Este método ajuda a responder se a lesão cerebral traumática resulta em lesão vascular cerebral e se o escopo dos efeitos se estende a uma resposta vascular miogênica prejudicada. A preparação arterial pressurizada isolada nos permite separar os efeitos diretos da exposição de explosão nas artérias cerebrais dos efeitos indiretos causados pela exposição à explosão ao cérebro. Preparações arteriais isoladas e pressurizadas podem ser usadas para estudar a função vascular em uma variedade de doenças ou condições, incluindo derrame, hipertensão e, em seguida, diabetes.
O objetivo de nossos estudos é identificar as terapias que mantêm a capacidade da circulação cerebral de proteger o cérebro dos efeitos deletérios da hemorragia. Demonstrando os procedimentos de hoje estarão Maggie Parsley, diretora assistente do nosso laboratório e Yaping Zeng, nossa técnica de pesquisa chefe. Para preparar o simulador avançado de explosão, ou ABS, use um pedaço de fita adesiva de 2,54 centímetros para fitar ao longo da borda superior de quatro folhas Mylar pré-cortadas empilhadas.
Usando um segundo pedaço de fita, fixe a borda superior da membrana Mylar até o topo da câmara de expansão sobre o centro da abertura entre o motorista e as câmaras de expansão. Substitua as duas hastes de rosca na parte superior da câmara e aperte a mão de todas as porcas da tampa ao redor da câmara para fixar a câmara do motorista contra a membrana Mylar. Aperte o botão hidráulico da bomba manual e observe um limiar de pressão constante no medidor hidráulico para confirmar que a câmara do motorista permanece pressurizada sem vazamentos.
Em seguida, abra o arquivo de aquisição do gatilho que grava traços de pressão do dispositivo de explosão ABS no computador do dispositivo de explosão ABS. Para preparar o rato anestesiado para a lesão, use pinças longas para posicionar a língua ao lado e limpe ao longo do interior da garganta com uma ponta de cotonete encharcada de lidocaína antes de inserir suavemente uma camisa de estilo contendo um tubo endotraqueal na traqueia. Uma vez entubado, insira a extremidade da mangueira do ventilador na extremidade externa do tubo endotraqueal e observe e confirme que o rato está respirando de forma constante e sem dificuldade.
Em seguida, remova a bandeja de amostras ABS da câmara do espécime e aqueça a bandeja sob uma lâmpada de calor. Enquanto a bandeja está aquecendo, raspe a parte superior do couro cabeludo de cima dos olhos para entre as orelhas e use uma tesoura para cortar um plugue de espuma de tamanho padrão da base para a ponta arredondada em metades verticais idênticas. Em seguida, insira uma peça pela metade em cada ponta de ouvido, primeiro ao longo do canal auditivo, até que o contato seja feito com a membrana timpânica.
Removendo a mangueira do ventilador do tubo endotraqueal, deslize rapidamente, mas suavemente, o rato para a extremidade superior da bandeja do espécime, guiando cuidadosamente a cabeça através da abertura do suporte da cabeça e da coleira de borracha. Quando o rato estiver no lugar, reinsira a mangueira do ventilador de volta no tubo endotraqueal e verifique se a coleira de borracha está presa firmemente, mas não firmemente ao redor do pescoço, e que o rato está deitado em uma posição lateral propensa. Em seguida, bloqueie e fixe a bandeja da amostra ABS contendo o rato anestesiado na câmara de espécime ABS e belisque suavemente os dedos da pata traseira com pinças longas a cada três segundos até que uma resposta reflexo de retirada seja provocada.
Clique em Iniciar na página de aquisição aberta no computador do dispositivo de explosão ABS e pressione e segure o gatilho do dispositivo de explosão ABS na janela de aquisição até que a explosão se a exploda, rompendo a membrana Mylar e administrando a lesão de explosão ABS. Logo após a explosão detonar, inicie um segundo temporizador para acompanhar quanto tempo decorrido em minutos e segundos até que o próprio rato se ateie, pós-lesão, e coloque o rato na posição supina na almofada azul e aquecimento para avaliação da supressão do reflexo de classificação. Para extrair a artéria cerebral média, use uma lâmina de bisturi número 10 para fazer uma incisão vertical de 1,5 cm vertical de profundidade óssea do topo do couro cabeludo raspado até o condíle occipital e use pequenos rongeurs ósseos para abrir e separar a pele do couro cabeludo do osso do crânio.
Usando grandes rongeurs ósseos, corte e extraia a metade occipital, interparietal e inferior dos ossos frontais envolvendo o cérebro e use uma espátula cirúrgica para escavar cuidadosamente o cérebro do crânio uma vez que tenha sido libertado do osso circundante. Deposite o cérebro colhido em uma pequena placa de petri de vidro contendo solução de sal fisiológico resfriado, ou PSS, em um bloco de gelo sólido sob um microscópio dissecando, e remova cuidadosamente as artérias cerebrais médias esquerda e direita, ou MCAs, começando no círculo de Willis e continuando lateralmente e dorsalmente por aproximadamente quatro a cinco milímetros. Use micro fórceps para limpar suavemente os segmentos mca coletados e montar as artérias em uma arteriografa.
Cannula a extremidade proximal de cada segmento com um vidro, micropipette de 70 micrômetros de diâmetro e fixar as pipetas com suturas de nylon de 10-O. Perfunda suavemente a luminária com PSS para remover qualquer sangue residual e canonizar a extremidade distal de cada segmento com uma segunda micropipette sem esticar o tecido arterial. Proteja os micropipettos com um segundo conjunto de suturas de nylon de 10-O e coloque o arteriograma no palco de um microscópio invertido equipado com uma câmera e monitor.
Elevar as garrafas de reservatório conectadas aos micropipettos a uma altura adequada acima dos segmentos para equilibrar os segmentos mca a uma pressão de 50 milímetros de mercúrio por 60 minutos. Ao final do período de equilíbrio, coloque as garrafas em diferentes alturas entre si para examinar as respostas dilatórias do vaso, baixar as garrafas do reservatório para reduzir a pressão intravascular para 80 milímetros de mercúrio e permitir que os segmentos se equilibrem por 10 minutos. Em seguida, reduza a pressão intravascular para 60, 40 e 20 milímetros de mercúrio, permitindo que os segmentos se equilibrem após cada mudança de pressão.
Neste gráfico representativo, o diâmetro arterial é retratado no eixo Y como a mudança percentual do diâmetro a uma pressão de linha de base de 100 milímetros de mercúrio. No eixo X, são mostradas as diferentes pressões intravasculares nas quais as respostas dilatórias arterials foram testadas. Para o grupo de lesões falsas, os diâmetros da MCA aumentaram acima da linha de base e continuaram a dilatar normalmente à medida que a pressão intraluminal foi reduzida de 100 para 20 milímetros de mercúrio.
Em contraste, as respostas dilatórias da MCA à contínua redução imposta da pressão intravascular nos grupos de lesão cerebral induzidas por explosão de 30 e 60 minutos foram significativamente reduzidas em sua capacidade de dilatar após a exposição à explosão, indicando um comprometimento significativo das respostas vasodilatoras cerebrais à redução da pressão. As técnicas de extração, recuperação, montagem e profusão da embarcação são tremendamente complexas, e todo esforço de cuidado preciso deve ser tomado na realização desses procedimentos.
