A técnica de Ultrassom Aprimorado por Fluxo nos permite imaginar a vasculatura do olho em três dimensões, sem o uso de agentes de contraste. A principal vantagem dessa técnica é sua estabilidade para a imagem da vesture, por trás da retina pigmentada, que é desafiadora com várias técnicas de imagem óptica. Demonstramos essa técnica em peixes dourados, mas ela pode ser aplicada a todas as espécies com glóbulos vermelhos nucleados, permitindo que os pesquisadores obtenham uma visão da evolução funcional dos olhos.
Essa técnica pode ser aplicada por pesquisadores com treinamento básico em ultrassom e manuseio de animais. Após confirmar um nível ideal de anestesia, posicione o animal em uma postura que permita acesso direto de cima, ao olho. Coloque um meio de ultrassom adequado no olho do animal.
Se as pálpebras dimensionadas cobrirem o olho, então, desloque-as suavemente com um cotonete. Para animais aquáticos, a água funciona bem como um meio de ultrassom, em seguida, posicione o transdutor de ultrassom, medial ao olho, em uma orientação ventral ou caudal dorsal, dependendo da orientação de imagem desejada. No Modo B, com uma profundidade máxima de campo, imagem a parte medial e mais profunda do olho, para garantir que todas as estruturas de interesse sejam visíveis no campo de imagem.
Traduza lentamente o transdutor para cada lado, enquanto inspeciona as imagens em tempo real. Certifique-se de que todas as estruturas de interesse estejam visíveis no campo de imagem. Se não, mude para um transdutor com menor frequência e maior profundidade de campo.
Ajuste a profundidade da imagem, deslocamento de profundidade, largura de imagem e número de posição das zonas focais, para cobrir a região desejada de interesse nas três dimensões espaciais. Em seguida, defina a taxa de quadros na faixa de 50 a 120 quadros por segundo. Em seguida, ajuste o ganho 2D a um nível, de modo que as estruturas anatômicas sejam apenas visíveis na aquisição do Modo B para aumentar a relação sinal-ruído na reconstrução subsequente aprimorada de fluxo.
Para adquirir uma imagem aprimorada de fluxo 2D em uma única posição de fatia, traduza o transdutor para esta posição e prossiga para a reconstrução de imagem aprimorada pelo fluxo. Para adquirir uma gravação 3D de toda uma região de interesse, traduza o transdutor para um extremo da região de interesse. Para determinar a posição exata da extremidade extrema, aumente o ganho 2D, brevemente.
Depois que o transdutor for colocado corretamente, diminua o ganho 2D antes de gravar, para garantir a relação sinal máximo/ruído na reconstrução subsequente aprimorada de fluxo. Para cada etapa ou fatia na gravação 3D, adquira mais de 100 quadros. Em seguida, utilizando um micro manipulador ou motor transdutor embutido, traduza o transdutor em toda a região de interesse, em etapas de 25 ou 50 micrômetros, e repita a aquisição de mais de 100 quadros para cada etapa.
Para a construção de imagens aprimoradas pelo fluxo, exporte as gravações para o formato de arquivo DICOM. Para produzir uma única imagem aprimorada de fluxo com base em uma gravação de cena superior a 100 quadros, calcule o desvio padrão em um nível de pixel usando esta fórmula e repita o cálculo para cada fatia na gravação 3D. Para automatizar o cálculo de desvio padrão e o processo de reconstrução de imagem para várias fatias em uma gravação 3D, realize esta operação no modo de lote usando ImageJ e o script macro, fornecido no manuscrito do texto.
Combine todas as imagens reconstruídas em uma pilha de imagens usando o comando Imagens para Empilhar no ImageJ. Em seguida, usando o comando Propriedades, especifica a espessura da fatia do tamanho da etapa usada durante a aquisição e salva a pilha de imagens como um arquivo TIFF 3D. A presença de glóbulos vermelhos nucleados em vertebrados mamíferos adultos não-ad, fornece contraste positivo do sangue fluindo, em comparação com o tecido estático nas gravações da cena.
No entanto, quando agora analisada quadro a quadro, a clara distinção entre sangue e tecido circundante é menos óbvia. Este procedimento de aumento do fluxo sanguíneo, essencialmente, compila uma gravação de ponto multi-tempo em espaço 2D, em uma única imagem, onde na flutuação inerente do valor do sinal em pixels, posicionado no sangue fluindo, pontua um desvio padrão mais alto do que o tecido estático circundante, produzindo contraste positivo. Em aquisições 3D, várias fatias paralelas com espaçamento conhecido podem ser combinadas em dados de imagem 3D.
Pode ser usado para renderização de volume tridimensional e modelagem anatômica. A imagem de ultrassom baseada em Doppler também fornece a opção de especificamente o fluxo sanguíneo da imagem, no entanto, com menos sensibilidade do que este método. Este procedimento de ultrassom reforçado com o fluxo de fluxo permite imagens de fluxo sanguíneo em uma variedade de espécies com glóbulos vermelhos nucleados.
Leitos vasculares oculares profundos, como o choroide rete mirabile em alguns peixes, podem ser imagens se presentes na espécie. O método é limitado pela ausência de glóbulos vermelhos nucleados em mamíferos, nos quais o procedimento de aumento de fluxo produz algum grau de contraste do fluxo sanguíneo, mas não tão distinto quanto em espécies com glóbulos vermelhos nucleados. O ultrassom aumentado pelo fluxo é sensível ao ruído de movimento.
Movimentos respiratórios podem causar desfoque de imagem e artefatos, como o aprimoramento da borda do tecido. Gating prospectivo ou retrospectivo pode ser usado para ajustar para ruído de movimento. Tanto para aquisições 2D quanto 3D, é crucial limitar os artefatos de movimento causados pelo movimento animal, devido à anestesia inadequada na configuração de transdutor instável.
O desenvolvimento dessa técnica, abriu caminho para o exame in vivo não invasivo de redes vasculares profundas no olho da grande maioria dos vertebrados, que possuem eritrócitos nucleados.
