Os portadores de drogas de polímero cationic têm as vantagens de boa estabilidade, baixa imunogenicidade e preparação e modificação fáceis. Aqui, oferecemos um método rápido e simples para sua síntese. O método de polimerização da cadeia de transferência de adição reversível é um método aplicável para produzir polímeros de bloco com peso molecular controlado e estrutura e carregando grupos funcionais.
Esses portadores de drogas podem transportar simultaneamente diferentes drogas para alcançar o tratamento colaboratório do câncer, inflamação e outras doenças. A polimerização IFT é um método clássico, e este protocolo dá um exemplo de sua aplicação na terapia genética. A chave para o sucesso para a síntese deste polímero é controlar precisamente a temperatura de reação.
É mais aconselhável usar um banho de óleo do que um banho de água. Para iniciar este procedimento, obtenha um frasco de fundo redondo com uma rolha de borracha e um agitador magnético para ser usado como garrafa de polimerização. Dissolva 1,87 gramas de bis-hidroxi HEMA em um mililitro de água destilada na garrafa de polimerização.
Em um béquer de cinco mililitros, dissolva 0,03 gramas de CTP e 0,02 gramas de ACVA em 0,5 mililitros de 1, 4-dioxano. Adicione essa mistura à garrafa de polimerização. Em seguida, use uma armadilha de condensado para congelar a solução na garrafa de polimerização.
Fixar a garrafa no suporte de ferro, e use um conduíte tropeçado com uma agulha para aspirar e injetar nitrogênio na mistura de reação. Em seguida, sele a garrafa de polimerização e descongele a solução à temperatura ambiente por 30 minutos. Repita este ciclo de congelamento da bomba três vezes.
Depois disso, coloque a garrafa em um banho de óleo a 70 graus Celsius e deixe a solução reagir por 24 horas sob a atmosfera de nitrogênio. No dia seguinte, esfrie a garrafa de polimerização a zero graus Celsius e abra a rolha de borracha para terminar a reação de polimerização. Em seguida, acetona pré-doença em uma geladeira a 20 graus Celsius negativos por duas horas, e misture-a com a solução de reação na garrafa de polimerização a uma proporção de 50 para um.
Centrifugar esta mistura a 8.200 vezes g por 10 minutos para remover a acetona e coletar o precipitado. Para purificar o HEMA poli-hidroxy sintetizado, dissolva o precipitado coletado em dois mililitros de água pura. Em seguida, misture-o com 100 mililitros de acetona pré-identificada em uma proporção de um a 50.
Centrifugar a solução a 8.200 vezes g por 10 minutos para coletar o precipitado. Repita este processo de purificação de dissolver, misturar e centrifugar o precipitado três vezes. Primeiro, dissolver 0,96 gramas de APMA e 0,93 gramas do purificado poly bis-hidroxy HEMA em cinco mililitros de água destilada em um béquer de 10 mililitros.
Dissolva 0,01 gramas de ACVA em 0,5 mililitros de 1, 4 dioxano, e adicione isso à solução APMA e poly bis-hidroxy HEMA. Transfira essa mistura para uma garrafa de polimerização e ventile com nitrogênio seco por uma hora. Em seguida, coloque a garrafa de polimerização em um banho de óleo a 70 graus Celsius, e deixe-a reagir por 24 horas sob a atmosfera de nitrogênio.
No dia seguinte, esfrie a garrafa de polimerização a zero graus Celsius e abra a rolha de borracha para terminar a solução do processo de polimerização. Para começar, as células de sementes MCF-7 nos poços de uma placa de seis poços a uma densidade de 20.000 células por poço. Cultue as células em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por 12 horas.
Depois disso, substitua o meio de cultura por meio de cultura fresca contendo polímeros cônicos e poliplex pDNA de diferentes proporções de relações nitrogênio-fósforo. Cultue as células por seis horas e, em seguida, substitua o meio por dois mililitros de meio RPMI 1640 fresco. Continue a culminar por 48 horas.
Em seguida, colete as células e use um citômetro de fluxo para detectar a fluorescência verde. Neste estudo, copolímeros de blocos biocompatíveis biocompatíveis de methionina são preparados através do método reversível de transferência da cadeia de adição e fragmentação, e a capacidade de complexo de DNA plasmídeo do mBG obtido e sua eficiência de transfecção são investigadas. O tamanho médio das partículas e o potencial zeta dos poliplexes mBG/pDNA são de 124 nanômetros e mais 15,7 milivolts, respectivamente, em uma relação N-para-P de 16.
O retardo eletroforético revela que pDNA com uma relação N-para-P de zero pode mover-se sem contenção no gel de agarose e é observado como uma listra no imager gel. Quando o pDNA é complexo com mBG, o movimento do pDNA é retardado e, posteriormente, o brilho da banda é reduzido. Isso mostra que o mBG pode complexo completamente o pDNA quando o N a P é maior que quatro.
A citotoxicidade dos poliplexes mBG/pDNA é então medida usando o ensaio padrão MTT Estes resultados mostram que os poliplexes mBG/pDNA têm citotoxicidade superior aos poliplexes PEI/pDNA nas proporções N-to-P de quatro, oito, 16 e 32. Como também pode ser visto, a citotoxicidade dos poliplexes mBG/pDNA aumenta com o aumento da relação N-para-P. Este aumento da citotoxicidade é resultado do componente GPMA carregado positivamente.
A razão N-para-P utilizada no experimento de transfecção pDNA é selecionada de acordo com os resultados da citotoxicidade. As habilidades de transfecção de mBG1, mBG2 e mBG3 são comparadas medindo a intensidade de fluorescência GFP, e os resultados mostraram que o mBG3 é o portador do gene ideal. É importante esgotar o ar do frasco de fundo redondo e manter a temperatura de reação.
Os portadores de medicamentos polímeros obtidos podem ser aplicados à co-entrega de medicamentos quimioterápicos e medicamentos genéticos para tratar sinergicamente câncer resistente a medicamentos. O mecanismo molecular de combinação de drogas genéticas e quimioterapia pode ser ainda mais explorado para o tratamento de tumores resistentes a medicamentos. A acetona é classificada como baixa tóxica por sua toxicidade aguda.
As chaves, a inalação ou o contato com os olhos ou a pele devem ser evitados. Evite o risco de queimaduras durante o procedimento de aquecimento.
