Este método pode ajudar a responder perguntas-chave sobre a configuração da via metabólica em células de leucemia. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a medição do metabolismo das células primárias de leucemia em tempo real em células vivas. Comece diluindo uma amostra de medula óssea obtida de um paciente com leucemia na PBS em uma proporção de um para um.
Cuidadosamente, camada seis mililitros da amostra de medula óssea diluída sobre seis mililitros de gradiente de densidade recém-preparado em um tubo cônico de 15 mililitros e separar as células por centrifugação gradiente de densidade. Use um pipet Pasteur para transferir cuidadosamente a camada de interface das células mononucleares para um novo tubo cônico de 50 mililitros contendo cinco mililitros de PBS para uma lavagem de centrifugação. Em seguida, resuspenque a pelota de célula mononuclear em dois mililitros de PBS estéreis para contar.
Diluir as células para três vezes 10 às sete células por concentração mililitro. E adicione um mililitro de células a cada um dos dois frascos T75 contendo 20 mililitros de meio RPMI para uma incubação de 16 a 24 horas a 37 graus Celsius e 5%de CO2. Enquanto isso, para preparar as placas para análise de fluxo extracelular, adicione 12,5 microliters de solução adesiva celular em cada poço de duas, oito placas de analisador de fluxo extracelular.
Após 20 minutos, aspire o adesivo da célula e lave cada poço duas vezes com 200 microliters de água estéril por lavagem. Após a segunda lavagem, deixe as placas no capô até que os poços estejam secos. E coloque o cartucho de sensor de cabeça para baixo no banco do laboratório.
Separe a placa de utilidade e o cartucho do sensor do analisador de fluxo. E encha cada poço da placa de utilidade com 200 microliters de calibrante e cada fosso ao redor dos poços com 400 microliters de calibrante. Devolva o cartucho do sensor para a placa de utilidade que agora contém o calibrador e coloque o conjunto do cartucho em uma incubadora umidificada de 37 graus Celsius sem CO2 durante a noite.
Em seguida, ligue o analisador de fluxo extracelular e deixe aquecer a 37 graus Celsius durante a noite. Na manhã seguinte, transfira as células do frasco para tubos cônicos de 50 mililitros para centrifugação. E resuspense as pelotas em um mililitro do meio experimental apropriado para contar.
Resuspensar as células em quatro vezes 10 para as seis células em 400 microliters de concentração média experimental. E adicione 50 microliters de células em poços B a G da placa analisadora de fluxo. E 180 microliters do meio experimental em poços A e H como poços de controle de fundo.
Após a centrifugação lentamente e cuidadosamente adicione 130 microlitros do meio experimental aos poços B através de G.E confirme visualmente a adesão estável das células ao fundo de cada poço sob o microscópio. Em seguida, retorne a placa de análise de fluxo para a incubadora umidificada de 37 graus Celsius sem CO2 por 30 minutos. 20 minutos antes do término da incubação, carregue os compostos nas portas injetoras apropriadas do cartucho de acordo com o protocolo experimental, conforme indicado na tabela.
Em seguida, configure o programa de análise de fluxo extracelular apropriado. Inicie o programa e substitua a placa calibrante pela placa de ensaio quando solicitado. Em um teste de estresse de glicolise, apenas o meio basal é usado para que as células sejam privadas de nutrientes.
O primeiro parâmetro obtido é a acidificação basal que deve refletir a quantidade de glicose armazenada nas células. Após a primeira injeção, a taxa de acidificação extracelular é aumentada à medida que as células utilizam a glicose e podem fermentar a glicose para lactato. A oligomicina A na segunda injeção inibe a synthase ATP e, portanto, direciona as células a produzir ATP principalmente por uma glicolise causando uma elevação adicional da taxa de acidificação extracelular.
Enquanto a injeção de 2-Deoxy-D-glicose inibe completamente a glicólise e a taxa de acidificação extracelular cai. No teste de estresse mito celular, um meio suplementado com glutamina e glicose é usado para que as células não sejam privadas de todos os nutrientes. O parâmetro de respiração basal reflete seu estado metabólico basal.
Após a primeira injeção com oligomicina A, as células inibem a respiração mitocondrial e mudam para glicólise que é representada como uma diminuição na taxa de consumo de oxigênio. A segunda e terceira injeções de FCCP, no entanto, desacoplar a produção de ATP da respiração para que as células agora consumam oxigênio a uma taxa máxima. E a taxa de consumo de oxigênio sobe para seu maior valor.
A última injeção da mistura rotenona e antimicina A inibe completamente a respiração mitocondrial diminuindo a taxa de consumo de oxigênio para quase zero. Ao tentar este procedimento, é importante avaliar a porcentagem de explosões na amostra para garantir que os parâmetros metabólicos dos leucemias sejam medidos apenas. Ao implementar esse método, é preciso aplicar uma otimização cuidadosa às condições de cultivo e à normalização dos dados.
