Kationische Polymer-Wirkstoffträger haben die Vorteile einer guten Stabilität, geringen Immunogenität und einer einfachen Vorbereitung und Modifikation. Hier bieten wir eine schnelle und einfache Methode für seine Synthese. Reversible Addition-Fragmentierungs-Verkettungspolymerisationsmethode ist ein Verfahren, das zur Ausbeute von Blockpolymeren mit kontrolliertem Molekulargewicht und Struktur und tragender funktioneller Gruppen geeignet ist.
Diese Arzneimittelträger können gleichzeitig verschiedene Medikamente tragen, um die Zusammenarbeit Behandlung von Krebs, Entzündungen und anderen Krankheiten zu erreichen. Die IFT-Polymerisation ist eine klassische Methode, und dieses Protokoll gibt ein Beispiel für seine Anwendung in der Gentherapie. Der Schlüssel zum Erfolg für die Synthese dieses Polymers ist die präzise Steuerung der Reaktionstemperatur.
Es ist ratsamer, ein Ölbad als ein Wasserbad zu verwenden. Um dieses Verfahren zu beginnen, erhalten Sie einen rund-Boden-Kolben mit einem Gummistopfen und einem Magnetischen Rührer, der als Polymerisationsflasche verwendet werden soll. 1,87 Gramm Bis-Hydroxy-HEMA in einem Milliliter destilliertem Wasser in der Polymerisationsflasche auflösen.
In einem Fünf-Milliliter-Becher 0,03 Gramm CTP und 0,02 Gramm ACVA in 0,5 Milliliter 1, 4-Dioxan auflösen. Fügen Sie diese Mischung in die Polymerisationsflasche. Verwenden Sie dann eine Kondensatfalle, um die Lösung in der Polymerisationsflasche einzufrieren.
Befestigen Sie die Flasche an der Eisenstütze, und verwenden Sie einen mit einer Nadel ausgelösten Schlauch, um Stickstoff in das Reaktionsgemisch zu saugen und zu injizieren. Versiegeln Sie dann die Polymerisationsflasche und tauen Sie die Lösung 30 Minuten lang bei Raumtemperatur auf. Wiederholen Sie diesen Freeze-Pump-Tau-Zyklus dreimal.
Danach die Flasche bei 70 Grad Celsius in ein Ölbad geben und die Lösung 24 Stunden unter der Stickstoffatmosphäre reagieren lassen. Am nächsten Tag die Polymerisationsflasche bei null Grad Celsius abkühlen und den Gummistopfen öffnen, um die Polymerisationsreaktion zu beenden. Als nächstes präcooles Aceton im Kühlschrank bei minus 20 Grad Celsius für zwei Stunden und mischen Sie es mit der Reaktionslösung in der Polymerisationsflasche im Verhältnis 50 zu eins.
Zentrifugieren Sie diese Mischung bei 8, 200 mal g für 10 Minuten, um das Aceton zu entfernen und den Niederschlag zu sammeln. Um das synthetisierte Poly-Bis-Hydroxy-HEMA zu reinigen, lösen Sie den gesammelten Niederschlag in zwei Milliliter reinem Wasser auf. Dann mischen Sie es mit 100 Milliliter vorgekühltem Aceton im Verhältnis eins zu 50.
Zentrifugieren Sie die Lösung bei 8, 200 mal g für 10 Minuten, um den Niederschlag zu sammeln. Wiederholen Sie diesen Reinigungsprozess des Lösens, Mischens und Zentrifugierens des Niederschlags dreimal. Lösen Sie zunächst 0,96 Gramm APMA und 0,93 Gramm des gereinigten Poly-Bis-Hydroxy-HEMA in fünf Milliliter destilliertem Wasser in einem 10-Milliliter-Becher.
0,01 Gramm ACVA in 0,5 Millilitern 1, 4-Dioxan auflösen und der APMA- und Poly-Bis-Hydroxy-HEMA-Lösung hinzufügen. Diese Mischung in eine Polymerisationsflasche geben und eine Stunde lang mit trockenem Stickstoff belüften. Dann die Polymerisationsflasche bei 70 Grad Celsius in ein Ölbad geben und 24 Stunden unter der Stickstoffatmosphäre reagieren lassen.
Am nächsten Tag die Polymerisationsflasche bei null Grad Celsius abkühlen und den Gummistopfen öffnen, um die Polymerisationslösung zu beenden. Zunächst säen SIE MCF-7-Zellen in die Brunnen einer Sechs-Brunnen-Platte mit einer Dichte von 20.000 Zellen pro Brunnen. Kultur die Zellen in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid für 12 Stunden.
Ersetzen Sie danach das Kulturmedium durch das frische Kulturmedium, das kationisches Polymer und pDNA-Polyplex-Polyplexe mit unterschiedlichem Verhältnis von Stickstoff-Phosphor-Verhältnissen enthält. Kultur die Zellen für sechs Stunden, und dann ersetzen Sie das Medium mit zwei Milliliter frische RPMI 1640 Medium. Fahren Sie mit der Kultivierung für 48 Stunden fort.
Sammeln Sie dann die Zellen, und verwenden Sie ein Durchflusszytometer, um die grüne Fluoreszenz zu erkennen. In dieser Studie werden Methionin-funktionalisierte biokompatible Blockcopolymere über die reversible Additions-Fragmentierungs-Kettenübertragungsmethode hergestellt und die Plasmid-DNA-Komplexierungsfähigkeit des erhaltenen mBG und ihre Transfektionseffizienz untersucht. Die durchschnittliche Partikelgröße und das Zeta-Potenzial von mBG/pDNA-Polyplexen betragen 124 Nanometer bzw. plus 15,7 Millivolt bei einem N-Zu-P-Verhältnis von 16.
Die elektrophoretische Retardierung zeigt, dass sich pDNA mit einem N-zu-P-Verhältnis von Null im Agarose-Gel ohne Einschränkungen bewegen kann und als Streifen im Gelbildr beobachtet wird. Wenn pDNA mit mBG komplexiert wird, wird die Bewegung von pDNA verzögert, und in der Folge wird die Helligkeit des Bandes reduziert. Dies zeigt, dass mBG die pDNA vollständig komplexisieren kann, wenn n bis P höher als vier ist.
Die Zytotoxizität der mBG/pDNA-Polyplexe wird dann mit dem Standard-MTT-Assay gemessen Diese Ergebnisse zeigen, dass mBG/pDNA-Polyplexe eine Zytotoxizität haben als PEI/pDNA-Polyplexe bei den N-zu-P-Verhältnissen von vier, acht, 16 und 32. Wie auch zu sehen ist, steigt die Zytotoxizität der mBG/pDNA-Polyplexe mit einem erhöhten N-zu-P-Verhältnis. Diese erhöhte Zytotoxizität ist ein Ergebnis der positiv geladenen GPMA-Komponente.
Das im pDNA-Transfektionsexperiment verwendete N-zu-P-Verhältnis wird entsprechend den Zytotoxizitätsergebnissen ausgewählt. Die Transfektionsfähigkeiten von mBG1, mBG2 und mBG3 werden durch Messung der GFP-Fluoreszenzintensität verglichen, und die Ergebnisse zeigten, dass mBG3 der optimale Genträger ist. Es ist wichtig, Luft aus dem Schlick-Rundbodenkolben abzuschöpfen und die Reaktionstemperatur aufrechtzuerhalten.
Die erhaltenen Polymer-Wirkstoffträger können auf die gleichzeitige Abgabe von Chemotherapie-Medikamenten und Genmedikamenten angewendet werden, um medikamentenresistenten Krebs synergistisch zu behandeln. Der molekulare Mechanismus der Kombination von Genmedikamenten und Chemotherapeutika kann für die Behandlung von medikamentenresistenten Tumoren weiter erforscht werden. Aceton wird wegen seiner akuten Toxizität als niedrig toxisch eingestuft.
Schlüssel, Einatmen oder Kontakt mit Augen oder Haut sollten vermieden werden. Vermeiden Sie das Risiko von Verbrühungen während des Heizvorgangs.
