. No entanto, este ensaio recentemente tem sido mostrado para medir a permeabilidade vascular induzida por VEGF-A, independentemente de efeitos na pressão arterial sistêmica15. Outra limitação do ensaio Miles é que camas vasculares em tecidos diferentes podem responder diferentemente a permeabilidade-promoção agentes e os resultados obtidos com um ensaio de Miles na pele podem, portanto, não ser representativa, por exemplo, do que ocorre na pulmão ou cérebro.
Idade e peso do animal podem influenciar o escapamento observado no ensaio de Miles. Para minimizar o efeito dessas variáveis, pesquisadores devem usar littermates ou da mesma forma tamanho e envelhecido ratos como controles. Ao avaliar os mutantes do mouse para um determinado gene de interesse, os ratos devem ser gerados através um heterozigoto contra littermates estratégia e sua reprodução heterozigoto usados como controles. Além disso, é aconselhável a utilização de anestésicos de gás rapidamente reversível, tais como o isoflurano, para evitar a vasoconstrição, o que foi descrita por algumas drogas anestésicas administrada através de injeções parenterais24,25. A injeção de corante azul de Evans na veia lateral da cauda do rato é um passo crítico no presente protocolo e grandemente pode influenciar a qualidade da experiência e dados. Assim, pesquisadores devem ser competentes na realização de cauda veia injeções e irá provavelmente precisar de experiência prévia ou prática antes do início que do ensaio as milhas experimentar. Alternativamente, os investigadores poderiam usar outras vias intravenosa entregar Evans azul, tais como a injeção retro-orbital se eles são experientes com isso. Injeção intradérmica de permeabilidade-promover soluções podem causar danos agente independente à pele. Portanto, injecções intradérmicas não deve exceder 20 µ l de volume, devem sempre ser realizadas na presença do inibidor da histamina e normalizadas para injeções de controle do veículo.
O ensaio de Miles tem sido utilizado por muitos pesquisadores para avaliar os componentes da VEGF-A via de sinalização, por exemplo, porque a permeabilidade vascular VEGF A-induzida provoca ascite em pacientes de câncer16 e edema prejudicando a visão em vários neovascular doença de olho7. Assim, nós e os outros têm usado o ensaio de Miles para comparar o VEGF-A fuga de vascular induzida em ratos que foram geneticamente modificados para a falta de componentes específicos do VEGF-A sinalização cascata12,13,14, 15 , 20 , 23. nosso estudo recente usando esta abordagem revelou que a principal isoforma de VEGF-A patológica, VEGF165, os sinais através de um complexo de VEGFR2 e NRP1, em que o domínio citoplasmático NRP1 promove a ativação de ABL quinase-mediada de quinases família SRC para evocar uma resposta de hyperpermeability14. VEGFA também promove o crescimento de vasos sanguíneos e pode, portanto, ser utilizada terapeuticamente para restabelecer o fluxo sanguíneo para os tecidos isquêmicos, se suas atividades hyperpermeability podem ser especificamente inibidas. Investigação para elucidar o mecanismo molecular que orienta o VEGF-A respostas das células endoteliais vasculares no sentido hyperpermeability vascular pode, portanto, identificar caminhos que podem ser manipulados seletivamente para inibir o edema patológico induzido VEGF-A em doenças, como câncer ou doença isquêmica ocular. O ensaio de milhas, sem dúvida, vai continuar a ser um método útil para apoiar estes e muitos outros tipos de estudos funcionais para elucidar os reguladores moleculares e efetores de hyperpermeability vascular.

A principal função do sistema cardiovascular é permitir a transferência de gases, nutrientes e resíduos entre a circulação e tecidos em todos os órgãos. Vasos sanguíneos têm níveis de órgão específico de permeabilidade basal para permitir tais intercâmbios1. Por exemplo, os vasos sanguíneos nos rins são altamente permeáveis, enquanto a barreira hemato-encefálica constitui uma interface altamente impenetrável e apertado2,3,4. As células endoteliais que formam o revestimento interno dos vasos sanguíneos fornecem uma barreira física entre a circulação e tecidos subjacentes e regulam a permeabilidade vascular de forma órgão específico. No entanto, certos estímulos causam um colapso parcial da barreira endotelial para aumentar o extravasamento de fluido de circulação para o interstício acima os níveis basais de1. Tal hyperpermeability é observado, por exemplo, em locais de trauma do tecido, na inflamação, tumores, durante a sepse, nos olhos com doença neovascular ou no cérebro e coração, quando a isquemia do tecido ocorre devido a um acidente vascular cerebral ou infarto do miocárdio, respectivamente 5 , 6 , 7 , 8. quando cronicamente elevada, hyperpermeability leva ao edema, que por sua vez, provoca danos nos tecidos, tais como perda de visão no olho doença9. Assim, a resposta vascular hyperpermeability de modelagem é desejável para compreender os mecanismos que aumentam a permeabilidade endotelial e para testar a eficácia de agentes projetado para inibir isto.
O ensaio de milhas é uma técnica bem estabelecida, comumente usada e relativamente simples que mede escapamento vascular na vivo como uma medida de substituto de hyperpermeability vascular. Mesmo que isso não leva em conta a composição de fatores que podem aumentar o vazamento vascular independentemente do Regulamento da barreira endotelial, tais como pressão arterial ou o fluxo de sangue, o ensaio de Miles geralmente é pensado para fornecer um método confiável para avaliar o permeabilidade-modulando a atividade de substâncias e identificar os sinalização mediadores que promovem a sua actividade. Nesse sentido, o ensaio de Miles tem sido parte integrante de inúmeros estudos que identificaram mediadores de hyperpermeability vascular e seus mecanismos de ação10,11,12,13, 14,15, como o fator de crescimento vascular endotelial VEGF-A que foi originalmente identificada como o fator de permeabilidade vascular VPF16.
Originalmente desenvolvido por milhas e milhas para estudar a permeabilidade vascular em cobaias17, seu ensaio foi posteriormente adaptado para usando ratos, que são agora o organismo modelo de escolha para elucidar os mecanismos moleculares da permeabilidade vascular Regulamento, devido a sua excelente adequação para manipulação genética. Brevemente, corante azul de Evans por via intravenosa é injetado em ratos adultos e autorizado a circular por 30 minutos (Figura 1). Agentes de indução permeabilidade contra o controle do veículo em seguida são injetados por via intradérmica em vários sites em opostos os flancos do rato para induzir vazamento vascular (Figura 1). Por conseguinte, albumina ligados a Evans corante azul extravasates e acumula-se na derme (Figura 1). Após abate humanamente o mouse, azul de Evans é extraído da derme e o nível de vazamento vascular calculado como uma relação do teste de substância para veículo-induzida de densidade óptica (Figura 2).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="972">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:320px;">Pyrilamine maleate salt</td>
			<td style="width:141px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">P5514-5G</td>
			<td style="width:167px;">Resuspend in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Deionised Formamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4117</td>
			<td>Use in fume cupboard</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microlance Needles 30g x 0.5&#34;</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sterile Plastipak 1ml Luer</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:320px;">Sterile MicroFine syriinges 0.3 ml - 8 mm - 30G&#160;</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>324826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Evans blue</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E2129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse restrainer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Heat chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hair clippers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Isoflurane</td>
			<td>Merial</td>
			<td>ap/drugs/220/96</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Scalpal&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Blunt scissor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Eppendorf tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Heatblock</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cork board</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Benchtop refrigerated centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Recombinant Vascular Endothelial Growth Factor 165</td>
			<td>Reliatech</td>
			<td>M30-004</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluating vascular hyperpermeability-inducing agents in the skin with the miles assay

A principal função do endotélio vascular em organismos vertebrados é servir como uma barreira entre o sangue e cada tecido do corpo, através do qual a permeabilidade do endotélio, de células do sangue, macromoléculas do plasma e água pode ser adaptada de acordo com a necessidade fisiológica. Em certas doenças, citocinas e fatores de crescimento são liberados em que se destinam a barreira endotelial para aumentar transitoriamente a permeabilidade vascular; no entanto, sua presença prolongada pode causar hyperpermeability vascular crônica e edema do tecido-prejudiciais desse modo. O ensaio de milhas é uma técnica na vivo que permite aos pesquisadores estudar hyperpermeability vascular através da medição de proxy de escapamento vascular. Aqui, nós fornecemos um protocolo detalhado sobre como executar esse procedimento no mouse, que é o organismo modelo mais amplamente usado para estudar patologia e fisiologia dos mamíferos. O procedimento envolve a injeção intravenosa de corante azul de Evans para rotular a albumina circulante seguida por múltiplas injecções intradérmicas de agentes de indução permeabilidade e soluções de controle de veículos em oposição os flancos do mouse. Por conseguinte, corante azul de Evans gradualmente vaza para a derme, onde se acumula e pode ser extraído para quantificação como escapamento induzida pelo agente indutor de permeabilidade em relação ao veículo. O ensaio de milhas pode ser executado em tipo selvagem ou geneticamente modificado em modelos do rato e pode ser combinado com a administração de drogas para estudar os mecanismos moleculares que regulam a permeabilidade vascular e identificam agentes/metas capazes de induzir ou bloqueio hyperpermeability.

Usamos o Miles ensaio para avaliar a habilidade do VEGF-A para induzir vazamento vascular em relação ao controle do veículo (PBS) em camundongos C57/Bl6 de sua. Aqui, nós mostramos um representante experimento usando sua ratos estimulados com injeção intradérmica de solução de 20 µ l contendo 50 ng do VEGF-A em PBS ou PBS veículo apenas. Um claro aumento escapamento de corante azul de Evans em amostras de pele injetado com VEGF-A em comparação com PBS foi aparente em situ (Figura 1E) e após a extração do corante em formamida (Figura 2A). Quantificação de vários experimentos que ilustra 50 ng do VEGF-A induz significativamente mais Evans escapamento azul que PBS sozinho (Figura 2B), com uma média aumentar 3 vezes no escapamento vascular em relação ao veículo (Figura 2).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57524/57524fig1.jpg"> Figura 1: indução de escapamento vascular no ensaio de Miles. Representação esquemática (top painéis) e imagens correspondentes (painéis de fundo) das etapas sequenciais ao realizar o ensaio de Miles no mouse. (A) pirilamina maleato é injetado intraperitonealmente para evitar a liberação de histamina endógena de 10 a 30 minutos antes da injeção intravenosa (B) de 100 µ l 1% Evans azul para a cauda da veia do mouse. (C), 30 min depois, vascular escapamento é induzido pela injeção intradérmica do agente (50 ng do VEGF-A; verde círculos) contra o controle do veículo (PBS; círculos brancos). (D, E) Para acessar sites de acumulação de azul de Evans, o mouse é abatidos 20 minutos após as injeções intradérmicas e a pele de ambos os flancos dissecados e encurralados. i.p.: intraperitoneal; i.v.: intravenosa; identificação: intradérmica; escala de bares, 1 cm. <a href="/files/ftp_upload/57524/57524fig1large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57524/57524fig2.jpg"> Figura 2: quantificação de escapamento vascular no ensaio de Miles. (A) Evans corante azul é extraído em formamida de amostras de pele obtidos de cada injeção intradérmica na Figura 1 e carregado em uma placa de 96 poços para ler com um Espectrofotômetro de absorção. (B, C) Representação gráfica das leituras de absorbância de múltiplas experiências traçando valores (B) a absorvância normalizada (densidade óptica, OD) de ambos o agente indutor de permeabilidade (VEGF-A; escuro verde círculos) e veículo (PBS; cinza círculos), ou (C) a prega mudança de OD para o agente contra o veículo (barras de erro: SEM). As leituras de absorvância do PBS triplicado e amostras de VEGF-A, mostradas em (A) são em média e mostradas em (B, C) como círculos brancos ou verdes, respectivamente. <a href="/files/ftp_upload/57524/57524fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Evaluating Vascular Hyperpermeability-inducing Agents in the Skin with the Miles Assay

Aqui, apresentamos um protocolo para medir o vazamento vascular induzido pela administração intradérmica de agentes de promoção de permeabilidade na pele murino. Esta técnica pode ser usada para determinar a capacidade das moléculas de promover ou inibir vazamento vascular ou para estudar os mecanismos moleculares que regulam a permeabilidade vascular.

Avaliação de agentes de indução Hyperpermeability vasculares na pele com o ensaio de milhas

The primary function of the vascular endothelium in vertebrate organisms is to serve as a barrier between the blood and each tissue of the body, whereby ...

evaluating-vascular-hyperpermeability-inducing-agents-skin-with-miles

Research

JoVE Journal

Biology

14.7K visualizações.  University College London. Aqui, apresentamos um protocolo para medir o vazamento vascular induzido pela administração intradérmica de agentes de promoção de permeabilidade na pele murino. Esta técnica pode ser usada para determinar a capacidade das moléculas de promover ou inibir vazamento vascular ou para estudar os mecanismos moleculares que regulam a permeabilidade vascular.

Vídeo: Evaluating Vascular Hyperpermeability-inducing Agents in the Skin with the Miles Assay

Construction and Implantation of a Microinfusion System for Sustained Delivery of Neuroactive Agents.

Sustained delivery of neuroactive agents is widely used in neuroscience, but poses many technical challenges. It is necessary to deliver the agent with high precision while minimizing localized trauma and inflammation. Also, the ability to customize the system to accommodate animals of different species and sizes is desirable. This video presentation demonstrates the construction of an infusion system that can be fitted to any particular research animal. The delivery microcannula diameter is approximately 10-fold smaller than most infusion cannulas presently used. This translates into enhanced accuracy and reduced trauma to the brain region under study. The delivery cannula can also be sculpted to fit the contour of the surface of the animal's skull, thereby allowing closure of the scalp incision neatly over the infusion system, precluding the need for a skull-mounted pedestal, reducing risk of infection, and ensuring a greater level of comfort to the animal. The system is assembled in an air-free environment and requires the researcher to fashion glass micropipettes with a heat source. These construction methods require special skills that are best acquired, if not in person, using video instruction.  (This article is based on work first reported in J Neurosci Methods. 2008 Jan 30;167(2):213-20. Epub 2007 Aug 28.).

As neuroscience inquiry becomes more sophisticated, investigation of brain structures and circuitry requires improved levels of accuracy and higher resolution. We have developed a method for the preparation and implantation of a chronic infusion system within the brain utilizing a borosilicate microcannula with a tip diameter of 50 microns.

Construção e Implantação de um Sistema de Microinfusion para entrega Sustentada de Agentes neuroativos.

Sustained delivery of neuroactive agents is widely used in neuroscience, but poses many technical challenges. It is necessary to deliver the agent with ...

Biologia

Clonogenic Assay: Adherent Cells

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. Apart from documenting the method, the initial landmark study generated the first radiation-dose response curve for X-ray irradiated mammalian (HeLa) cells in culture1. Basically, the clonogenic assay enables an assessment of the differences in reproductive viability (capacity of cells to produce progeny; i.e. a single cell to form a colony of 50 or more cells) between control untreated cells and cells that have undergone various treatments such as exposure to ionising radiation, various chemical compounds (e.g. cytotoxic agents) or in other cases genetic manipulation. The assay has become the most widely accepted technique in radiation biology and has been widely used for evaluating the radiation sensitivity of different cell lines. Further, the clonogenic assay is commonly used for monitoring the efficacy of radiation modifying compounds and for determining the effects of cytotoxic agents and other anti-cancer therapeutics on colony forming ability, in different cell lines. A typical clonogenic survival experiment using adherent cells lines involves three distinct components, 1) treatment of the cell monolayer in tissue culture flasks, 2) preparation of single cell suspensions and plating an appropriate number of cells in petri dishes and 3) fixing and staining colonies following a relevant incubation period, which could range from 1-3 weeks, depending on the cell line. Here we demonstrate the general procedure for performing the clonogenic assay with adherent cell lines with the use of an immortalized human keratinocyte cell line (FEP-1811)2. Also, our aims are to describe common features of clonogenic assays including calculation of the plating efficiency and survival fractions after exposure of cells to radiation, and to exemplify modification of radiation-response with the use of a natural antioxidant formulation.

The applicability of the clonogenic assay for evaluating reproductive viability has been established for more than 50 years. Here we demonstrate the general procedure for performing the clonogenic assay with adherent cells.

Clonogênica Ensaio: células aderentes

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. ...

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching morphogenesis. We have developed the limb skin vasculature model to study vascular development in which a pre-existing primitive capillary plexus is reorganized into a hierarchically branched vascular network. Whole-mount confocal microscopy with multiple labelling allows for robust imaging of intact blood vessels as well as their cellular components including endothelial cells, pericytes and smooth muscle cells, using specific fluorescent markers. Advances in this limb skin vasculature model with genetic studies have improved understanding molecular mechanisms of vascular development and patterning. The limb skin vasculature model has been used to study how peripheral nerves provide a spatial template for the differentiation and patterning of arteries. This video article describes a simple and robust protocol to stain intact blood vessels with vascular specific antibodies and fluorescent secondary antibodies, which is applicable for vascularized embryonic organs where we are able to follow the process of vascular development.

We introduce a whole-mount immunohistochemistry and laser scanning confocal microscopy with multiple labelling for analyzing intricate vascular network formation in mouse embryonic limb skin.

Todo-mount Análise imuno-histoquímica para Vascularização embrionárias Limb pele: um sistema modelo para estudar Morfogênese Branching Vascular em Embrião

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching ...

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Studying germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult due to low cell numbers and their location deep within developing embryos. The availability of a "closed" in vitro based system could prove invaluable for our understanding of gametogenesis. The formation of oocyte-like cells (OLCs) from somatic stem cells, isolated from newborn mouse skin, has been demonstrated and can be visualized in this video protocol. The resulting OLCs express various markers consistent with oocytes such as Oct4 , Vasa , Bmp15, and Scp3. However, they remain unable to undergo maturation or fertilization due to a failure to complete meiosis. This protocol will provide a system that is useful for studying the early stage formation and differentiation of germ cells into more mature gametes. During early differentiation the number of cells expressing Oct4 (potential germ-like cells) reaches ~5%, however currently the formation of OLCs remains relatively inefficient. The protocol is relatively straight forward though special care should be taken to ensure the starting cell population is healthy and at an early passage.

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

In recent years the formation of germ cells using in vitro culture methods has been demonstrated using several different types of somatic stem cells. This article will visually present the differentiation of newborn mouse derived stem cells to early oocyte-like cells.

Diferenciação de camundongos neonatos pele derivadas de células-tronco em células germinativas semelhantes<em&gt; In vitro</em

Studying  germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult  due to low cell numbers and their location deep within developing ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs from the coronary circulation. Hearts with intact aortic arches were removed and perfused via retrograde Langendorff with digestion solution containing 300 Units/ml of collagenase type II, 0.1 mg/ml soybean trypsin inhibitor and 1 M CaCl2. The perfusates were collected at 15 min intervals for 90 min, pelleted by centrifugation, resuspended in plating media, and plated on tissue culture dishes. VSMCs were characterized by presence of SM22&#945;, &#945;-SMA, and vimentin. One of the main advantages of using this technique is the ability to isolate VSMCs from the coronary circulation of mice. Although the small number of cells obtained can limit some of the applications for which the cells can be utilized, isolated coronary VSMCs can be used in a variety of well-established cell culture techniques and assays. Studies investigating VSMCs from genetically modified mice can provide further information about structure-function and signaling processes associated with vascular pathologies.

The purpose of this protocol is to demonstrate the isolation and culture techniques of murine primary vascular smooth muscle cells (VSMCs) from the coronary circulation. Once VSMCs have been isolated, they can be used for many standard culture techniques.

Isolamento de Murino vasculares coronários células musculares lisas

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Assessment of Vascular Tone Responsiveness using Isolated Mesenteric Arteries with a Focus on Modulation by Perivascular Adipose Tissues

Altered vascular tone responsiveness to pathophysiological stimuli contributes to the development of a wide range of cardiovascular and metabolic diseases. Endothelial dysfunction represents a major culprit for the reduced vasodilatation and enhanced vasoconstriction of arteries. Adipose (fat) tissues surrounding the arteries play important roles in the regulation of endothelium-dependent relaxation and/or contraction of the vascular smooth muscle cells. The cross-talks between the endothelium and perivascular adipose tissues can be assessed ex vivo using mounted blood vessels by a wire myography system. However, optimal settings should be established for arteries derived from animals of different species, ages, genetic backgrounds and/or pathophysiological conditions.

The protocol describes the use of wire myography to evaluate the transmural isometric tension of mesenteric arteries isolated from mice, with special consideration of the modulation by factors released from endothelial cells and perivascular adipose tissues.

Avaliação da responsividade do tônus vascular usando artérias mesentéricas isoladas com foco na modulação por tecidos adiposos perivasculares

Altered vascular tone responsiveness to pathophysiological stimuli contributes to the development of a wide range of cardiovascular and metabolic ...

Deep Vascular Imaging in the Eye with Flow-Enhanced Ultrasound

The retina within the eye is one of the most energy-demanding tissues in the body and thus requires high rates of oxygen delivery from a rich blood supply. The capillary lamina of the choroid lines the outer surface of the retina and is the dominating source of oxygen in most vertebrate retinas. However, this vascular bed is challenging to image with traditional optical techniques due to its position behind the highly light-absorbing retina. Here we describe a high-frequency ultrasound technique with subsequent flow-enhancement to image deep vascular beds (0.5-3 cm) of the eye with a high spatiotemporal resolution. This non-invasive method works well in species with nucleated red blood cells (non-mammalian and fetal animal models). It allows for the generation of non-invasive three-dimensional angiographies without the use of contrast agents, and it is independent of blood flow angles with a higher sensitivity than Doppler-based ultrasound imaging techniques.

We present a non-invasive ultrasound technique for generating three-dimensional angiographies in the eye without the use of contrast agents.

Imagem vascular profunda no olho com ultrassom aumentado de fluxo

The retina within the eye is one of the most energy-demanding tissues in the body and thus requires high rates of oxygen delivery from a rich blood ...

Imaging Molecular Adhesion in Cell Rolling by Adhesion Footprint Assay

Rolling adhesion, facilitated by selectin-mediated interactions, is a highly dynamic, passive motility in recruiting leukocytes to the site of inflammation. This phenomenon occurs in postcapillary venules, where blood flow pushes leukocytes in a rolling motion on the endothelial cells. Stable rolling requires a delicate balance between adhesion bond formation and their mechanically-driven dissociation, allowing the cell to remain attached to the surface while rolling in the direction of flow. Unlike other adhesion processes occurring in relatively static environments, rolling adhesion is highly dynamic as the rolling cells travel over thousands of microns at tens of microns per second. Consequently, conventional mechanobiology methods such as traction force microscopy are unsuitable for measuring the individual adhesion events and the associated molecular forces due to the short timescale and high sensitivity required. Here, we describe our latest implementation of the adhesion footprint assay to image the P-selectin: PSGL-1 interactions in rolling adhesion at the molecular level. This method utilizes irreversible DNA-based tension gauge tethers to produce a permanent history of molecular adhesion events in the form of fluorescence tracks. These tracks can be imaged in two ways: (1) stitching together thousands of diffraction-limited images to produce a large field of view, enabling the extraction of adhesion footprint of each rolling cell over thousands of microns in length, (2) performing DNA-PAINT to reconstruct super-resolution images of the fluorescence tracks within a small field of view. In this study, the adhesion footprint assay was used to study HL-60 cells rolling at different shear stresses. In doing so, we were able to image the spatial distribution of the P-selectin: PSGL-1 interaction and gain insight into their molecular forces through fluorescence intensity. Thus, this method provides the groundwork for the quantitative investigation of the various cell-surface interactions involved in rolling adhesion at the molecular level.

This protocol presents the experimental procedures to perform the adhesion footprint assay to image the adhesion events during fast cell rolling adhesion.

A adesão molecular de imagem em rolamento celular por ensaio de pegada de adesão

Rolling adhesion, facilitated by selectin-mediated interactions, is a highly dynamic, passive motility in recruiting leukocytes to the site of ...

Application of Passive Head Motion to Generate Defined Accelerations at the Heads of Rodents

Exercise is widely recognized as effective for various diseases and physical disorders, including those related to brain dysfunction. However, molecular mechanisms behind the beneficial effects of exercise are poorly understood. Many physical workouts, particularly those classified as aerobic exercises such as jogging and walking, produce impulsive forces at the time of foot contact with the ground. Therefore, it was speculated that mechanical impact might be implicated in how exercise contributes to organismal homeostasis. For testing this hypothesis on the brain, a custom-designed ''passive head motion'' (hereafter referred to as PHM) system was developed that can generate vertical accelerations with controlled and defined magnitudes and modes and reproduce mechanical stimulation that might be applied to the heads of rodents during treadmill running at moderate velocities, a typical intervention to test the effects of exercise in animals. By using this system, it was demonstrated that PHM recapitulates the serotonin (5-hydroxytryptamine, hereafter referred to as 5-HT) receptor subtype 2A (5-HT2A) signaling in the prefrontal cortex (PFC) neurons of mice. This work provides detailed protocols for applying PHM and measuring its resultant mechanical accelerations at rodents' heads.

The present protocol describes a custom-designed ''passive head motion'' system, which reproduces mechanical accelerations at rodents' heads generated during their treadmill running at moderate velocities. It allows dissecting mechanical factors/elements from the beneficial effects of physical exercise.

Aplicação do movimento passivo da cabeça para gerar acelerações definidas nas cabeças dos roedores

Exercise is widely recognized as effective for various diseases and physical disorders, including those related to brain dysfunction. However, molecular ...

Isolation of Cardiac and Vascular Smooth Muscle Cells from Adult, Juvenile, Larval and Embryonic Zebrafish for Electrophysiological Studies

Zebrafish have long been used as a model vertebrate organism in cardiovascular research. The technical difficulties of isolating individual cells from the zebrafish cardiovascular tissues have been limiting in studying their electrophysiological properties. Previous methods have been described for dissection of zebrafish hearts and isolation of ventricular cardiac myocytes. However, the isolation of zebrafish atrial and vascular myocytes for electrophysiological characterization was not detailed. This work describes new and modified enzymatic protocols that routinely provide isolated juvenile and adult zebrafish ventricular and atrial cardiomyocytes, as well as vascular smooth muscle (VSM) cells from the bulbous arteriosus, suitable for patch-clamp experiments. There has been no literary evidence of electrophysiological studies on zebrafish cardiovascular tissues isolated at embryonic and larval stages of development. Partial dissociation techniques that allow patch-clamp experiments on individual cells from larval and embryonic hearts are demonstrated.

The present protocol describes the acute isolation of viable cardiac and vascular smooth muscle cells from adult, juvenile, larval, and embryonic zebrafish (Danio rerio), suitable for electrophysiological studies.

Isolamento de células musculares lisas cardíacas e vasculares de zebrafish adulto, juvenil, larval e embrionário para estudos eletrofisiológicos

Zebrafish have long been used as a model vertebrate organism in cardiovascular research. The technical difficulties of isolating individual cells from the ...