Esses métodos integram a análise de imagem de sequenciamento e citometria de fluxo da próxima geração. Pode ajudar a responder perguntas interessantes, como se algumas alterações fenotípicas estão implicando, em vez do transcriptome, especialmente no ambiente de exposição ao poluente. A principal vantagem deste método simples para nós é que podemos usá-lo para medir a colocalização de proteína biologicamente importante, para interpretar os resultados da expressão genética diferencial chave em um nível funcional.
As implicações dessa técnica se estendem ao diagnóstico de desfechos patológicos e toxicológicos. Como uma abordagem normal de imager, forsee tem a capacidade de conectar expressão genética à função proteica. Geralmente, indivíduos novos nesse método lutarão devido às altas demandas técnicas da análise de imagem e transcrição.
Para sequenciar a biblioteca de células dendríticas derivadas do monócito humano, primeiro carregue os reagentes sequenciamento e indexação na biosíntese e na indexação dos racks de reagentes, respectivamente, e coloque os racks em um banho de água de nível laboratorial por uma hora, até que todo o gelo tenha derretido, e os reagentes sejam misturados completamente. Enquanto os reagentes estão descongelando, ligue o sequenciador, conectando o computador a uma unidade de rede quando a unidade Não Ejetar aparecer e inicie o software de controle do sequenciador. Em seguida, adicione cerca de 100 mililitros de solução de lavagem de manutenção a cada uma das garrafas no rack de reagente de biosíntese de sequenciamento, e enrosque uma tampa de funil em cada garrafa.
Adicione aproximadamente 12 mililitros de solução de lavagem de manutenção a cada tubo cônico de 15 mililitros no rack de reagente de indexação e descarte as tampas. Em seguida, carregue os dois racks no sequenciador. Selecione Lavagem de manutenção dentro do software de controle do sequenciador e siga as instruções para limpar o sistema de fluidos do sequenciador.
Use uma lanterna para inspecionar visualmente a célula de fluxo para obter bolhas que passam pelas pistas, para ter certeza de que não há vazamento. Quando a sequência de lavagem estiver concluída, abra a guia Sequência e inicie uma nova execução, direcionando os dados de saída para uma unidade de rede. Carregue uma folha de amostra para demultiplexação e insira as informações apropriadas do reagente.
Use uma célula de fluxo usada para preparar o sistema, com os reagentes de sequenciamento. Uma vez que a geração de cluster esteja completa, remova a célula de fluxo. E pulverizar levemente a célula com água.
Limpe a célula de fluxo seca com papel de lente, seguida de um spray leve com 95% de etanol. Depois de limpar a célula de fluxo secar novamente, verifique a superfície da célula de fluxo contra a luz para ter certeza de que ela está limpa, sem detritos ou resíduos de sal. Quando o passo principal estiver concluído, carregue a célula de fluxo agrupada e inicie o sequenciamento.
O software do visualizador de análise de sequência será automaticamente iniciado. Cerca de 26 horas depois, monitore a qualidade dos dados de sequenciamento através do software de controle de alta sequência e a análise de sequenciamento visualize o software para avaliar a qualidade dos dados e para qualquer solução de problemas. Em seguida, quando a sequência estiver concluída, troque a junta da célula de fluxo e realize uma lavagem de manutenção antes de iniciar a próxima execução.
Após o fluxo de imagens citométricas das células dendríticas expostas ao poluente, abra ImageJ Fiji e mescla as 100 imagens celulares salvas para os grupos de amostras de células dendríticas humanas não expostas e expostas a poluentes em arquivos individuais de acordo com o grupo de tratamento. Para analisar a colocalização do CD1d e do Lamp1 dentro das duas populações, abra a imagem celular de 100 células expostas ao poluente e selecione Canais de Imagem, Cor e Split para dividir a imagem em duas imagens individuais com um único fluoróforo por canal. Para criar um gráfico de dispersão dos pixels colocalizados, selecione Analisar, Colocalização e Limiar de Colocalização e pressione a Tela de Impressão para salvar o plot de dispersão.
Para calcular o coeficiente de colocalização do Mander para cada imagem unicelular, use a ferramenta de seleção oval para selecionar uma imagem unicelular no arquivo de imagem com os canais divididos e selecione Analisar, Colocalização e Limiar de Colocalização novamente. Em seguida, selecione o Canal 1 na caixa de diálogo para a região de interesse e clique em OK. Quando o coeficiente tiver sido calculado para todas as 100 imagens celulares, importe os resultados em uma planilha apropriada e repita a análise para a amostra celular não exposta de controle. Usando sequenciamento de RNA e análises de dados transcriptômicos, vários grandes aglomerados genéticos alterados, incluindo metabolismo lipídico e funções endócticas foram identificados nos DCs expostos ao poluente.
No nível de imagem celular individual, as células dendríticas positivas do HLADR CD11c podem ser fechadas, de acordo com sua coexpressão CD1d e Lamp1. O controle de células dendríticas não expostas demonstram uma colocalização mínima da proteína CD1d e Lamp1, indicando um nível basal de tráfico endocítico CD1d, e um alto nível de expressão superficial sob condições fisiológicas. Considerando que o CD1d é retido nos compartimentos endocíticos tardios de células dendríticas expostas a poluentes, confirmando perfis genéticos endocíticos alterados nesta população celular experimental.
Depois de fundir as imagens celulares individuais em um único arquivo de imagem, as imagens individuais podem ser divididas de acordo com sua expressão fluorófora, e a colocalização da intensidade do pixel entre os dois canais pode ser visualizada em um gráfico de dispersão. O grau de colocalização entre as proteínas CD1d e Lamp1 nos dois grupos de tratamento pode então ser quantificado usando os coeficientes de Mander. Se a intensidade proteica for hetergênea entre as áreas colocalizadas e não-colocalizadas, a intensidade colocalizada não será paralela às áreas colocalizadas, por isso também é importante avaliar ainda mais a colocalização das duas proteínas, com base na intensidade do pixel.
Uma vez dominada, a análise da imagem pode ser concluída em duas horas, e a configuração de sequenciamento de RNA pode ser concluída em três horas, se cada técnica for realizada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que todos os reagentes estão devidamente carregados nas posições corretas, e que não há vazamento no sequenciador. Após esse procedimento, outros métodos, como micro RNA, exome ou sequenciamento de células de mastro podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre expressão global de micro RNA, mutação genética ou metilação de DNA, respectivamente.
Assim, após seu desenvolvimento, essa técnica ajudará os pesquisadores no campo da análise de imagens celulares, e sequenciamento de próxima geração para explorar o efeito do poluente ambiental na expressão genética e na função proteica. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como configurar o sequenciamento da próxima geração, e a análise do imager da colocalização de proteínas. Não se esqueça que trabalhar com um produto químico tóxico em amostras de sangue humano pode ser extremamente perigoso.
Precauções como o uso de uma capa de fumaça química e equipamentos de proteção individual devem ser sempre tomadas na realização desses procedimentos.
