O protocolo demonstra um método confiável e reprodutível para isolar e cultivar células endoteliais de alta pureza de camundongos que podem ter múltiplas aplicações. Esta técnica é um método mais simples que preserva o rendimento e a pureza das células endoteliais. Quem demonstrará o procedimento será Nina Nguyen, pesquisadora associada do meu laboratório.
Para começar, agite as contas magnéticas por alguns segundos. Pipetar 50 microlitros das contas em dois tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro para CD31 e CD102. Adicione um mililitro de tampão de lavagem de contas e misture bem.
Coloque os tubos num separador magnético e retire o sobrenadante com uma pipeta de vidro Pasteur. Ressuspenda as contas em 50 microlitros de tampão de lavagem de contas. Em seguida, adicione cinco microlitros ou 2,5 microgramas de anticorpos CD31 ou CD102 a cada 50 microlitros de contas.
Incubar a suspensão de contas com rotação suave em uma extremidade sobre o rotador final durante a noite a quatro graus Celsius ou por três horas à temperatura ambiente. Lave as imunoesferas quatro vezes e, em seguida, ressuspenda as esferas em 50 microlitros de tampão de lavagem de contas. No dia do isolamento, adicione 25 mililitros de HBSS a 25 miligramas de colagenase tipo um e incube-a com rotação suave.
Em seguida, filtre usando um filtro de 22 micrômetros. Após a eutanásia de um filhote de camundongo de cinco a sete dias, borrife a carcaça com etanol 70%. Em seguida, corte o diafragma superiormente para cima ao longo de toda a parede lateral do tórax para expor a cavidade torácica.
Injete cinco mililitros de DMEM frio no ventrículo direito do coração até que os pulmões fiquem brancos. Em seguida, corte os lóbulos distais aos brônquios correspondentes, um a um, para remover os pulmões. Puxe os lóbulos pulmonares em um tubo cônico de 50 mililitros pré-preenchido com 20 mililitros de meio basal gelado.
Agite suavemente o tubo à mão durante 10 a 15 segundos para lavar o excesso de glóbulos vermelhos. Retire os pulmões do meio com um filtro de células e pique com tesoura esterilizada. Transfira o tecido picado para o tubo cônico de 50 mililitros com 25 mililitros de solução de colagenase pré-aquecida.
Agite suavemente em um misturador rotativo. Conecte uma seringa de 20 mililitros a uma cânula romba de calibre 15 e triture a suspensão vigorosamente sem espumar de 10 a 15 vezes em uma suspensão celular. Filtre a suspensão através de um filtro de células de 70 micrômetros em um tubo cônico de 50 mililitros.
Em seguida, enxágue o tubo cônico usado para a digestão e o filtro celular com 15 mililitros de meio basal. Centrifugar a suspensão celular a 400 vezes G por oito minutos a quatro graus Celsius. Ressuspenda o pellet em dois mililitros de meio completo.
Adicione oito mililitros de meio completo e incube. No dia seguinte, lavar os frascos duas vezes com 10 mililitros de HBSS sem cálcio e magnésio e adicionar 10 mililitros de meio completo. Uma vez que as células são 90 a 95% confluentes, elas estão prontas para o isolamento primário de imunopartículas.
Lavar duas vezes as células endoteliais aderentes com 10 mililitros de HBSS sem cálcio e magnésio. Adicionar dois mililitros de solução de descolamento celular sem tripsina e incubá-la para garantir o levantamento de todas as células do frasco. Adicione oito mililitros de meio basal.
Em seguida, gire as células a 400 vezes G por quatro minutos à temperatura ambiente e ressuspenda-as em dois mililitros do meio basal. Vortex anti-CD31 revestido contas por alguns segundos para ressuspender as contas. Adicione 30 microlitros de contas para cada dois mililitros de suspensão celular e prenda a tampa.
Incubar o tubo por 10 minutos à temperatura ambiente em uma extremidade sobre o rotador da extremidade. Em seguida, coloque os tubos em um separador magnético por dois minutos. Aspirar o sobrenadante e remover o tubo do ímã.
Ressuspenda o grânulo de células adicionando três mililitros de meio basal ao tubo e pipetando para cima e para baixo várias vezes. Substitua o tubo no separador magnético por dois minutos. Em seguida, aspirar cuidadosamente o sobrenadante usando uma pipeta de vidro Pasteur.
Após a lavagem final, quando o sobrenadante ficar claro, ressuspender o pellet de células de contas em três mililitros de meio de crescimento completo e transferi-lo para um frasco T75. Adicione sete mililitros do meio de crescimento completo e incube-o. No dia seguinte, volte a lavar as células com HBSS sem cálcio e magnésio.
Em seguida, adicione 10 mililitros de meio completo. Uma vez que as células são 90 a 95% confluentes, elas estão prontas para o isolamento secundário de imunopartículas. A primeira seleção de imunoesferas identifica as células CD31 positivas, que crescem em uma formação de paralelepípedos.
Uma segunda seleção de esferas imunográficas com esferas revestidas com anti-CD102 aumenta a pureza das células endoteliais e a classificação de células ativadas por fluorescência é usada para confirmar que a população celular é CD31 positiva e CD102 positiva. Para estudar as vias inflamatórias endoteliais e a função da barreira endotelial, o tratamento com Cytomix murino foi usado para induzir produção significativa de IL-6 pelas células endoteliais com um valor de P menor que 0,01. Além disso, a resistência transendotelial diminuiu, mostrando aumento da permeabilidade endotelial.
Células endoteliais isoladas podem ser usadas em estimulações de células endoteliais ou ensaios de função de barreira para descobrir alvos terapêuticos baseados no endotélio para distúrbios da disfunção endotelial.
