Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave sobre perturbações em redes de sinalização que podem causar o crescimento do câncer ou o desenvolvimento de resistência a terapias específicas. A principal vantagem dessa técnica é que ela pode fornecer feedback rápido e confiável sobre o estado de fosforilação de múltiplas redes que são frequentemente desregulamentadas no câncer. A implicação dessa técnica se estende à terapia de cânceres resistentes a medicamentos, pois a identificação de alterações e modificações pós-translacionais pode elucidar mudanças na atividade da via transdução de sinais.
Embora esta técnica seja usada na fosforilação, ela também pode ser usada para olhar outras modificações pós-translacionais, como glicosilação e ubiquização. Comece enxaguando completamente as células cultivadas durante a noite três vezes com 10 mililitros de PBS tomando cuidado para remover todo o PBS após a última lavagem. Em seguida, adicione o volume apropriado de tampão de lise do kit de ensaio de proteínas e use um raspador de células para desprender as células.
Triturar a solução celular resultante aproximadamente 10 vezes antes de transferir pelo menos uma vez 10 para a sétima célula para um tubo de 1,5 mililitro. Incubar as células por 30 minutos a quatro graus Celsius com agitação. Em seguida, carregue o lise em uma seringa equipada com uma agulha calibre 27 e aspire e dispense a amostra 10 vezes para escorar as membranas celulares.
Quando as membranas celulares tiverem sido completamente interrompidas, centrifufique o lise e transfira o supernasal para um novo tubo de 1,5 mililitro para quantificação total de proteínas subsequente de acordo com os protocolos padrão. Para realizar um ensaio de fosfokinase humano, primeiro use pinças de ponta plana para colocar uma membrana de matriz em cada poço de uma bandeja multi-bandeja de quatro poços contendo dois mililitros de tampão de matriz recém-preparado um por poço com o número de membranas voltadas para cima. Após a submersão, o corante na membrana desaparecerá.
Cubra a bandeja com uma tampa e incuba as membranas em um agitador de plataforma de balanço por 60 minutos em temperatura ambiente. Durante esta incubação de bloqueio, diluir cada amostra de lise para 50 a 100 microgramas de concentração de proteína em um volume máximo de 334 microliters de tampão de lise e trazer o volume final de amostra de proteína extraída até 1,5 mililitros com tampão de matriz fresco. Em seguida, aspire cuidadosamente o tampão de matriz de cada poço da multi bandeja e incubar as membranas com 1,5 mililitros de amostra de proteína por poço durante a noite a dois a oito graus Celsius em um agitador de plataforma de balanço.
Na manhã seguinte, transfira cuidadosamente cada matriz para recipientes plásticos individuais contendo 20 mililitros de tampão de lavagem para três lavagens de 10 minutos em uma plataforma de balanço em temperatura ambiente. Após a última lavagem, adicione 20 microliters do coquetel de anticorpos reconstituídos apropriados a dois mililitros de tampão de matriz, dois por poço, e limpe cuidadosamente a borda inferior de cada membrana em uma toalha de papel para remover qualquer excesso de tampão de lavagem. Em seguida, coloque cada matriz de volta no poço apropriado da bandeja de anticorpos e cubra a bandeja para uma incubação de duas horas à temperatura ambiente em uma plataforma de balanço.
No final da incubação, transfira cuidadosamente cada matriz para um novo recipiente plástico de oito por 11 centímetros contendo 20 mililitros de tampão de lavagem para três lavagens de 10 minutos, como apenas demonstrado. Após a última lavagem, adicione um mililitro de uma solução de rabanete de rabanete de cavalo streptavidina apropriada para cada poço da bandeja multi-poço e devolva as membranas aos seus poços apropriados para uma incubação de 30 minutos à temperatura ambiente. No final da incubação, coloque cada membrana entre dois pedaços de papel filtro de cinco milímetros para remover qualquer excesso de tampão e incubar as membranas secas com uma solução de detecção de peroxidase de rabanete apropriada por três minutos.
Em seguida, coloque as membranas em protetores de folhas de plástico transparentes individuais para imagens subsequentes. Para avaliar a expressão de quinase receptora em cada amostra, abra as imagens em um programa de processamento de imagem apropriado, como a Imagem J e selecione Editar e Inverter dos menus suspensos apropriados para inverter as manchas pretas no fundo branco da imagem para manchas brancas em um fundo preto. Em seguida, use a ferramenta Oval para cercar um par de pontos brancos na mancha de ponto e selecione Analisar e Medir para abrir automaticamente uma nova janela exibindo os valores para a área selecionada.
Em seguida, coloque o ponto da seta do mouse no centro do oval e arraste a área circular ao redor da próxima área de ponto até que todos os pontos de interesse tenham sido medidos. Neste experimento representativo, os efeitos da resistência do inibidor de tyrosina quinase nas vias de transdução de sinal foram analisados em um controle em três linhas celulares resistentes ao inibidor de tyrosina quinase. Foram escolhidas seis proteínas fosfo com atividade diferencial e a intensidade relativa foi determinada para várias proteínas candidatas em cada linha celular.
Como demonstrado pelo mapa de calor, uma leitura semi-quantitativa sobre as mudanças na fosforilação proteica de importantes proteínas de transdução de sinal poderia então ser gerada. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de começar com células saudáveis e ativamente divididas, pois os estressores podem induzir alterações na atividade da via de transdução de sinal. Após esse procedimento, outros métodos como PCR digital e imunoblotting podem ser usados para responder a perguntas adicionais, como mudanças na fosforilação levam à ativação de fatores de transcrição?
Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores da biologia do câncer explorarem mudanças fundamentais na modificação pós-translacional de proteínas que levam ao advento da medicina personalizada para pacientes com câncer. Não se esqueça que trabalhar com linhas de células cancerosas é extremamente perigoso, por isso não deixe de usar técnicas assépticas, cuidado ao descartar afiadas e usar um jaleco o tempo todo.
