Comunidades bacterianas intracelulares, ou IBCs, têm sido observadas em camundongos que receberam infecções experimentais do trato urinário, ou UTIs. Eles também foram vistos nos sedimentos de urina de pacientes humanos da UTI. A técnica que estamos descrevendo hoje é uma maneira de isolar ipcs únicos de camundongos infectados experimentalmente.
A técnica de micropipetagem bucal é a única técnica disponível atualmente para isolar bactérias intracelulares de bexigas de camundongos infectadas. Para preparar pipetas de boca de vidro, belisque firmemente ambas as extremidades de um tubo capilar de vidro e gire uniformemente o meio do tubo para frente e para trás ao longo de seu eixo sobre uma fonte de chama aberta. Quando o vidro ficar macio, remova o capilar da fonte de calor e retire imediatamente o vidro.
O comprimento final ideal do capilar puxado é de três a cinco centímetros a mais do que um capilar não pulsado para garantir um diâmetro interno apropriado para isolar células epiteliais de bexiga única. Quando o vidro tiver esfriado, verifique se o meio do capilar de vidro é mais estreito e se o interior do tubo ainda é oco. Pegando a grande extremidade do capilar puxado com uma mão, use fórceps para agarrar o capilar em seu ponto mais estreito, certificando-se de que os fórceps são empunhados com força suficiente para segurar o capilar firmemente sem esmagá-lo.
Torça rapidamente os fórceps para quebrar o capilar puxado no ponto mais estreito. Em seguida, coloque a capilaridade do tamanho de uma micropipette bucal em uma placa de Petri de 100 milímetros e UV esterilize a placa por 30 minutos. Para colher a bexiga, coloque um rato na posição supina e esterilize a área abdominal com 70% de etanol.
Usando fórceps esterilizados por etanol e tesoura cirúrgica, faça uma incisão inicial de pele transversal de um centímetro acima da abertura uretral e expanda a incisão diagonalmente em direção aos membros superiores do camundongo para criar um corte em forma de V ao longo de todo o anterior do mouse que expõe o conteúdo do peritônio. Usando novas ferramentas esterilizadas, empurre suavemente para baixo nas almofadas de gordura perto da região pélvica do mouse para fazer com que a bexiga se projete e agarre a bexiga exposta no ápice. Mantendo um aperto firme na bexiga, corte os ureteres e uretra para liberar a bexiga e insira a ponta de um eixo de fórceps arredondados na abertura da bexiga onde ela foi apenas incisada.
Solte os fórceps segurando o ápice e mantendo os fórceps arredondados quase completamente fechados, use um segundo par de fórceps para puxar suavemente a extremidade externa da boca da bexiga para longe dos fórceps arredondados e ao redor e sobre a outra ponta dos fórceps arredondados para virar a bexiga do avesso. Em seguida, use o segundo par de fórceps para persuadir suavemente a bexiga invertida da ponta dos fórceps em um mililitro de PBS frio. E raspe suavemente a camada interna da célula epitelial do lado de fora da bexiga invertida com dois pares de fórceps limpos.
Quando todas as células tiverem sido raspadas, insira a extremidade despovoada de um capilar de vidro puxado no plugue de borracha de um tubo aspirador e encaixe firmemente a extremidade estreita de uma ponta de pipeta de um mililitro na outra extremidade aberta do tubo. Encaixe firmemente a extremidade estreita de uma pipeta aspiradora de dois mililitros na extremidade aberta e mais larga da ponta de pipeta de um mililitro e coloque a suspensão da célula raspada sob um microscópio de dissecação. Usando uma ampliação de 20 a 40X, identifique os IBCs como grandes agregados fluorescentes e mergulhe a extremidade fina do capilar de vidro em um tubo fresco de PBS por um segundo para reduzir a absorção de volume indesejado através de ação capilar.
Quando um IBC de interesse foi localizado, lentamente traga a extremidade aberta do tubo capilar em direção ao IBC e aplique uma força de sucção muito pequena à pipeta aspirante para guiar o IBC para o capilar de vidro. Em seguida, mova o capilar para um tubo de centrífuga vazio de 1,5 mililitro e aplique uma leve pressão positiva para expulsar a gota e o IBC para o tubo. Além da confirmação da presença de um único IBC isolado no tubo de coleta através do microscópio dissecando, a pureza do IBC isolado pode ser confirmada por microscopia confocal.
As células isoladas devem manchar tanto para E.coli quanto para uroplakin e devem ter entre 50 e 120 micrômetros de tamanho. Após o isolamento, a presença e a viabilidade das células bacterianas no IBC individual podem ser confirmadas através da quantificação da unidade formadora de colônias ou reação quantitativa em cadeia de polimerase para equivalentes genômicos. Notavelmente, células epiteliais não infectadas isoladas com o mesmo protocolo não demonstram quantidades quantificáveis de bactérias.
Além disso, a análise quantitativa de reação em cadeia de transcriptação reversa confirma a presença de genes bacterianos em uma gama de IBCs isolados e agrupados individualmente. Certifique-se sempre de que uma micropipette bucal pode pegar e expulsar o líquido facilmente. Não hesite em mudar o capilar ou todo o aparelho se a micropipette bucal se sentir ocluída.
Esta técnica de micropipetagem bucal nos permite estudar direta e especificamente as populações intracelulares que se formam durante uma UTI experimental. Sem essa técnica, essas populações intracelulares seriam contaminadas e em menor número pelas bactérias extracelulares. Alguns outros agentes infecciosos podem ser mais facilmente aerossolizados ou transmitidos do que o E.coli que usamos nesta aplicação.
Nestes casos, alguns controles adicionais podem, portanto, ser garantidos, como adicionar um filtro ou estender a tubulação, dependendo da aplicação que está sendo usada. Os IBCs isolados usando esta técnica de micropipetting bucal podem então ser usados em outras análises de células únicas a jusante, como qRTPCR ou sequenciamento de RNA.
