Esta pesquisa foi financiada pelo número de concessão PID2019-105128RB-I00 para RSA, JMB e AA, e PGC2018-095795-B-I00 para PFS e RML, ambos financiados por MCIN/AEI/10.13039/501100011033 e números de concessão B31_20R (RSA, JMA e AA) e E35_17R (PFS e RML) e financiados por Gobierno de Aragón. O trabalho da RSA foi apoiado por uma bolsa da Asociación Española Contra el Cáncer (AECC) PRDAR21487SOLE. Os autores gostariam de agradecer o uso do Servicio General de Apoyo a la Investigación-SAI, Universidad de Zaragoza.

NOTA: Todos os meios de cultura e composições de buffer são especificados na Tabela 1. Antes da geração do cybrid, os perfis de DNA mitocondrial e nuclear das células doadoras e receptoras devem ser tipados para confirmar a presença de diferenças genéticas em ambos os genomas entre as linhagens celulares. Neste estudo, uma linhagem celular L929 comercialmente disponível e sua linhagem celular derivada, L929dt, que foi gerada espontaneamente em nosso laboratório (ver13 para mais informações) foram usadas. Essas linhagens celulares apresentam duas diferenças na sequência de seu gene mt-Nd2 que podem ser usadas para confirmar a pureza do mtDNA uma vez terminado o processo de cibridização13. Neste caso, a pureza do fundo nuclear foi confirmada pela sensibilidade aos antibióticos, uma vez que, ao contrário das células L929dt, as L929 foram resistentes à geneticina.
1. Depleção mitocondrial pelo tratamento com rodamina 6G (células receptoras)
NOTA: O primeiro passo para a geração bem sucedida de cybrid é abolir completa e irreversivelmente as funções mitocondriais nas células receptoras. Para isso, é necessário determinar previamente, para cada linhagem celular, a concentração adequada e a duração do tratamento com rodamina 6G. Essa concentração adequada deve estar logo abaixo da morte celular induzida por drogas (a mais alta que não mata as células durante o tratamento). Execute o seguinte assim que as condições ideais forem definidas.
<ol><li>Semear10 6 células em uma placa de 6 poços usando meio de cultura completo (ver Tabela 1 para detalhes) e tratá-las diariamente com a concentração ideal de rodamina 6G por 3-10 dias, dependendo da linhagem celular. As concentrações tradicionais variam de 2 a 5 μg/mL por 3-10 dias20,21. Neste estudo, para células derivadas de L929, 2,5 μg/mL de rodamina 6G por 7 dias foi o tratamento selecionado13,22.</li>
	<li>Para manter as células vivas, complementar o meio de cultura celular com 50 μg/mL de uridina e 100 μg/mL de piruvato e renová-lo a cada 24 h.</li>
	<li>Após o tratamento e antes da fusão, trocar o meio de células tratadas com rodamina 6G para completar o meio de cultura celular sem rodamina 6G, e deixá-las neste meio por 3-4 h em estufa a 37 °C com 5% de CO2. OBS: O efeito tóxico da rodamina 6G é irreversível, e células com mitocôndrias não funcionais não devem se recuperar20. Assim, após o tratamento, as células que não recebem mitocôndrias funcionais devem morrer mesmo em meio de cultura suplementado com uridina. Portanto, nenhuma seleção nuclear deve ser necessária. No entanto, recomenda-se uma fusão controle de células tratadas com rodamina 6G sem mitocôndrias.</li>
</ol>2. Expansão e isolamento mitocondrial (células doadoras)
<ol><li>Expandir as células doadoras mitocondriais durante o lapso de tempo do tratamento com rodamina 6G para obter cerca de 25 x 106 células.</li>
	<li>No dia 7, colher células de crescimento exponencial em um tubo de 50 mL e coletá-las por centrifugação a 520 x g por 5 min à temperatura ambiente (TR). Lavar as células 3x com solução salina tamponada com fosfato frio (PBS) e sedimentá-las por centrifugação a 520 x g por 5 min em RT. A partir de agora, execute todas as etapas da extração mitocondrial a 4 °C, usando reagentes frios e mantendo os tubos com células ou mitocôndrias sobre gelo.</li>
	<li>Após a terceira centrifugação, descartar o sobrenadante por aspiração utilizando pipeta de vidro acoplada a uma bomba de vácuo e ressuspender as células empacotadas em um volume de tampão hipotônico igual a 7x o volume da pastilha celular. Em seguida, transfira a suspensão celular para um tubo homogeneizador e deixe as células incharem incubando-as no gelo por 2 min.</li>
	<li>Quebre as membranas celulares realizando de 8 a 10 golpes no homogeneizador acoplado a um pilão acionado por motor girando a 600 rpm. NOTA: A etapa de ruptura da membrana celular pode variar entre os tipos celulares; assim, ele tem que ser otimizado para cada tipo de célula.</li>
	<li>Adicione o mesmo volume de tampão hipertônico à suspensão celular (7x o volume da pastilha celular) para gerar um ambiente isotônico.</li>
	<li>Transferir o homogeneizado para um tubo de 15 mL e centrifuga-lo em um rotor fixo a 1.000 x g por 5 min a 4 °C. Em seguida, colete apenas 3/4 do sobrenadante deixando uma grande margem do pellet, para evitar contaminação com núcleos ou células intactas, e transfira-o para outro tubo. Repita o mesmo processo duas vezes. Observe que o sobrenadante deve ser mantido e o pellet descartado.</li>
	<li>Salve a fração mitocondrial (sobrenadante). Transferir para tubos de 1,5 ml e centrifugar à velocidade máxima (18.000 x g) durante 2 min a 4 °C.</li>
	<li>Eliminar o sobrenadante e lavar o pellet enriquecido com mitocôndrias com tampão A, combinando o conteúdo dos dois tubos num só e centrifugando nas mesmas condições descritas no passo 2.7. Repita o mesmo processo até que todo o material esteja em apenas um tubo.</li>
	<li>Realizar uma lavagem adicional com 300 μL de tampão A e quantificar a concentração de proteínas mitocondriais utilizando o ensaio de Bradford23. Para cada ensaio de cibridização, a quantidade ideal de mitocôndrias para o procedimento de transferência deve ser determinada (no nosso caso, uma concentração entre 10-40 μg de proteína mitocondrial por 10a 6 células).</li>
	<li>Simultaneamente, prepare as células pré-tratadas com rodamina 6G para a fusão, coletando-as em um tubo de 15 mL e centrifugando a 520 x g por 5 min na RT. Observe que o pellet adquire uma cor rosa neon devido ao tratamento com rodamina 6G.</li>
	<li>Para garantir que tanto a abolição da função mitocondrial nas células receptoras quanto a purificação da organela dos doadores tenham sido realizadas adequadamente, semeie um pequeno número de células tratadas com rodamina 6G e isole mitocôndrias usando o meio de cultura completo em uma placa de 6 poços e cultive-as por um mês para verificar se nenhuma célula sobrevivente permanece em nenhum dos poços (Figura 2).</li>
	<li>Em paralelo, avaliar a ausência de contaminantes nucleares na fração mitocondrial por imunodetecção de proteínas nucleares (i.e., lamina beta, histona H3, etc.) ou por amplificação quantitativa por reação em cadeia da polimerase (qPCR) de um gene nuclear (i.e., SDH, 18S rRNA, etc.). OBS: Para evitar contaminações, recomenda-se realizar todas as etapas em condições assépticas trabalhando sob uma capela de fluxo laminar.</li>
</ol>3. Fusão e geração de cybrid
<ol><li>Para prosseguir com a fusão, adicione cuidadosamente 106 das células tratadas com rodamina 6G à pastilha mitocondrial isolada (10-40 μg de proteína mitocondrial) e centrifugar a 520 x g por 5 min para permitir que as células se misturem com as mitocôndrias.</li>
	<li>Adicionar 100 μL de polietilenoglicol (PEG, 50%) e ressuspender suavemente o pellet por 30 s. Em seguida, deixe descansar intocado por mais 30 s.</li>
	<li>Finalmente, transfira a mistura para uma placa de 6 poços com meio de cultura de células completo fresco e coloque na incubadora a 37 °C com 5% de CO2. Após alguns dias (geralmente 1 semana), os cybrids transmitocondriais devem começar a crescer (Figura 2), dando origem a clones que podem ser selecionados individualmente ou misturados em um pool antes de sua análise.</li>
</ol>4. Verificação do fundo mitocondrial e nuclear
NOTA: Uma vez que a nova linhagem celular foi estabelecida e as células começam a crescer exponencialmente, a pureza de seus DNAs mitocondriais e nucleares deve ser verificada. Assim, as linhagens celulares originais devem abrigar diferentes mutações ou polimorfismos dentro de seus genomas para torná-las reconhecíveis.
<ol><li>Isolamento total do DNA<ol><li>Isolar o DNA genômico de todas as linhagens celulares usadas para geração de cybrid empregando um kit comercial de extração de DNA genômico (ver Tabela de Materiais) ou realizando um protocolo padrão usando extração de álcool fenol-clorofórmio-isoamílico e precipitação de álcool24.</li>
	</ol></li>
	<li>Avaliação do mtDNA (Figura 3) NOTA: Várias técnicas, tais como sequenciamento, análise de polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição (RFLP) ou qPCR alelo-específico, podem ser realizadas para analisar a pureza do mtDNA. Para confirmar a presença de variações na sequência do mtDNA por RFLP, siga os próximos passos do protocolo.<ol><li>Amplificar um fragmento de mtDNA contendo a alteração nucleotídica por PCR.<ol><li>Aqui, as células L929dt apresentam uma mutação do mtDNA na posição 4206, dentro de um gene mt-Nd2 (m.4206C>T) que está ausente nas células L929. Para confirmar a presença desta substituição nos cíbridos transocondriais, amplificar um fragmento de 397 pb por PCR usando um protocolo padrão e os seguintes primers: 1) 5'-AAGCTATCGGG CCCATACCCCG-3' (posições 3862-3884) e 2) 5'-TAATCAGAAGTGGAATGGGGCG -3' (posições 4236-4258).</li>
		</ol></li>
		<li>Analisar a presença da substituição nucleotídica desejada por RFLP, utilizando uma endonuclease específica que reconhece a mudança de sequência e gera um padrão de corte diferente para ambas as linhagens celulares. NOTA: Quando a variante L929dt mtDNA está presente (4206T), o amplicon obtido na etapa 4.2.1 contém dois sítios de restrição para SspI (ver Tabela de Materiais) que produz três fragmentos de DNA de 306 pb, 52 pb e 39 pb. O site de restrição que gera as bandas 52 e 39 é interrompido quando a versão wild-type (WT) C4206 está presente e uma nova banda de 91 bp aparece. Portanto, um controle interno para digestão completa para SspI é incluído na análise. A reação de digestão é realizada a 37 °C, seguindo as instruções do fabricante.</li>
		<li>Separe os fragmentos de restrição por eletroforese e compare o padrão de banda.<ol><li>Uma vez realizada a digestão, analisar os fragmentos de restrição obtidos por eletroforese em géis de poliacrilamida-Tris-borato-EDTA (TBE) a 10% (ver Tabela 1 para composição de 1x TBE). Executar a eletroforese a 80 V por 1 h na RT. Visualize os fragmentos de DNA após a coloração em gel em uma solução de brometo de etídio em 1x TBE por 15 min em RT (ver Tabela 1 para composição da solução de coloração em gel).</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Genotipagem do DNA nuclear NOTA: A genotipagem do DNA nuclear deve ser realizada usando a amostra de extração de DNA anterior empregada para análise de RFLP.<ol><li>Amplifique 16 loci (D21S11, CSF1PO, vWA, D8S1179, TH01, D18S51, D5S818, D16S539, D3S1358, D2S1338, TPOX, FGA, D7S820, D13S317, D19S433 e AMEL) usando um pool de oligonucleotídeos específicos comerciais (consulte a Tabela de Materiais).</li>
		<li>Realizar eletroforese utilizando analisador genético para separar os fragmentos previamente obtidos. NOTA: Uma vez amplificados, os diferentes loci são analisados por eletroforese usando um sistema capilar (ver Tabela de Materiais). Os fragmentos são separados em um capilar de 50 cm de comprimento preenchido com um polímero comercial. Tampões catódicos e anódicos também estão disponíveis comercialmente, como mostrado na Tabela de Materiais. A eletroforese é realizada a 19,5 kV por 20 min a 60 °C.</li>
		<li>Use ferramentas bioinformativas para determinar os alelos correspondentes a cada locus amplificado (ver Tabela de Materiais).</li>
		<li>Comparar os dados obtidos na etapa 4.3.3 com o banco de dados de perfil de DNA nuclear (Tabela 1), para verificar se o perfil de DNA nuclear coincide com o perfil de linhagem celular do receptor mitocondrial (Figura 4).</li>
	</ol></li>
</ol>

Geração de cíbridos transmitocondriais a partir de células cancerígenas em suspensão

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Desde que Otto Warburg relatou que as células cancerosas alteram seu metabolismo e potencializam a "glicólise aeróbica"3,4 enquanto reduzem a respiração mitocondrial, o interesse no papel das mitocôndrias na transformação e progressão do câncer tem crescido exponencialmente. Nos últimos anos, mutações no mtDNA e disfunção mitocondrial têm sido postuladas como características de muitos tipos decâncer25. Até o momento, num...

A reprogramação do metabolismo energético é uma marca do câncer1 que foi observada pela primeira vez por Otto Warburg na década de 19302. Em condições aeróbicas, as células normais convertem a glicose em piruvato, que gera acetil-coA, alimentando a maquinaria mitocondrial e promovendo a respiração celular. No entanto, Warburg demonstrou que, mesmo sob condições normóxicas, a maioria das células cancerosas converte piruvato obtido do processo de glicólise em lactato, mudando seu caminho para obter energia. Esse ajuste metabólico é conhecido como "efeito Warburg" e permite que algumas células cancerosas suprim suas demandas energéticas de rápido crescimento e divisão, apesar de gerarem ATP de forma menos eficiente que o processo aeróbio 3,4,5. Nas últimas décadas, numerosos trabalhos têm apoiado a implicação da reprogramação metabólica na progressão do câncer. Assim, a energética tumoral é considerada um alvo interessante contra ocâncer1. Como um centro central no metabolismo energético e no fornecimento de precursores essenciais, as mitocôndrias desempenham um papel fundamental nessas adaptações celulares que, até o momento, compreendemos apenas parcialmente.
Em consonância com o exposto, mutações no DNA mitocondrial (mtDNA) têm sido propostas como uma das possíveis causas dessa reprogramação metabólica, o que poderia levar a um comprometimento do desempenho da cadeia de transporte de elétrons (ETC)6 e explicaria por que algumas células cancerosas melhoram seu metabolismo glicolítico para sobreviver. De fato, tem sido relatado que o mtDNA acumula mutações dentro das células cancerosas, estando presente em pelo menos 50% dostumores7. Por exemplo, um estudo recente realizado por Yuan e col. relatou a presença de moléculas hipermutadas e truncadas do mtDNA em cânceres de rim, colorretal e tireoide8. Além disso, muitos trabalhos têm demonstrado que certas mutações no mtDNA estão associadas a um fenótipo tumoral mais agressivo e a um aumento no potencial metastático de células cancerígenas9,10,11,12,13,14,15,16.
Apesar da aparente relevância do genoma mitocondrial na progressão do câncer, o estudo dessas mutações e sua contribuição para a doença têm sido desafiadores devido às limitações dos modelos experimentais e tecnologias atualmentedisponíveis17. Assim, novas técnicas para entender o real impacto do DNA mitocondrial no desenvolvimento e progressão da doença oncológica são necessárias. Neste trabalho, apresentamos um protocolo para geração de cibridos transmitocondriais a partir de células cancerosas em suspensão, baseado na repopulação de células pré-tratadas com rodamina 6G com mitocôndrias isoladas, que supera os principais desafios dos métodos tradicionais de cibridização18,19. Essa metodologia permite o uso de qualquer doador de núcleos independentemente da disponibilidade de sua linhagem celular ρ0 correspondente e a transferência de mitocôndrias de células que, seguindo as técnicas tradicionais, seriam difíceis de enuclear (i.e., linhagens celulares não aderentes).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3500XL Genetic Analyzer&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4406016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>08-772-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AmpFlSTR Identifiler Plus PCR Amplification Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4427368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anode Buffer Container 3500 Series</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4393927</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>PanReac</td>
			<td>131015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford assay</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>5000002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cathode Buffer Container 3500 Series</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4408256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flasks</td>
			<td>TPP</td>
			<td>90076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>PanReac</td>
			<td>131026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium Bromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E8751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geneticin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10131027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer Teflon pestle</td>
			<td>Deltalab</td>
			<td>196102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L929 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniProtean Tetra4 Gel System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR primers</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Custom products</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyacrylamide Solution 30%</td>
			<td>PanReac</td>
			<td>A3626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POP-7</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4393714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAmp DNA Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>51306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine-6G</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R4127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum Fetal Bovine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SspI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin/penicillin</td>
			<td>PAN biotech</td>
			<td>P06-07100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>PanReac</td>
			<td>P14030b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U3750</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transmitochondrial cybrid generation using cancer cell lines

Nos últimos anos, o número de estudos dedicados a determinar a ligação entre mitocôndrias e câncer aumentou significativamente. No entanto, mais esforços ainda são necessários para compreender completamente a ligação envolvendo alterações nas mitocôndrias e tumorigênese, bem como para identificar fenótipos mitocondriais associados ao tumor. Por exemplo, para avaliar a contribuição das mitocôndrias nos processos de tumorigênese e metástases, é essencial entender a influência das mitocôndrias de células tumorais em diferentes ambientes nucleares. Para isso, uma possível abordagem consiste em transferir mitocôndrias para um fundo nuclear diferente para obter as chamadas células cybrid. Nas técnicas tradicionais de cibridização, uma linhagem celular sem mtDNA (ρ0, célula doadora nuclear) é repovoada com mitocôndrias derivadas de células enucleadas ou plaquetas. No entanto, o processo de enucleação requer boa adesão celular à placa de cultura, característica que é parcial ou completamente perdida em muitos casos em células invasivas. Além disso, outra dificuldade encontrada nos métodos tradicionais é conseguir a remoção completa do mtDNA endógeno da linhagem celular receptora mitocondrial para obter fundos de DNA nuclear e mitocondrial puro, evitando a presença de duas espécies diferentes de mtDNA no cybrid gerado. Neste trabalho, apresentamos um protocolo de troca mitocondrial aplicado a células cancerosas em crescimento em suspensão, baseado na repopulação de células pré-tratadas com rodamina 6G com mitocôndrias isoladas. Esta metodologia permite superar as limitações das abordagens tradicionais e, assim, pode ser utilizada como uma ferramenta para ampliar a compreensão do papel mitocondrial na progressão e metástase do câncer.

Reprogramming energy metabolism is a hallmark of cancer1 that was observed for the first time by Otto Warburg in the 1930s2. Under aerobic conditions, normal cells convert glucose into pyruvate, that then generates acetyl-coA, fuelling the mitochondrial machinery and promoting cellular respiration. Nevertheless, Warburg demonstrated that, even under normoxic conditions, most cancer cells convert pyruvate obtained from the glycolysis process into lactate, shifting their way to obtain energy. This metabolic adjustment is known as the &#34;Warburg effect&#34; and enables some cancer cells to supply their energetic demands for rapid growth and division, despite generating ATP less efficiently than the aerobic process3,4,5. In recent decades, numerous works have supported the implication of metabolism reprogramming in cancer progression. Hence, tumor energetics is considered an interesting target against cancer1. As a central hub in energetic metabolism and in the supply of essential precursors, mitochondria play a key role in these cell adaptations that, to date, we only partially understand.
In line with the above, mitochondrial DNA (mtDNA) mutations have been proposed as one of the possible causes of this metabolic reprogramming, which could lead to an impaired electron transport chain (ETC) performance6 and would explain why some cancer cells enhance their glycolytic metabolism to survive. Indeed, it has been reported that mtDNA accumulates mutations within cancer cells, being present in at least 50% of tumors7. For example, a recent study carried out by Yuan et al. reported the presence of hypermutated and truncated mtDNA molecules in kidney, colorectal, and thyroid cancers8.&#160;Moreover, many works have demonstrated that certain mtDNA mutations are associated with a more aggressive tumor phenotype and with an increase in the metastatic potential of cancer cells9,10,11,12,13,14,15,16.
Despite the apparent relevance of the mitochondrial genome in cancer progression, the study of these mutations and their contribution to the disease have been challenging due to limitations in the experimental models and technologies currently available17. Thus, new techniques to understand the real impact of mitochondria DNA in cancer disease development and progression are needed. In this work, we introduce a protocol for transmitochondrial cybrid generation from suspension-growing cancer cells, based on the repopulation of rhodamine 6G-pretreated cells with isolated mitochondria, that overcomes the main challenges of traditional cybridization methods18,19. This methodology allows the use of any nuclei donor regardless of the availability of their corresponding &#961;0 cell line and the transfer of mitochondria from cells that, following the traditional techniques, would be difficult to enucleate (i.e., non-adherent cell lines).

Autor em destaque: Geração de cíbridos transmitocondriais usando linhas de células cancerígenas  

Geração de Cybrid Transmitochondrial Usando Linhas de Células Cancerígenas

This research aims to better understand the contribution of mitochondrion in cancer progression and metastasis. The transmitochondrial cybrid generation can help us to elucidate how and at what level mitochondrial genotypes are involved in the aggressiveness of a tumor cell. One of the technologies to obtain information on mitochondrial role in cancer is cybrid generation.We combine this tool with a variety of other methods that include donative electrophoresis, respiration analysis and other mitochondrial functional assays, flow cytometry, proteomics, et cetera. The plasticity of cancer cells together with the interaction networks between nuclear and mitochondrial genes, increases the complexity of our experiments and data interpretation. This is one of the reasons why is necessary to develop a new experimental approaches.One of the most exciting findings from our research has been the discovery of two mitochondrial DNA mutations associated with detachment of cells from the play dish resembling metastasis generation and making the cells completely dependent on aerobic glycolysis, and also making them more tumorigenic and metastatic in in vivo models. This mitochondria exchange protocol can be applied to suspension growing cancer cells. The chronology can overcome the limitations of traditional approaches where the nucleation process and the complete removal of mitochondrial DNA from mitochondrial recipient cell lines often become a real challenge.

Após seguir o protocolo acima apresentado, deve-se obter uma linhagem celular homoplasmática cybrid com fundo nuclear conservado, mas com um novo genótipo mitocondrial, conforme representado nos esquemas da Figura 1 e Figura 2. A pureza do DNA mitocondrial e nuclear presente nos cibrídeos pode ser confirmada por RFLP, como mostrado na Figura 3, e pela análise de genotipagem do DNA nuclear, como mostrado na ...

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Este protocolo descreve uma técnica para geração de cybrid a partir de células cancerosas em crescimento em suspensão como uma ferramenta para estudar o papel das mitocôndrias no processo tumorigênico.

In recent years, the number of studies dedicated to ascertaining the connection between mitochondria and cancer has significantly risen. However, more ...

Esta pesquisa visa compreender melhor a contribuição das mitocôndrias na progressão do câncer e metástase. A geração de cibridos transocondriais pode nos ajudar a elucidar como e em que nível genótipos mitocondriais estão envolvidos na agressividade de uma célula tumoral. Uma das tecnologias para obter informações sobre o papel mitocondrial no câncer é a geração de cibridos.Combinamos esta ferramenta com uma variedade de outros métodos que incluem eletroforese donativa, análise respiratória e outros ensaios funcionais mitocondriais, citometria de fluxo, proteômica, etc. A plasticidade das células cancerosas, juntamente com as redes de interação entre genes nucleares e mitocondriais, aumenta a complexidade de nossos experimentos e interpretação de dados. Esta é uma das razões pelas quais é necessário desenvolver uma nova abordagem experimental.Uma das descobertas mais empolgantes de nossa pesquisa foi a descoberta de duas mutações no DNA mitocondrial associadas ao descolamento de células do prato de jogo, assemelhando-se à geração de metástases e tornando as células completamente dependentes da glicólise aeróbica, além de torná-las mais tumorigênicas e metastáticas em modelos in vivo. Este protocolo de troca mitocondrial pode ser aplicado à suspensão de células cancerosas em crescimento. A cronologia pode superar as limitações das abordagens tradicionais, onde o processo de nucleação e a remoção completa do DNA mitocondrial de linhagens celulares receptoras mitocondriais muitas vezes se tornam um verdadeiro desafio.

transmitochondrial-cybrid-generation-using-cancer-cell-lines

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Transmitochondrial Cybrid Generation Using Cancer Cell Lines

1.6K visualizações.  University of Zaragoza. Esta pesquisa visa compreender melhor a contribuição das mitocôndrias na progressão do câncer e metástase. A geração de cibridos transocondriais pode nos ajudar a elucidar como e em que nível genótipos mitocondriais estão envolvidos na agressividade de uma célula tumoral. Uma das tecnologias para obter informações sobre o papel mitocondrial no câncer é a geração de cibridos.Combinamos esta ferramenta com uma variedade de outros métodos que incluem eletroforese donati...

Vídeo: Autor em destaque: Geração de cíbridos transmitocondriais usando linhas de células cancerígenas  

In recent years, the number of studies dedicated to ascertaining the connection between mitochondria and cancer has significantly risen. However, more efforts are still needed to fully understand the link involving alterations in mitochondria and tumorigenesis, as well as to identify tumor-associated mitochondrial phenotypes. For instance, to evaluate the contribution of mitochondria in tumorigenesis and metastasis processes, it is essential to understand the influence of mitochondria from tumor cells in different nuclear environments. For this purpose, one possible approach consists of transferring mitochondria into a different nuclear background to obtain the so-called cybrid cells. In the traditional cybridization techniques, a cell line lacking mtDNA (&#961;0, nuclear donor cell) is repopulated with mitochondria derived from either enucleated cells or platelets. However, the enucleation process requires good cell adhesion to the culture plate, a feature that is partially or completely lost in many cases in invasive cells. In addition, another difficulty found in the traditional methods is achieving complete removal of the endogenous mtDNA from the mitochondrial-recipient cell line to obtain pure nuclear and mitochondrial DNA backgrounds, avoiding the presence of two different mtDNA species in the generated cybrid. In this work, we present a mitochondrial exchange protocol applied to suspension-growing cancer cells based on the repopulation of rhodamine 6G-pretreated cells with isolated mitochondria. This methodology allows us to overcome the limitations of the traditional approaches, and thus can be used as a tool to expand the comprehension of the mitochondrial role in cancer progression and metastasis.

This protocol describes a technique for cybrid generation from suspension-growing cancer cells as a tool to study the role of mitochondria in the tumorigenic process.

Pesquisa do câncer

Mitochondrial Depletion by Rhodamine 6G for Transmitochondrial Cybrid Generation

To perform mitochondrial depletion of the mitochondrial recipient cell line, seed 1 million cells in a six-well plate using complete culture medium containing 10%FBS and Penicillin-Streptomycin. Treat the cells daily with the optimal concentration of Rhodamine 6G for three to seven days, depending on the type of cell line. To keep the cells alive, supplement the cell culture medium with 50 micrograms per milliliter of uridine and 100 micrograms per milliliter of pyruvate.After treatment and prior to fusion with a mitochondria isolated from the donor cell line, remove the medium of Rhodamine 6G treated cells and add complete cell culture medium without Rhodamine 6G. Incubate the cells at 37 degrees Celsius with 5%carbon dioxide for three to four hours. Finally, to prepare the Rhodamine 6G pretreated cells for the fusion, collect them in a 15-milliliter tube, and centrifuge the tube at room temperature and 520G for five minutes.Note that the pellet acquires a neon pink color due to Rhodamine 6G treatment.

Depleção mitocondrial por rodamina 6G para geração de cibridas transocondriais

Mitochondrial Isolation for Transmitochondrial Cybrid Generation

Once around 25 million mitochondria donor cells are obtained on day seven, harvest the exponentially grown cells in a 50-milliliter tube and collect them by centrifuging at room temperature and 520g for five minutes. Wash the cells with cold phosphate-buffered saline and sediment them by centrifugation at room temperature in 520g for five minutes. Now onwards, perform the whole mitochondrial extraction at four degrees Celsius using cold reagents and keep the cells or mitochondria on ice.After the third centrifugation, discard the supernatant by aspiration using a glass pipette coupled to a vacuum pump and resuspend the packed cells in a volume of hypotonic buffer equal to seven times the cell pellet volume. Then transfer the cell suspension into a homogenizer tube and let the cells swell by incubating them on ice for two minutes. Break the cell membranes by performing 8 to 10 strokes in the homogenizer coupled to a motor-driven pestle rotating at 600 rotations per minute.Into the cell homogenate, add the hypotonic buffer equal to seven times the volume of the initial pellet to generate an isotonic environment. Transfer the homogenate into a 15-milliliter tube and centrifuge it in a fixed rotor at 1, 000g and four degrees Celsius for five minutes. Then collect only 3/4 of the supernatant, leaving a large margin from the pellet to avoid contamination with nuclei or intact cells and transfer it to another tube.After repeating the process twice, transfer the supernatant containing the mitochondrial fraction into 1.5-milliliter tubes. Centrifuge the tubes at the maximum speed of 18, 000g for two minutes at four degrees Celsius. Discard the supernatant and wash the mitochondria-enriched pellet with buffer A.Combine the content of the two tubes into one and centrifuge as demonstrated before.Repeat the process until all the material is in only one tube. Wash the pellet obtained from the last centrifugation using 300 microliters of buffer A.Quantify the mitochondrial protein concentration using the Bradford assay. Before fusion with the mitochondrial recipient cell line, evaluate the absence of nuclei contaminants in the mitochondrial fraction by immunodetection of nuclear proteins.Alternatively perform quantitative polymerase chain reaction or QPCR amplification of a nuclear gene.

Isolamento Mitocondrial para Geração de Cibridas Transmitocondrial

Fusion and Transmitochondrial Cybrid Generation

For transmitochondrial cybrid generation, use the mitochondrial recipient cells that have been depleted to mitochondria by Rhodamine 6G treatment, and perform fusion with mitochondria isolated from the mitochondria donor cells. Ensure proper mitochondrial function abolishment in recipient cells and organelle purification from donor cells by seeding a small number of Rhodamine 6G-treated cells and isolated mitochondria in complete culture medium in a six-well plate. Check for no surviving cells remaining in the wells after one month of culture.To proceed with the fusion, carefully add the Rhodamine 6G-treated cells to the isolated mitochondria pellet. Then centrifuge at 520g for five minutes to allow the cells to mix with the mitochondria. Add 100 microliters of 50%polyethylene glycol and gently resuspend the pellet for 30 seconds Then allow the suspension to rest untouched for another 30 seconds.Finally, transfer the mix into a six-well plate with fresh complete cell culture medium, and place it in the incubator at 37 degrees Celsius with 5%carbon dioxide. Usually, after about one week, transmitochondrial cybrids should start growing, giving rise to clones that can be individually selected or mixed in a pool prior to their analysis. The restriction fragments obtained from the restriction fragment length polymorphism, or RFLP, analysis of wild-type mitochondria differed from the mutant one.The RFLP analysis of the new transmitochondrial cell lines indicated that restriction fragments were identical to those obtained in their respective mitochondrial donors and different from those generated with the recipient cell lines. Further, the difference in a typical DNA nuclear genotyping profile of the two cell lines used in the hybridization process could also be used to confirm nuclear DNA purity.