Este método pode ajudar a responder perguntas-chave no campo da Candida sobre a virulência da tensão e as contribuições de genes específicos para esses processos. As principais vantagens dessa técnica são que ela evita preocupações com o uso de animais, é robusta, rápida, barata e proporciona um alto número de animais por experimento. De um modo geral, indivíduos que são novos neste método provavelmente lutarão um pouco porque terão alguma dificuldade em avaliar a viabilidade dos vermes antes do início do experimento ou podem ter alguns problemas com a injeção inconsistente dos vermes.
Peça larvas de atacadistas e fornecedores que não introduzem hormônios, antibióticos ou outros tratamentos às larvas e que são capazes de enviar e entregar espécimes vivos. Quando as larvas chegarem, verifique cada recipiente para confirmar a saúde e viabilidade das larvas. Larvas saudáveis ficarão completamente submersas sob a cama, movendo-se e possuindo uma coloração amarela e bronzeada com poucas larvas contendo marcas pretas ou descolorações ao longo do corpo.
As larvas podem ser armazenadas em seus recipientes em um espaço ventilado à temperatura ambiente por até duas semanas. Para preparar as células de levedura para a infecção pela Galleria mellonella, cresça as cepas de C.albicans a serem injetadas durante a noite em três mililitros de caldo fresco de levedura-pepton-dextrose por cepa em tubos de cultura padrão em um tambor rotativo a velocidade média e 30 graus Celsius. Na manhã seguinte, recolham as células por centrifugação, e lavem a levedura três vezes em cinco mililitros de pbs fresco por centorifugação.
Após a última lavagem, resuspend as células em um mililitro de PBS fresco e transfira a levedura para um tubo de microcentrifuge. Diluir as células em PBS adicionais em 1-100, 1-1.000, e de uma a 100.000 concentrações, e contar as células das diluições de um a 100 e de um a 1.000. Ajuste as células para uma diluição de 2,5 vezes a sétima células por mililitro de concentração de PBS em um novo tubo de microcentrífuga, e confirme a precisão da dose infecciosa, emplacando o volume apropriado da diluição de um a 100.000 para alcançar 100 unidades formadoras de colônias em uma placa de ágar levedura-peptone-dextrose para cada cultura a ser usada na infecção.
Para infectar as larvas com as células Candida, primeiro espalhe uma pequena quantidade de lombriga de cera em uma placa de Petri estéril vazia de 100 por 15 centímetros por réplica biológica, e esterilize uma seringa de 10 microlitres equipada com uma agulha de 26 bitola três vezes com 10 microliters de 70% de etanol e três vezes com 10 microliters de PBS por lavagem. Em seguida, vórtice a diluição inoculação de C.albicans, e carregar 10 microliters de células para a seringa. Abra um recipiente de larvas G.mellonella, e use um dedo para virar cuidadosamente a cama para descobrir larvas, selecionando larvas amarelas e bronzeadas de tamanho semelhante que estão em boa saúde com a falta de pigmentação negra nos corpos, usando os dedos médios e indicadores e o polegar para pegar uma larva de maneira semelhante a agarrar um lápis.
Enrole a larva nas costas para que as pernas fiquem voltadas para cima, segurando toda a extensão do corpo entre os dedos e o polegar para que a larva seja incapaz de enrolar ou se afastar da injeção. Por outro lado, gire a seringa para que o chanfrado da agulha esteja voltado para cima, e insira lentamente todo o comprimento do bisel na junção com a perna esquerda mais traseira, garantindo que a agulha penetre o corpo e não empurre simplesmente o corpo da larva para dentro. O passo mais crítico neste procedimento é a injeção da enceguicultura de tal forma que os danos ao corpo larval são minimizados e o bolus completo é inoculado.
Em seguida, injete os 10 microliters completos de Candida inoculum, e extraia a agulha. Co-abrigar até 10 larvas injetadas da mesma cultura candida em cada placa de Petri de 100 por 15 milímetros após a inoculação, e incubar a larva a 37 graus Celsius por oito dias. Verifique os pratos a cada 24 horas para monitorar a morte.
A mortalidade pode ser inicialmente avaliada pela pigmentação escurecida, pela formação de manchas pretas ou corpos, e pela falta de movimento. Para confirmar a mortalidade, use pinças para rolar suavemente larvas moribundas em suas costas e cutucar levemente a parte inferior da larva com a pinça. Larvas que começam a se transformar em mariposas podem ser incluídas na análise, mas devem ser removidas se começarem a se fundar.
Não há diferença significativa na cinética da morte de G.mellonella entre larvas infectadas zero ou 10 dias após a chegada. Os sinais característicos da doença surgem em larvas de ambas as idades que sucumbem à infecção, começando pela descoloração que dá lugar a manchas negras antes de uma perda total de motilidade e eventualmente morte. A infecção por C.albicans acelera esse processo de descoloração e morbidade, mas não altera significativamente a cascata de marcadores fenotípicos que levam à morte em comparação com larvas não infectadas ou injetadas por PBS.
Notavelmente, a infecção de G.mellonella com homo-ou heterozygotes tipo acasalamento de qualquer uma das cepas c.albicans clinicamente isoladas testadas produz altas taxas de mortalidade em comparação com animais injetados por PBS, enquanto as injeções de cepas prototróficas derivadas atenuam o efeito letal neste modelo. É importante lembrar de escolher larvas saudáveis e ser gentil no manuseio das larvas. Se várias cepas serão inoculadas, tome cuidado para não deixar as células Candida sentarem-se na PBS por muito tempo.
Após esse procedimento, outros métodos como o perfil imunológico e a localização de Candida dentro das larvas podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre as interações entre o hospedeiro e o patógeno fúngico durante uma infecção. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para os pesquisadores explorarem a patógena candida usando formatos de alto rendimento. Não se esqueça que trabalhar com candida albicans requer cuidados e que as precauções padrão, incluindo o uso de equipamentos de proteção individual, devem ser sempre tomadas durante a realização deste procedimento.
