As mitocôndrias são essenciais para a saúde neuronal. Em muitas doenças neurodegenerativas, as mitocôndrias axonais são as primeiras a sofrer, mas não está claro o que torna as mitocôndrias axonais tão especiais. O gradiente de pressão fluídica nas câmaras utilizadas neste protocolo permite o tratamento seletivo dos axônios das mitocôndrias.
Isso deixa os processos do corpo celular inalterados e nos permite focar na biologia axonal. Mostramos aqui a despolarização das mitocôndrias com um corante sensível ao potencial de membrana, mas esse método pode ser aplicado a muitos tipos diferentes de células neuronais e leituras fluorescentes. Para começar, coloque as seis placas de poço codificadas em um exaustor estéril e lave-as duas vezes com água destilada dupla estéril.
Deixe as placas secarem em uma posição inclinada por três a cinco minutos. Remova o excesso de água por sucção a vácuo ou pipetagem. Em seguida, mergulhe a câmara microfluídica em etanol a 80%.
Novamente, seque a câmara microfluídica por três a cinco minutos em uma posição inclinada e remova o excesso de etanol com uma ponta de pipeta. Quando completamente seco, coloque a câmara microfluídica no centro do poço e da placa. Bata suavemente na câmara microfluídica em suas bordas e na seção de microsulco no meio para fixação adequada à placa de vidro.
Primeiro, colete o número desejado de neurônios do hipocampo dissociados em um tubo de reação de 1,5 mililitro. Centrifugar o tubo a 1000 vezes G durante quatro minutos à temperatura ambiente. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em oito microlitros de meio neurobasal B-27.
Em seguida, dispense a solução celular na entrada do canal da câmara microfluídica. Toque na parte de trás da placa para ajudar o fluxo através do canal. Usando uma pipeta, aspirar qualquer suspensão de célula restante na saída do canal.
Incubar a câmara microfluídica com células durante 15 a 20 minutos a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Em seguida, preencha o poço axonal superior com 50 microlitros de meio neurobasal B-27 e toque na parte de trás da placa para ajudar no fluxo. Preencha cada poço no lado do soma com 150 microlitros de meio neurobasal B-27, criando uma bolha de tensão no topo.
Também encha ambos os poços do lado axonal com 100 microlitros de B-27 meios neurobasais cada. Após sete a oito dias de cultura in vitro, certifique-se de que os axônios cresceram através dos microsulcos e se estenderam para o compartimento axonal. Lave o dispositivo removendo o meio neurobasal B-27 e adicionando 100 microlitros de meio de imagem pré-aquecido aos poços superiores dos canais axonal e soma.
Deixe o meio fluir através dos poços inferiores. Retire o meio dos poços inferiores, e qualquer meio remanescente dos poços superiores, e repita com meio fresco, deixando os poços vazios no final da lavagem. Em seguida, adicione 100 microlitros de cinco diluições de TMRE nanomolares aos poços somática e axonal.
Deixe o meio fluir através de ambos os compartimentos, até que haja um volume igual em todos os poços. Encha com o meio contendo TMRE. Selecione uma região de interesse no compartimento somático e siga-a através dos microsulcos até o compartimento axonal.
Certifique-se de que os micro sulcos fotografados nos compartimentos somático e axonal sejam combinados entre si. Depois de alterar o nome do arquivo, adquira imagens de fluorescência vermelha usando excitação de 561 nanômetros e comprimentos de onda de emissão de 625 nanômetros. Garanta uma diferença de volume entre as câmaras soma e axonal, verificando a presença de uma bolha de tensão no lado somático.
Em seguida, remova o meio de imagem de ambos os poços do lado axonal, exceto do meio dentro do canal. Para induzir a despolarização mitocondrial, adicione 160 microlitros de 20 antimicina A micromolar diluídos no meio de imagem ao poço axonal superior. Deixe-o fluir através do canal até que haja um volume igual em ambos os poços axonais.
Repita a imagem, garantindo que as mesmas posições sejam visualizadas durante a aquisição da linha de base, identificando os microsulcos. Usando este protocolo, os neurônios primários do hipocampo foram cultivados em dispositivos microfluídicos, seguidos por coloração mitocondrial com um corante sensível à membrana, TMRE. A coloração homogênea das mitocôndrias foi observada em ambos os lados dos microsulcos, mas não no meio.
Após a adição de antimicina A ao lado axonal, as mitocôndrias somal mantiveram o sinal TMRE, enquanto a fluorescência foi perdida das mitocôndrias axonais Certifique-se de que nenhuma umidade seja deixada no poço ou no dispositivo antes de montar o dispositivo. Caso contrário, as câmaras não serão seladas. Usando este método, podemos estudar os efeitos da perda da função mitocondrial no axônio e funções locais, bem como sua influência na sinalização retrógrada e na sobrevivência celular global.
Acreditava-se que a biogênese mitocondrial acontecia exclusivamente no corpo celular. Este método permitiu-nos revelar que o dano das mitocôndrias axonais exigia a tradução local da proteína PINK1.
